Активація компонентів системи гемостазу ссавців стрептокіназою in vitro

Було поставлено ряд дослідів для розробки методу визначення активності тканинного активатора плазміногена та аналізу коректності використання запропонованого методу в разі проведення тромболітичної терапії препаратом стрептокінази (Ск) при тромботичних ускладненнях (гострому інфаркті міокарда, тромбоемболіях) та при стрептококових інфекціях.

На першому етапі дослідження вивчалась зміна активності плазміноген-стрептокіназного комплексу за різних умов інкубації. Пг-Ск комплекс отримано, інкубуючи стрептокіназу в концентрації 10 МО/мл, 20 МО/мл, 30 МО/мл, 40 МО/мл в еквімолярному співвідношенні до плазміногена протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Активність Пг-Ск комплексу досліджували по швидкості гідролізу специфічного хромогенного субстрату S₂₂₅₁ за різних умов:

безпосередньо Пг-Ск комплекс;

Пг-Ск комплекс інкубований в донорській плазмі;

еуглобулінова фракція, отримана з донорської плазми інкубованої з додаванням Пг-Ск комплексу;

Пг-Ск комплекс інкубований з додаванням фібриногену (2 мг/мл);

еуглобулінова фракція, отримана з Пг-Ск комплексу інкубованого з фібриногеном (2мг/мл);

Отримані дані (рис.1.) свідчили, що максимальної активності плазміноген-стрептокіназний комплекс досягав за присутності фібриногену, проте необхідно зауважити, що додавання фібриногену (у фізіологічній концентрації) не змінювало активність комплексу, відносно контролю (Пг-Сг комплексу). Однак, в отриманій з цієї суміші еуглобуліновій фракції амідолітична активність майже не відмічалась. Це можна пояснити інактивацією Пг-Ск комплексу та утвореного плазміну низькими значеннями рН середовища в процесі отримання еуглобулінової фракції.

Інкубація плазміноген-стрептокіназного комплексу у плазмі донорів значно пригнічувала його активність, що, можливо, пов'язано з дією інгібіторів, які присутні в достатній концентрації в плазмі крові. В першу чергу це основний інгібітор плазміну - ₂-антиплазмін та інгібітор серинових протеїназ в плазмі крові - ₂-макроглобулін. Амідолітична активність плазміноген-стрептокіназного комплексу, інкубованого у плазмі донорів, становила близько 10 % порівняно з активністю контролю (Пг-Ск комплексу).

Еуглобулінова фракція, отримана з плазми донорів з доданим плазміноген-стрептокіназним комплексом, характеризувалась незначною амідолітичною активністю в порівнянні з контролем. При концентрації стрептокінази 40 МО/мл амідолітична активність еуглобулінової фракції становила близько 50% активності плазми, з якої була отримана, і майже на 95% була нижче активності контролю.

Отже, було зроблено припущення, що інгібітори плазміну в плазмі крові пригнічують активність Пг-Ск комплексу, а отримана з неї еуглобулінова фракція майже не володіє амідолітичною активністю, що може бути пов'язане з впливом низьких значень рН середовища при одержанні еуглобулінової фракції, на активність Пг-Ск комплексу та утвореного плазміну.

На наступному етапі досліджень вивчався вплив бромцианового фрагменту фібриногену (FCB-2) на амідолітичну активність плазміноген-стрептокіназного комплексу. В досліді визначалась амідолітична активність Пг-Ск комплексу (10 МО/мл, 25 МО/мл, 40 МО/мл) в присутності фрагменту фібриногену FCB-2 у концентрації 2мкМ, яка використовується в методі визначення активності ТАП. Як показали результати досліду, фрагмент фібриногену FCB-2 практично не впливає на амідолітичну активність Пг-Ск комплексу з низькими концентраціями стрептокінази 10 МО/мл та 25 МО/мл. Проте при збільшенні концентрації стрептокінази до 40 МО/мл спостерігалось незначне збільшення (?10 %) амідолітичної активності Пг-Ск комплексу в присутності FCB-2.

Можна зробити припущення, що внаслідок взаємодії плазміногена з фрагментом фібриногену FCB-2 (Аб 148-160) конформація плазміногена змінюється, що робить ділянки плазміногена та каталітичний домен, які взаємодіють із стрептокіназою більш доступними для останньої. Також необхідно враховувати, що при високих концентраціях стрептокінази лаг-період (період формування плазміноген-стрептокіназного комплексу) значно менший, ніж при низьких концентраціях, тому ефект дії фрагменту FCB-2 при високих концентраціях стрептокінази більш виражений. Проаналізувавши отримані дані ми можемо зробити висновок, що дана концентрація FCB-2 незначно впливає на активацію плазміногена стрептокіназою. Отримані дані можна пояснити тим, що стрептокіназа здатна активувати плазміноген без білкового ефектора, на відміну від фізіологічного активатора плазміногена - тканинного активатора. Проте, необхідно відмітити, що активація стрептокіназою у присутності ефектора дещо вища, особливо при високій концентрації стрептокінази.

На наступному етапі досліджень вивчалась активація плазміногена тканинним активатором у присутності комплексу плазміноген-стрептокіназа. Відомо, що FCB-2 стимулює активацію плазміногена тканинним активатором. У цьому процесі велике значення має послідовність фібриногену Аб 148-160, яка взаємодіє як з плазміногеном так і з тканинним активатором.

Отримані дані свідчать, що збільшення концентрації стрептокінази значно впливало на активацію плазміногена тканинним активатором: активація плазміногена за наявності стимулятора FCB-2 відбувалась повільніше, ніж за його відсутності. Можна зробити припущення, що пригнічуюча дія фрагменту FCB-2 відбувається за рахунок утворення потрійного комплексу: плазміногена, тканинного активатора плазміногена та фрагменту FCB-2 з наступною поступовою активацією плазміногена тканинним активатором.

Оскільки на плазміногені, що знаходиться в потрійному комплексі, каталітичний домен та ділянки взаємодії із стрептокіназою недоступні, то стрептокіназа зв'язується тільки з плазміногеном, що залишився у розчині, утворюючи Пг-Ск комплекс та активуючи плазміноген. Пригнічуючий ефект фрагменту FCB-2 спостерігався при високих концентраціях стрептокінази і низьких концентраціях тканинного активатора плазміногена, коли основний активуючий ефект вносила стрептокіназа.

Таким чином, наведені дані свідчать, що зростання концентрації стрептокінази у плазмі крові може призвести до похибки у результатах тесту визначення активності ТАП. У зв'язку з цим, при визначенні активності тканинного активатора плазміногена у еуглобуліновій фракції, плазму крові пацієнтів рекомендується розбавляти в 2-4 рази перед отриманням еуглобулінової фракції.

Враховуючи отримані дані, було визначено активність тканинного активатора плазміногена у плазмі донора, яка містила Пг-Ск комплекс (10, 25 МО/мл), проінкубований 10 хвилин при кімнатній температурі. Результати дослідження показали, що активність тканинного активатора плазміногена у плазмі донора становила 1,45 МО/мл, в той час як в тій же плазмі з 10 МО/мл Ск активність ТАП складала 1,5 МО/мл, а у плазмі з 25 МО/мл Ск - 1,45 МО/мл. Отримані дані свідчать, що присутність стрептокінази у плазмі крові (до 25 МО/мл) не впливає на результати визначення активності тканинного активатора плазміногена за вищеописаним методом.

В попередніх дослідженнях встановлено, що у ссавців існує видова специфічність активації плазміногена стрептокіназою. Проте відносно окремих видів ссавців інформація досить суперечлива: з одних джерел відомо, що плазміноген свиней, кролів, коней та биків не активується стрептокіназою, тоді як в інших джерелах вказано, що плазміноген кролів активується великими дозами стрептокінази. Оскільки на наступних етапах експерименту досліди проводились на модельних системах in vivo з використанням кролів та свиней, то необхідно було дослідити активацію плазміногена стрептокіназою у плазмі крові людини, кроля та свині. В дослідах плазміноген ссавців активували стрептокіназою у дозі 10 МО/мл, 20 МО/мл, 30 МО/мл, 50 МО/мл, 70 МО/мл. Як і передбачалось, найбільшу здатність до активації мав плазміноген людини. Плазміноген кроля активувався менш повільно і майже не активувався низькою концентрацією стрептокінази 10 МО/мл. Отримані дані показали, що швидкість активації плазміногена кроля майже в 50 разів нижча, ніж швидкість активації плазміногена людини. Плазміноген свині практично не активувався стрептокіназою за 5 годин, навіть при 10-кратному збільшенні концентрації. Видові відміни, можливо, зумовлені властивостями первинної послідовності В-ланцюга плазміну, що призводить до відмін в здатності утворювати комплекс Пг-Ск, стабільності утвореного комплексу та властивості комплексу активувати плазміноген.

Дослідження стану системи гемостазу у хворих на інфаркт міокарда показали, що після проведення тромболітичної терапії препаратами стрептокінази в плазмі крові накопичуються фібринопептиди А. Висловлювалось припущення, що це може бути результатом активації як системи зсідання крові шляхом активації протромбіну, так і системи фібринолізу. Старшим науковим співробітником відділу структури та функцій білка нашого інституту Т.М. Платоновою було показано, що протромбін людини активується стрептокіназою, а за присутності Е фрагменту фібриногену активуючий ефект значно зростає. В зв'язку з вищезазначеним в роботі досліджено активацію протромбіну ссавців (людини, кроля та свині) стрептокіназою (10 МО/мл, 20 МО/мл, 30 МО/мл, 50 МО/мл, 70 МО/мл). Як модельна система для дослідження процесу активації протромбіну була використана плазма крові, з якої було вилучено плазміноген методом афінної хроматографії з використанням лізин-сефарози. Отримані дані свідчили, що амідолітична активність в плазмах людини, кроля та свині під дією стрептокінази значно зростала (рис.2.). Умови досліду дозволили зробити припущення, що протромбін різних видів ссавців активується стрептокіназою. Здатність до активації протромбіну людини, кроля та свині дещо відрізняється, так швидкість активації протромбіну людини дещо вища ніж протромбіну кроля та свині майже в 1,2 рази. При додаванні інгібіторів тромбіну (гірудину та гепарину) амідолітична активність суміші пригнічується, що також свідчить про активацію стрептокіназою саме протромбіну.

Активація протромбіну ссавців стрептокіназою є важливим фактором, тому що цей процес може призводити до активації системи зсідання крові. Оскільки медичні препарати стрептокінази в дозі 1,5 млн. одиниць (рівень активності стрептокінази у руслі крові наприкінці введення становить 65 МО/мл) вводяться в організм при тромботичних ускладненнях., які можуть бути пов'язані з патологічною активацією системи зсідання крові, то цей факт є небезпечним і може розглядатися як один з механізмів повторного тромбоутворення при інфаркті міокарда та тромбоемболіях під час лікування стрептокіназою. В багатьох реакціях організму проявляються специфічні протеолітичні та гормоноподібні функції тромбіну. Тромбін здатен індукувати нейрогуморальні рефлекторні реакції, внаслідок яких відбувається секреція гепарину та тканинного активатора плазміногена у русло крові. Відомо, що тромбін безпосередньо взаємодіє з ендотеліальними клітинами, стимулюючи синтез тканинного активатора плазміногена. Отже, внаслідок активації протромбіну стрептокіназою утворюється тромбін, який навіть в надзвичайно низьких концентраціях (? 1нМ), завдяки своїй гормоноподібній дії, здатен активувати цілий ряд процесів в організмі, що можна розглядати як опосередкований механізм дії стрептокінази на серцево-судинну систему організму, а зокрема на клітини ендотелію.

Аналіз параметрів системи фібринолізу у хворих на гострий інфаркт міокарда

На наступному етапі досліджень проаналізовано стан системи фібринолізу у хворих на гострий інфаркт міокарда, яким проводилась тромболітична терапія стрептокіназою в поєднанні з введенням одного з наступних препаратів: гепарину, фраксипарину (препарат низькомолекулярного гепарину) або гірудину (компонент слинних залоз медичних п'явок), які вводять в організм пацієнтів з метою інгібування коагулянтної ланки системи гемостазу. Медичні препарати гепарину, фраксипарину та гірудину - це екзогенні інгібітори тромбіну. Вивчались головні параметри системи фібринолізу: загальна фібринолітична активність, активність інгібітора активаторів плазміногена І типу та активність тканинного активатора плазміногена, якому приділялась особлива увага.

Досліджувалась група з 69 пацієнтів різного віку та статі, в якій ми виділили 3 підгрупи: в 1^ій підгрупі (31 пацієнт) лікування проводили гепарином, в 2^ій підгрупі - фраксипарином (27 пацієнтів), а в 3^ій підгрупі - гірудином (11 пацієнтів). Кров брали на наступних етапах лікування протягом місяця: при надходженні хворого до лікарні, через 2 години після проведення тромболітичної терапії стрептокіназою, на 3 добу (пік введення гепарину/фраксипарину/гірудину), на 7добу (1^ша доба після відміни введення гепарину/фраксипарину/гірудину) та на 30 добу лікування. Аналіз отриманих даних показав, що у пацієнтів, які поступили до лікарні с діагнозом “гострий інфаркт міокарда”, спостерігається значне пригнічення активності фібринолітичної системи (рис.3.А). Показник “загальної фібринолітичної активності” у пацієнтів значно подовжений і досягала в середньому 5,5 годин, тоді як в нормі цей час становить 2 години. У деяких індивідуальних випадках цей показник досягав 9, а інколи навіть 12 годин, що вказує на повну неспроможність фібринолітичної системи забезпечувати лізис фібринового згустку у руслі крові. Визначення „загальної фібринолітичної активності” є скринінг-тестом, який дає досить поверхневу інформацію про стан фібринолітичної системи і не дає повної інформації для розуміння причин пригнічення системи фібринолізу. Отже, для з'ясування причин виникнення дисбалансу системи фібринолізу, найбільш інформативними показниками є визначення активності ТАП та ПАІ-1. При надходженні пацієнтів активність ТАП була значно знижена і становила в середньому 0,87±0,09 МО/мл порівняно з нормою 2,05±0,5 МО/мл, проте спостерігались відхилення показника активності тканинного активатора плазміногена від вищенаведеного: при надходженні у деяких пацієнтів активність тканинного активатора плазміногена наближалась до норми (у 15% обстежених пацієнтів виявлено підвищений рівень активності ТАП близько 3,5±0,5МО/мл, який майже не змінювався протягом усього періоду лікування). Активність інгібітора активаторів плазміногена І типу при надходженні пацієнтів була значно підвищена 63±4,4 МО/мл порівняно із нормою (в середньому 15±7,5 МО/мл).

У деяких пацієнтів відмічалась надзвичайно висока активність ПАІ-1, яка досягала в деяких випадках 78 МО/мл на фоні значно зниженої активності тканинного активатора плазміногена до 0,29 МО/мл, що безперечно свідчить про майже повне пригнічення потенціалу системи фібринолізу. Варіювання показників активності ТАП і його інгібітора ПАІ-1 та загальної фібринолітичної активності при надходженні пацієнтів наведено на рис.3. Проведення тромболітичної терапії стрептокіназою призводило до значного підвищення активності тканинного активатора плазміногена 7,88±3,47 МО/мл через 2 години після введення стрептокінази на фоні зниження активності його інгібітора І типу до 38,9±6,5 МО/мл (рис. 3.В.).

На наступних етапах лікування активність тканинного активатора плазміногена підвищувалась, порівняно з даними при надходженні пацієнта, та наближається до норми, хоча у деяких пацієнтів відмічалась низька активність тканинного активатора протягом усього лікування. На 30 добу його активність досягала 2,21±0,38 МО/мл. Було проведено порівняльний аналіз даних 1 підгрупи пацієнтів, яких лікували препаратом гепарину, 2^ої підгрупи пацієнтів, лікування яких проводили аналогом гепарину - фраксипарином та 3^ої підгрупи, що лікували препаратом гірудину. Аналіз даних показав, що активність тканинного активатора плазміногена у групі, в якій проводили гепаринотерапію на 3 добу лікування підвищувалась на 24%, відносно показника активності при надходженні. На 7 добу лікування спостерігалось значне підвищення активності тканинного активатора плазміногена- на 184%. В той час як у другій підгрупі пацієнтів, яким вводили фраксипарин, спостерігалось незначне підвищення активності тканинного активатора плазміногена: на 3 добу цей показник підвищувався на 38%, а на 7 добу лікування на 53% відносно активності ТАП при надходженні. У третій підгрупі пацієнтів, яких лікували препаратами гірудину, взагалі не відмічається значного підвищення активності тканинного активатора плазміногена. На третю добу активність тканинного активатора плазміногена підвищувалась на 9 % відносно цього показника при надходженні пацієнтів. На 7 добу майже ніяких змін не спостерігалось. Отже, при введенні препарату гірудину не спостерігалось підвищення активності тканинного активатора плазміногена протягом лікування, на відміну від дії препаратів фраксипарину та гепарину. Проте при введенні препарату гепарину цей ефект був найбільш потужно виражений, порівняно із дією фраксипарину.

Відомо, що гепарин зв'язується і поглинається ендотеліальними клітинами, які в свою чергу, забезпечують синтез тканинного активатора плазміногена та його накопичення. Можна зробити припущення, що гепарин індукує певні синтетичні механізми у ендотеліальних клітинах або підсилює секрецію тканинного активатора плазміногена ендотеліальними клітинами. Отже, можливо, механізм дії гепарину на фібринолітичну систему може полягати в індукції синтезу тканинного активатора плазміногена та/або у його фізіологічному вивільнені з ендотеліальних клітин.

Отже, у пацієнтів з гострим інфарктом міокарда одною з можливих причин тромботичних ускладнень є дисбаланс у функціонуванні фібринолітичної системи, який повязаний зі зниженням активності тканинного активатора плазміногена на фоні підвищення активності його інгібітора. Введення стрептокінази спричиняє різке підвищення активності тканинного активатора плазміногена у декілька разів, що може свідчити про прямий або опосередкований вплив стрептокінази на ендотеліальні клітини.

Вплив стрептокінази на параметри системи гемостазу в модельних системах in vivo

Отримавши вищенаведені результати, на наступному етапі дослідження постала задача дослідити шляхи дії стрептокінази на компоненти системи гемостазу. Тому особливий інтерес представляло вивчення механізмів дії стрептокінази на систему гемостазу з використанням модельних систем in vivo. Було зроблено припущення, що можливі шляхи впливу стрептокінази полягають не тільки в дії Пм, але існують і шляхи, опосередковані дією продуктів деградації фібрину/фібриногену (які утворилися внаслідок дії Пм), тромбіну або безпосередньо дією стрептокінази. Особлива увага приділялась вивченню динаміки тканинного активатора плазміногена та його інгібітора ПАІ-1 у руслі крові. Для проведення експерименту у якості модельної системи in vivo було використано систему гемостазу кролів та свиней. Система гемостазу кролів була обрана з наступних міркувань: це зручна і доступна модель, плазміноген якої, активується стрептокіназою, отже можливо змоделювати процеси що відбуваються в організмі людини після введення препаратів стрептокінази. Проте, як свідчать дані, плазміноген людини активується стрептокіназою на порядок краще ніж плазміноген кроля. Тому досліджувані механізми дії стрептокінази, опосередковані дією плазміну, в організмі кроля можуть бути дещо слабше виражені.

У якості модельної системи також було обрано систему гемостазу свиней, в якій плазміноген не активується стрептокіназою і, таким чином, може бути виключений можливий вплив плазміну та продуктів деградації фібрину/фібриногену на ендотеліальні клітини судин. На модельних системах in vivo (кролі (n=7), свині (n=5)) досліджувався вплив стрептокінази на основні параметри системи гемостазу. В системі фібринолізу вивчали наступні параметри: активність плазміногена, б₂-антиплазміну, активність та концентрацію ТАП та ПАІ-1, склад еуглобулінової фракції аналізували методом ензим-електрофорезу. Стан системи зсідання крові оцінювали за наступними параметрами: концентрація фібриногену, розчинного фібрину, склад фракції продуктів деградації фібриногену/фібрину, що був охарактеризований методами диск-електрофорезу та вестерн-блотингу.

Препарат стрептокінази вводили у дозі відповідно до схеми лікування людей при захворюванні на гострий інфаркт міокарда у перерахунку на вагу тварин. плазміноген стрептокіназа гемостаз інфаркт тромболітична терапія

На першому етапі досліджень з використанням модельних систем in vivo вивчали вплив стрептокінази на систему гемостазу кролів. Результати досліджень показали, що через 1 годину після введення стрептокінази спостерігалося зниження вмісту нативного плазміногена на 30 % порівняно із нормою, що свідчить про його активне перетворення на плазмін. Цей факт корелює з літературними даними і свідчить про активацію плазміногена стрептокіназою та перетворення плазміногена на плазмін. На 1 та 3 добу відмічалося поступове підвищення концентрації плазміногена і нормалізація на 7 добу. При цьому необхідно відмітити, що активність головного інгібітора плазміногена - б₂-антиплазміну незначно знижувалась через 1 годину після введення Ск і коливалась в межах норми на наступних етапах лікування. Активність та концентрація тканинного активатора плазміногена значно підвищувалась через 1 годину після введення стрептокінази і досягала 2,54±0,3 МО/мл і 12±1,5 нг/мл, в той час як в контрольній групі цей параметр становив 0,7±0,1 МО/мл і 5±1,3 нг/мл (рис.4.). Підвищення активності тканинного активатора плазміногена майже в 3,5 рази пов'язано з підвищенням його концентрації, що можна пояснити секрецією його ендотеліальними клітинами, в яких він накопичується. Через 4 години цей показник складала 1,05±0,2 МО/мл та відповідно концентрація 8±1,3 нг/мл, а на наступних етапах наближається до норми.

Після введення стрептокінази активність інгібітора активаторів плазміногена - ПАІ-1 - знижувався до 6,5±2,7 МО/мл, тоді як в контрольній групі цей показник становить 12±5,3 МО/мл (рис.5.). Проте концентрація ПАІ-1 у вільній та у комплексній формі з тканинним активатором плазміногена або вітронектином після введення стрептокінази зростала і досягала 16,5±1,3 нг/мл тоді як до введення стрептокінази становить 8,4±2,3 нг/мл. Отримані дані можуть свідчити про активацію системи фібринолізу, пов'язану із зростанням концентрації тканинного активатора плазміногена у руслі крові, і, відповідно, посиленням інгібування фібринолітичної активності. Оскільки вміст функціонально активних молекул ПАІ-1 знижується на фоні зростання вмісту його комплексів, то можна зробити припущення, що відбувається активний процес інгібування підвищення вмісту активаторів плазміногена. Беручи до уваги те, що 90% ПАІ-1 накопичується в б гранулах тромбоцитів, то можна зробити припущення, що стрептокіназа, активуючи тромбоцити (згідно даним літератури), призводить до секреції ПАІ-1. Надалі активність інгібітора активаторів плазміногена І типу підвищувалась протягом дослідження та на 7 добу досягала 19,6±3,5 МО/мл, що пояснюється зниженням вмісту та активності тканинного активатора плазміногена.

Аналіз даних ензим-електрофореграм еуглобулінової фракції плазми крові кролів (рис.6.) показав наявність білкових компонентів, які мають фібринолітичну активність і відповідають зонам з молекулярною масою 92, 70 і 54 кДа. Наведені зони за молекулярною вагою та рухомістю у даних умовах відповідають плазміну, тканинному активатора плазміногена та двохланцюговій урокіназі відповідно. На електрофореграмі через 1 годину після введення СК помітно підвищення активності плазміну, тканинного активатора плазміногена та двохланцюгової урокінази відносно контрольної групи, а на наступних етапах активність цих білків знижується і наближається до норми.

Дослідження параметрів системи зсідання крові дозволило виявити дисбаланс в системі гемостазу, про що свідчить поява розчинного фібрину після введення стрептокінази, тоді як в нормі він відсутній. Розчинний фібрин це комплекси мономерного фібрину з фібриногеном або продуктами деградації фібрину/фібриногену. Накопичення розчинного фібрину свідчить не тільки про активацію системи зсідання крові, але й про порушення динамічної рівноваги між функціонуванням систем зсідання крові та фібринолізу. Концентрація розчинного фібрину досягала максимальних значень через 4 години після введення стрептокінази та складала 0,05±0,01 мг/мл, і поступово знижувалась на наступних етапах, що свідчить про відновлення нормального функціонування системи зсідання крові. Концентрація фібриногену зменшувалась через 1 годину після введення стрептокінази до 1,8±0,8 г/л порівняно із нормою 2,8±0,1 г/л, що є показником патологічної активації системи фібринолізу, яка розщеплює нативний фібриноген. Вміст фібриногену в плазмі крові - один з важливих показників, що характеризує стан системи гемостазу. Необхідно зауважити, що спостерігається зниження вмісту протромбіну на 30 % через 1 годину після введення стрептокінази на фоні активації системи зсідання крові, що є свідченням активації протромбіну. Для аналізу фракції розчинних фібрин-мономерних комплексів було розроблено метод одержання даної фракції з плазми крові ссавців. Електрофоретичний аналіз фракцій розчинних фібрин-мономерних комплексів плазми крові кролів показав наявність в їх складі білкових зон з молекулярною масою 200-300, 85-110 і 50-70 кДа. Аналіз цих фракцій (рис. 7.), проведений методом вестерн-блотингу з використанням антитіл до фібриногену та до фрагменту Е показав накопичення фібрину/фібриногену, фрагментів Х, Y, Д та Е різного ступеня розщеплення. Наведені дані свідчать про активацію системи фібринолізу після введення стрептокінази, внаслідок чого відмічається накопичення продуктів деградації фібрину/фібриногену. Спостерігається тенденція до підвищення вмісту фрагментів Е та Д на 7 добу після введення стрептокінази.

Отримані результати свідчать, що стрептокіназа безпосередньо або опосередковано впливає на ендотеліальні клітини та тромбоцити, внаслідок чого відбувається вивільнення ТАП та ПАІ-1. Опосередкований вплив стрептокінази може відбуватись через дію плазміну, продуктів деградації фібрину/фібриногену та тромбіну.

На наступному етапі нашого дослідження на модельних системах in vivo ми вивчали вплив Ск на систему гемостазу свиней.

Результати експериментів показали, що через 1 годину після введення стрептокінази, активації плазміногена не реєструвалось. Проте необхідно відзначити, що через 4 години спостерігалась тенденція до споживання плазміногена, що може свідчити про появу у кровотоці підвищеного вмісту активатора плазміногена. Активність б₂-антиплазміну незначно коливається. Активність та концентрація тканинного активатора плазміногена значно підвищувалась через 1 годину після введення стрептокінази і досягала 3,6±0,5 МО/мл, що майже в 4 рази більше норми (0,75±0,1 МО/мл). Концентрація ТАП досягала 16±1,5 нг/мл, тоді як цей показник в контрольній групі складав 6±0,9 нг/мл (рис. 8.).

Дослідження динаміки активності ПАІ-1 виявило, що через 1 та 4 години після введення стрептокінази цей показник значно знижував до 17±5,3 МО/мл та до 13,57±1,5 МО/мл відповідно, при нормі 41±7,5 МО/мл, а на наступних етапах нормалізується, що, можливо, пов'язано з функціонуванням механізмів взаєморегуляції компонентів системи фібринолізу. Спостерігалось значне підвищення вмісту ПАІ-1 у вільній та у комплексній формі з тканинним активатором плазміногена або вітронектином після введення стрептокінази і досягало 46,5±5,3 нг/мл, тоді як до введення стрептокінази вміст ПАІ-1 становив 28,7±2,3 нг/мл (рис.9.). Після введення стрептокінази відмічалося підвищення концентрації інгібітора активаторів плазміногена майже в 2 рази, що може бути компенсаторною відповіддю системи фібринолізу на підвищення активності та вмісту тканинного активатора плазміногена в руслі крові. Як уже згадувалось, що 90% ПАІ-1 накопичується у тромбоцитах, тому значне підвищення концентрації інгібітора активаторів плазміногена пов'язано з активацією тромбоцитів стрептокіназою, внаслідок чого спостерігається секреція ПАІ-1 з б гранул тромбоцитів. На фоні підвищення вмісту інгібітора активаторів плазміногена спостерігається зниження його активності, що свідчить про те, що ПАІ-1 знаходиться у неактивній комплексній формі з тканинним активатором плазміногена або вивільняється з тромбоцитів вже у неактивній формі, внаслідок їх нефізіологічної активації стрептокіназою.

Аналіз даних ензим-електрофорезу еуглобулінової фракції плазми крові свиней (рис.10.) показав наявність зон з молекулярними масами 92 і 70 кДа, які виявляють фібринолітичну активність. Активні зони відповідають плазміну та тканинному активатора плазміногена відповідно. На ензим-електрофореграмі через 1 годину після введення Ск зафіксовано підвищення активності тканинного активатора плазміногена відносно норми та зниження його активності на наступних етапах.

Аналіз параметрів системи зсідання крові свині показав, що після введення стрептокінази розчинний фібрин був відсутній у руслі крові, а концентрації фібриногену змінювалась у межах норми, що свідчить про нормальне функціонування системи коагуляції. Виявлено зниження рівня протромбіну у руслі крові, проте активації системи зсідання крові не спостерігається (рис.11).

Отже, на модельній системі, плазміноген якої не активується стрептокіназою, показано, що стрептокіназа здатна впливати на ендотеліальні клітини та тромбоцити без участі плазміну, викликаючи значне підвищення вмісту та активності тканинного активатора плазміногена та вмісту ПАІ-1. Внаслідок впливу стрептокінази на ендотеліальні клітини, можливо відбувається їх пошкодження, що узгоджується з припущенням даними літератури де висувається припущення, що стрептокіназа здатна спричиняти значні ендотеліальні пошкодження. Можна припустити, що в організмах ссавців, плазміноген яких активується стрептокіназою, відбувається комбінована дія стрептокінази (пряма та опосередкована) на систему гемостазу та судинно-тромбоцитарну ланку зокрема.

З'ясовано, що стрептокіназа впливає на механізми регуляції активності та взаємодії компонентів системи гемостазу. Виявлено вплив стрептокінази на динаміку білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногена та інгібітором активаторів плазміногена І типу. Вперше показано, що спостерігається значне вивільнення тканинного активатора плазміногена з ендотеліальних клітин внаслідок введення стрептокінази. Виявлено, що стрептокіназа через 1 годину після введення її у русло крові, здатна викликати значне підвищення секреції з б-гранул тромбоцитів інгібітора активаторів плазміногена І типу на фоні зниження його активності.

Висновки

Вплив стрептокінази на систему гемостазу полягає в утворенні плазміну, який є посередником її дії на компоненти системи гемостазу. Нами показано, що існують альтернативні шляхи впливу стрептокінази на активаційну ланку системи фібринолізу та на систему гемостазу в цілому.

Показано, що стрептокіназа здатна впливати на судинно-тромбоцитарну ланку системи гемостазу без участі плазміногена.

Виявлено, що стрептокіназа викликає значне вивільнення з ендотеліальних клітин тканинного активатора плазміногена у русло крові.

Показано, що стрептокіназа викликає значне підвищення секреції з б-гранул тромбоцитів інгібітора активаторів плазміногена І типу на фоні зниження його активності.

З'ясовано, що посередниками впливу стрептокінази на динаміку білок-білкових взаємодій між тканинним активатором плазміногена та його інгібітором І типу можуть бути плазмін, продукти деградації фібрину/фібриногену та тромбін.

Розроблено метод визначення активності тканинного активатора плазміногена під час проведення тромболітичної терапії при патологіях системи гемостазу.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ

Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Макогоненко Є.М. Визначенння активності тканинного активатора плазміногена у хворих на гострий інфаркт міокарда // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2002. - № 3. - с.87-92.

Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Вплив стрептокінази на параметри системи гемостазу в модельних системах in vivo // Українській біохімічний журнал . - 2004. - т. 76. №3 - С.56 - 61.

Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Фібринолітичний потенціал плазми крові // Медична хімія. - 2004. - №2. - С.30 - 34.

Краснобрижа Є.М., Савчук О.М., Волков Г.Л. Вплив стрептокінази та антикоагулянтних препаратів на стан системи фібринолізу у хворих на гострий інфаркт міокарда // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2004 - №2. - С. 86 - 91.

Пат. 51418А Україна, МПК 7С12N9/68. Спосіб діагностики стану системи фібринолізу: Пат. 51418А Україна, МПК 7С12N9/68. Савчук О.М., Краснобрижа Є.М.; Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. - № 2002032098; Заява 15. 03. 2002; Опубл. 15.11.2002, бюл. № 11. - 3 с.

Пат. 52215А Україна, МПК 7С12N9/68. Спосіб прогнозування тромботичних ускладнень при різних патологіях, що супроводжуються розвитком внутрішньо судинного зсідання крові: Пат. 52215А Україна, МПК 7С12N9/68. Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Чернишенко Т. М. Платонова Т.М.; Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. - № 2002032146; Заявл. 18. 03. 2002; Опубл. 16.12.2002, бюл.№ 12. - 3 с.

Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Мороз Є.Д., Волков Г.Л. Визначення фібринолітичного потенціалу плазми крові та його взаємозв'язок з системою зсідання крові // Міжнародний симпозіум „Гемостаз - проблемы и перспективы”. Київ: Міжвідомчий збірник „Гематологія і переливання крові”, 2002. - Випуск 31. - С. 99-104.

Савчук О.М., Краснобрижа Є.М., Чернишенко Т. М. Платонова Т.М., Іващенко Т.І., Деяк С.І., Волков Г.Л. Особливості порушення системи гемостазу при серцево-судинних захворюваннях // Міжнародний симпозіум „Гемостаз - проблемы и перспективы”. Київ: Міжвідомчий збірник „Гематологія і переливання крові”, 2002. - Випуск 31. - С. 94 -98.

Краснобрижая Е.Н., Савчук А.Н.., Волков Г.Л. Способ прогнозирования тромботических осложнений при развитии ДВС-синдрома // VIII Украинский биохимический съезд. - Черновцы, 2002. - Т. 74. - С. 149-150.

E. Krasnobryzha Influence of streptokinase on the hemostasis system parameters // XІХ International Symposium Thrombosis and Haemostasis. - Birmingham (England), 2003. - CD 087.

Краснобрижая Е.Н. Стрептокиназа - модулятор фибринолитического потенциала // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых. - м. Пущино (Россия), 2003. - С. 344 - 345.

Krasnobryzha I., Savchuk O. The t-PA and PAI-1 activities under treatment by thrombolytic and anticoagulant medicaments in patients with acute myocardial infarction // 18th International Congress on Thrombosis. - Ljubljana, Slovenia, 2004. - P. 100 - 101.

Размещено на Allbest.ru