Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ ТА КРІОМЕДИЦИНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ РІЗНИХ РЕЖИМІВ КРІОКОНСЕРВУВАННЯ НА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ВЛАСТИВОСТІ ЕМБРІОНАЛЬНИХ НЕРВОВИХ КЛІТИН IN VIVO ТА IN VITRO

Харків - 20031. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогодні трансплантація ембріональних і фетальних клітин із сугубо експериментального методу трансформувалася в новий напрямок медицини - клітинну і тканинну трансплантологію [Грищенко В.И. и др., 2000, 2001]. Трансплантація ембріональних нервових клітин (ЕНК) є одним з основних шляхів заміщення анатомічних або функціональних дефектів ЦНС [Цымбалюк В.И. и др., 1998, Александрова М.А., 2001, Hagell P. et al., 2001, Lindvall O. et al., 2001]. Однак клінічне використання ЕНК для лікування патологій нервової системи, що мають аутоімунний генез, зокрема, розсіяного склерозу (РС), у більшості випадків випереджає темп проведення робіт із вивчення механізмів дії такого роду терапії, з чим, очевидно, і пов'язана суперечливість одержуваних результатів [Миронов И.Н. и др., 1998, Аникин А.Ю. и др.,1998].

Перспективи клінічного використання ЕНК пов'язані з розробкою ефективних і надійних методів їхнього консервування. Одним з найбільш оптимальних шляхів збереження життєздатності ЕНК є низькотемпературне консервування. З цього випливає, що не менш важливим фактором успіху клінічної аплікації такого методу терапії є розшифровка механізму дії кріоконсервованого матеріалу. На певних етапах вирішення цих проблем не виключається можливість використання в експериментальних дослідженнях ЕНК лабораторних тварин. У цьому випадку адекватність такого підходу повинна бути обґрунтована як мінімум порівняльним аналізом морфологічного і субпопуляційного складу ембріонального мозку людини і тварин.

Дані про морфологічну і функціональну збереженість кріоконсервованих ЕНК є дуже суперечливими [Jensen S. et al., 1987, Frodl E.M. et al.,1994]. Причинами цього можуть бути як різний вихідний стан матеріалу перед кріоконсервуванням, так і зміна структурно-функціональної повноцінності ЕНК після розморожування. У свою чергу, ступінь зміни цієї характеристики визначається такими факторами, як спосіб приготування суспензії, склад середовища кріоконсервування, швидкість заморожування-відігрівання і т.і.

Структурно-функціональний потенціал кріоконсервованого матеріалу може бути оцінений за допомогою різних методів. Проте визнається, що найбільш об'єктивними можуть бути методи клітинного культивування in vitro [Silani V. et al., 1988] і трансплантація ЕНК in vivo [Александрова М.А. і ін., 1983]. Кожний з них, маючи свої переваги і недоліки, при комплексному використанні дозволяє всебічно оцінити стан донорського матеріалу.

Однією з прийнятних моделей оцінки функціонального статусу ЕНК до і після кріоконсервування є експериментальний алергійний енцефаломієліт (ЕАЕ) [Грищенко В.И. и др., 2002, Гольцев А.Н. и др., 2003]. Використання ЕАЕ, який є аналогом РС людини, дозволяє інтегрально оцінити терапевтичний ефект трансплантації ЕНК не тільки у відношенні ЦНС, але й інших систем забезпечення гомеостазу, зокрема імунної системи (ІС) організму.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану НДР ІПКіК НАНУ у відділі кріопатофізіології в рамках тем № 2.2.6.76 “Вивчення патофізіологічних основ застосування нативних і кріоконсервованих продуктів фетоплацентарного комплексу (ПФПК) у лікуванні аутоімунних захворювань” № держреєстрації 0202U000832 і теми № 2.2.6.6. “Вивчення механізмів корегуючої дії продуктів фетоплацентарного комплексу на лімфогемопоетичну систему в умовах розвитку аутоімунних захворювань при старінні”, № держреєстрації 0102U002023.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є вивчення характеру і ступеня впливу умов кріоконсервування на морфологічні і функціональні властивості ЕНК у системі in vivo та in vitro.

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

1. Провести порівняльний аналіз морфологічного і субпопуляційного складу ЕНК людини та щурів на різних стадіях ембріонального розвитку;

2. Підібрати оптимальний склад середовища для культивування нативних і кріоконсервованих ЕНК людини та щурів;

3. Провести експрес-методами порівняльний аналіз впливу різних режимів кріоконсервування на стан ЕНК щурів;

4. Оцінити характер розвитку нативних і кріоконсервованих ЕНК людини і щурів при культивуванні на різних субстратах (колаген, агаровий гель);

5. Відпрацювати лабораторно-діагностичні тести і вивчити зміну патоморфологічних, імунологічних і клінічних показників ЕАЕ до і після трансплантації нативних і кріоконсервованих ЕНК щурів.

Об'єкт дослідження. Вплив кріоконсервування на структурно-функціональні характеристики ЕНК в умовах культивування in vitro та після введення тваринам з модельною патологією.

Предмет дослідження. Нативні і кріоконсервовані ЕНК людини I триместру вагітності і щурів 7-14 діб гестації.

Методи дослідження. Світлова і фазово-контрастна мікроскопія для оцінки досліджуваного матеріалу, заморожування суспензії ЕНК, суспензійне культивування ЕНК на колагені й у двошаровому агаровому гелі, імунологічні і лабораторні методи оцінки стану лімфогематопоетичної системи експериментальних тварин, гістологічні для оцінки патоморфологічних змін спинного мозку, селезінки й тимуса щурів з ЕАЕ, спектрофотометричний для визначення концентрації гідроперекисів ліпідів і загальної антиоксидантної активності сироватки крові тварин.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше проведено комплексну оцінку впливу різних умов кріоконсервування на морфологічні та функціональні показники ЕНК у системі in vitro і in vivo. Розроблено програму заморожування з повільною швидкістю охолодження і проведенням температурної ініціації кристалоутворення, що забезпечує високий рівень морфологічної та функціональної повноцінності матеріалу.

Встановлено особливості і специфіку поведінки нативних і кріоконсервованих ЕНК (нЕНК і кЕНК) людини та щурів у системі in vitro при варіюванні умов культивування. Запропоновано модифікацію методу культивування ЕНК in vitro, що дозволяє пролонгувати термін їхнього виживання з проявом найбільш важливого потенціалу - мієлінізації тканини.

Уперше в порівняльному аспекті оцінений корегуючий ефект уведення нЕНК і кЕНК на клініко-неврологічний статус, імунологічні і біохімічні показники організму в моделі ЕАЕ. Встановлено залежність ефекту проведеного лікування від часу введення матеріалу, тобто від стадії розвитку імунозапального процесу. Відзначено можливість більш вираженої корекції ряду імунологічних показників при введенні кЕНК у порівнянні з нативними. Відпрацьовано і запропоновано як діагностично-прогностичний тест оцінки ступеня сенсибілізації організму до енцефалітогенних субстратів в умовах розвитку ЕАЕ з використанням культури нервової тканини. Сукупність використаних методологічних підходів і методів дозволила провести комплексну оцінку впливу кріоконсервування на структурно-функціональні властивості ЕНК in vitro й оцінити їхній терапевтичний потенціал у системі in vivo.

Практичне значення одержаних результатів. Установлення ролі окремих факторів кріоконсервування, таких як вид і концентрація кріопротектора, тривалість експозиції з ним перед заморожуванням, швидкість заморожування-відігрівання і величина переохолодження зразка у зміні структури і функції ЕНК може бути враховане при подальшому аналізі механізмів ушкодження й оптимізації методів захисту даного виду при кріоконсервуванні.

Практична значимість роботи полягає в забезпеченні біологічної повноцінності кріоконсервованих за розробленим методом ЕНК, що може бути обґрунтуванням їхнього подальшого клінічного використання. Подано патогенетичне обґрунтування можливості використання як нЕНК, так і кЕНК як методу лікування патології нервової системи - ЕАЕ з урахуванням схем уведення донорського матеріалу. Продемонстровано можливість використання культури ЕНК як тест-системи оцінки ступеня специфічної сенсибілізації імунокомпетентних клітин (ІКК) організму при ЕАЕ, а також ефективності проведеної терапії.

Особистий внесок дисертанта. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що відносяться до теми дисертаційної роботи, опубліковані у співавторстві з науковим керівником теми член-кор. НАНУ Гольцевим А.М. та іншими співробітниками відділу кріопатофізіології, відбивають результати щодо загального планування і проведення експериментів, узагальнення результатів і підготовки матеріалів до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені й обговорені на: II з'їзді нейрохірургів України, (Одеса, 1998 р.), конференції молодих учених ІПКіК НАНУ “Холод у біології і медицині” (Харків, 2002 р.), конференції молодих учених “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії -2002”, (Київ, 2002 р.), Восьмому Українському біохімічному з'їзді, (Чернівці, 2002 р.), III міжнародній конференції студентів і молодих учених “Медицина - здоров'я 21 століття”, (Дніпропетровськ, 2002 р.), міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”, (Харків, 2003 р.), науково-практичній конференції “Сучасні напрямки розвитку ендокринології (Другі Данилевські читання)”, (Харків, 2003 р.), міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми клітинної і тканинної трансплантології”, (Івано-Франківськ, 2003 р.).

Публікації. За темою дисертаційного дослідження опубліковано 14 робіт, з яких 5 - у спеціалізованих фахових виданнях, а також 1 патент на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 181 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень, заключення, висновків, переліку використаних джерел літератури (25 сторінок), що включає 229 першоджерел. Робота містить 10 таблиць і 62 рисунки, які разом займають 20 окремих сторінок.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

В експериментах були використані ЕНК людини I-го триместру вагітності (75 зразків від 25 донорів), отриманих в умовах клініки в результаті штучного переривання вагітності, і щурів 7-14 доби гестації (150 зразків від 50 тварин). Суспензію ЕНК одержували методом щадячої механічної дисоціації [Kawamoto J.C. et al.,1986].

На етапі попередньої підготовки ЕНК щурів до заморожування використовували гліцерин і ДМСО як кріопротектори в концентраціях 5%, 7% і 10% кожний. Еквілібрація з кріопротекторами проводилася при +4С протягом 10 і 20 хв. З метою оптимізації умов заморожування ЕНК були використані такі середовища кріоконсервування:

№1- сольовий розчин Хенкса з додаванням 5% ембріональної телячої сироватки (ЕТС)

№2- сольовий розчин Хенкса з додаванням 10% ЕТС

№3- сольовий розчин Хенкса з додаванням 10% ЕТС і глюкози (600 мг%)

Для порівняння впливу різних швидкостей заморожування були використані наступні режими кріоконсервування:

Режим 1- охолодження від кімнатної температури до -60С зі швидкістю 1 град/хв із наступним зануренням у рідкий азот [Silani V., 1988].

Режим 2- охолодження від кімнатної температури до -25С зі швидкістю 20 град/хв, витримка протягом 20 хвилин з наступним зануренням у рідкий азот [Грищенко В.И. и др., 1999].

Режим 3- охолодження від кімнатної температури до -5С зі швидкістю 1-1,5 град/хв, температурна ініціація з наступним охолодженням до -60С зі швидкістю 2 град/хв і занурення в рідкий азот [Гольцев А.Н. и др., 2003].

Кріоконсервування ЕНК здійснювали на програмному заморожувачі “Cryoson”, (Німеччина) у поліетиленових ампулах (“Nunc”), обсягом 1мл із додаванням відібраного на етапі еквілібрації кріопротектора (7% ДМСО). Відігрівання здійснювали на водяній бані при +37С протягом 45-50 сек. (до зникнення твердої фази), після чого суспензію відмивали від кріопротектора розчином Хенкса, що містить 20% ЕТС.

Варіювання складом середовища заморожування проводили при постійній повільній швидкості (режим 1), результатом чого був вибір для подальших досліджень розчину кріоконсервування №3, що потім використовувався в експериментах із відпрацьовування оптимальної швидкості заморожування ЕНК.

У суспензії ЕНК у всіх випадках до і після циклу заморожування-відігрівання визначали кількість ядерних, життєздатних клітин (за допомогою суправітального фарбування трипановим синім) та адгезивних серед них з використанням методу “преплейтинга” [Fischbach G.D., 1972].

В умовах in vitro у порівняльному аспекті проаналізовано вплив складу живильного середовища: I) DMEM (“Serva”) +10% ЕТС (“Sigma”), подвійний набір амінокислот, вітамінів; II) DMEM (“Serva”) +10% ЕТС (“Sigma”), подвійний набір амінокислот, вітамінів + глюкоза (600мг%) та інсулін В (Берлін-Хемі) 0,2 Од/мл) і типу субстрату (колаген, двошаровий агаровий гель) на тривалість культивування і повноту реалізації програми дендрогенеза нативних і кріоконсервованих ЕНК людини і щурів. Для оцінки стану ЕНК на етапах культивування використовували метод світлової і фазово-контрастної мікроскопії, суправітальне фарбування метиловим синім в модифікації Чубакова А.Р. і Саркісової Е.Ф., 1986, і фарбування мієлінових оболонок за методом Вейгерта [Меркулов Г.А., 1969].

Функціональний потенціал нЕНК і кЕНК оцінювали в системі in vivo за їхньою здатністю модифікувати клініко-неврологічний статус щурів з ЕАЕ. ЕАЕ (210 тварин) індукували введенням у подушечки 4-х лап енцефалітогенної емульсії гомологічного спинного мозку дорослої тварини в суміші з повним ад'ювантом Фрейнда за методом Давидової Г.С., 1969. Оцінку клінічного стану тварин проводили за п'ятибальною шкалою клінічних проявів [Жаботинский Ю.М., Йоффе В.И., 1975]: 0+ відсутність клінічних проявів, 1+знижений тонус хвоста, 2+ м'язова слабість або легкий параліч передніх кінцівок, 3+ тяжкий параліч задніх чи всіх чотирьох кінцівок, 4+ передсмертний стан, 5+ смерть. Контролем служили тварини з уведенням фізіологічного розчину.

Успіх реалізації нейротрофічної і цитокін-продукуючої активності ЕНК, як і інших представників ембріофетоплацентарного комплексу, може визначатися фазою розвитку імунозапальної реакції [Утешев Б.С. и др., 1995]. У зв'язку з цим, актуальною є оптимізація схем застосування подібного роду препаратів, тому нативні і кріоконсервовані ЕНК уводили інтраперитонеально на 7 і 14 добу розвитку ЕАЕ в дозі 5*10⁶ на 100 г маси тварини. Контролем була група тварин, яким уводили супернатант ЕНК (сЕНК) в аналогічній кількості і клітини дорослої печінки (КДП), виділені неферментативним методом. Для одержання сЕНК суспензія виділених ЕНК була розлита по аліквотах із розрахунку 9*10⁶ /мл на тварину вагою 180 г і потім зазнавала багаторазового заморожування-відтавання з метою її максимальної дезинтеграції. Далі суспензія була відцентрифугована при 3000g протягом 15 хв і надосад був потім використаний у подальших дослідженнях.

Моніторинг загального стану тварин з ЕАЕ до і після лікування проводили протягом 35 діб патології, імунний статус оцінювали на 7, 14, 21, 28 і 35 добу. Зокрема, аналізували стан моноцитарно-фагоцитарної системи (МФС): адгезивну [Вихоть Н.Е., 1989] і фагоцитарну активність перитонеального ексудата, визначаючи кількість фагоцитуючих клітин (фагоцитарне число - ФЧ) і середнє число поглинених мікробних тіл (фагоцитарний індекс - ФІ) [Лобасенко Н.П., 1979]; гуморальної ланки імунітету (визначення рівня циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) у сироватці крові [Стручков П.В. и др., 1985]); клітинної ланки імунітету (визначення субпопуляційного складу Т-клітин за допомогою ФІТЦ-мічених моноклональних антитіл (Caltag, США) до CD-4 і CD-8 структур [Шторх В., 1987] та імунорегуляторного індексу (ІРІ), що виражає відношення CD4⁺/CD8⁺, активність природних кілерів (ПК) спленоцитів щурів шляхом визначення індексу цитотоксичності (ІЦ) у тесті лізису еритроцитів курей спектрофотометричним методом визначення кількості гемоглобіну [Мельников О.Ф., 1999]). З інших показників стану лімфогемопоетичного комплексу оцінювали масу, кількість ядерних клітин тимуса та селезінки шляхом підрахунку в камері Горяєва за загальноприйнятою методикою.

Ступінь специфічної сенсибілізації ІКК до компонентів мієліну за умов розгорнутої клінічної картини (21 доба) ЕАЕ оцінювали в системі in vitro шляхом внесення лімфоцитів з регіональних лімфовузлів щурів у культуру ЕНК щурів (28 діб культивування) і визначення числа клітин, що не прікріпилися після 3, 18 і 24 годин інкубації.

Виразність біохімічних порушень на стадії доклінічних проявів ЕАЕ (7 доба) і в період початку клінічних проявів (14 доба) оцінювали за рівнем вмісту гідроперекисів ліпідів (ГПЛ) у гомогенатах мозку, печінки [Mihara M. et al., 1980] і сироватки тварин [Asakawa T, 1980], а також за антиокисною активністю (АОА) сироватки крові [Клебанов Г.И. и др., 1988]. З метою визначення характеру і динаміки демієлінізуючого процесу в головному і спинному мозку до і після лікування застосовувалися фарбування парафінових зрізів по Вейгерту і гематоксилін-еозіном за загальноприйнятою методикою.

Статистичну обробку результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера за допомогою пакета програм Excel.

Результати досліджень та їхнє обговорення

Аналіз морфологічного і субпопуляційного складу мозку ембріонів людини I триместру вагітності і щурів 7-14 доби гестації показав, що дані види з різною генетично детермінованою тривалістю життя мають подібну, але не ідентичну в тимчасовому діапазоні етапність формування елементів ЦНС в ембріогенезі. Так, на етапі виділення ЕНК людини і щурів виявилися дуже чуттєвими до впливу процедури дисоціації, і вихідна життєздатність ЕНК людини 10-11 тижнів гестації і 11 діб ембріонального розвитку щурів, оцінена методом суправітального фарбування трипановим синім, була аналогічною і не перевищувала 70%. Окрім того, саме в даному терміні ембріогенезу відзначено появу диференційованих нейробластів, що дають позитивне фарбування за Ніслем. На підставі отриманих даних відпрацьовування методу кріоконсервування проводилося з використанням ЕНК щурів 11 діб гестації.

З метою мінімізації негативного впливу переохолодження на біологічну повноцінність деконсервованих клітин був апробований метод температурної ініціації для пригнічення різкого стрибка температури зразка під час початку його кристалізації.

Збереженість ЕНК мала значну варіабельність. Так, при використанні режиму 1 і 2 життєздатність клітин не перевищувала 422,1% і 26,781,4%, відповідно, тоді як для режиму 3 - 72,866,1%, тобто саме режим 3, що передбачає максимально повне пригнічення переохолодження зразків перед початком їхньої кристалізації, забезпечував максимальну збереженість ЕНК. При використанні режиму 3 було найменшим також відхилення від величини контролю вмісту адгезивних клітин. Виражені зміни вмісту адгезивних клітин на фоні низької виживаності у суспензії, кріоконсервованій у режимі 1 і 2 можна пояснити перерозподілом клітинних субпопуляцій головного мозку, зокрема, гліальних і нейрональних [Silani V. et. al.,1988].

Дані про значні міжвидові розходження здатності до тривалого культивування і аксонального росту ЕНК людини і щурів [Mattson M.P. et al.,1991] обумовили необхідність порівняльного аналізу динаміки розвитку нативних і кріоконсервованих ЕНК цих видів за різних умов культивування. Відзначено, що тривалість культивування визначалася складом живильного середовища. Термін переживання нЕНК людини 10-11 тижнів гестації на середовищі I і колагені обмежувався строком у 14 діб, тоді як використання середовища II дозволило пролонгувати виживаність матеріалу до 21 доби з формуванням у частини клітин характерної для зрілого нейрону форми тіла і системи відростків. При культивуванні кЕНК на колагені відзначена затримка проходження клітинами основних стадій, характерних для нативної культури. На 21 добу практично були відсутні зрілі клітинні елементи, що, мабуть, пов'язано з репарацією клітинами нелетальних ушкоджень, що розвиваються після заморожування-відігрівання [Гольцев А.Н., 1988] .

Аналіз результатів культивування ЕНК щурів на колагені показав, що вони проходять ті ж стадії розвитку, що і ЕНК людини, однак здатні до більш тривалого виживання в умовах in vitro (до 28 доби) у порівнянні з ЕНК людини з формуванням різних морфологічних типів нейронів (пірамідальних, зірчастих) і розвинутої системи нейропілю. Відзначено затримку часу утворення першого відростка при культивуванні кЕНК щурів у порівнянні з нативними культурами. Крім того, особливістю культур кЕНК щурів була перевага астрогліальних елементів над нейрональними, що підтверджує дані, отримані при використанні методу “предплейтинга” при відпрацьовуванні режиму кріоконсервування.

Відзначені особливості проходження кЕНК людини основних етапів диференціювання нейронів можуть бути зв'язані як зі зміною їхнього метаболізму, так і кріоселекцією із суспензії тих, що обумовлюють подальший процес нейрогенезу. Для кЕНК була запропонована і відпрацьована культуральна система з напіврідкого агарового гелю з нижнім (фідерним) шаром, що містить гомогенат м'яких оболонок мозку ембріонів людини 12 тижнів гестації, що має нейритстимулюючу і мітогенну активність [Цимбалюк В.И., 2001]. Це дозволило пролонгувати термін культивування ЕНК до 35 діб з реалізацією програми дендрогенезу нейронів та їх мієлінізацією до 21 доби.

Очевидно, що досить коректно й об'єктивно провести порівняльну оцінку функціонального стану нЕНК і кЕНК можна в системі in vivo. Відпрацювання моделі ЕАЕ надає унікальну можливість оцінити інтегральну здатність цих клітин і реалізувати свій потенціал у плані корекції порушеної взаємодії фундальних систем забезпечення “бодігомеостазу” організму [Грищенко В.И., Гольцев А.Н., 2002].

При оцінці стану клітинної ланки імунітету експериментальних тварин з ЕАЕ встановлено, що протягом усього терміну спостереження (7-35 доба) мала місце виражена зміна вмісту регуляторних Т-лімфоцитів у порівнянні з контролем (Рис.2). Знижувався відносний вміст як Т-хелперів (CD4⁺), так і Т-супресорів (CD8⁺), однак зміна останніх була більш істотною, а максимум їхнього зниження приходився на 21-у добу. В результаті в цей термін ІРІ був максимальним, майже в 4 рази перевищував контрольний показник.

Інакше змінювалася ПК активність мононуклеарів селезінки: виражене зниження на 7-у добу розвитку ЕАЕ (Рис.3), різке її посилення до 14-ої доби з наступним зниженням ІЦ, який, однак, навіть на 35-у добу ЕАЕ залишався вірогідно вищим за контроль.

Оцінений у гуморальній ланці імунітету показник вмісту найбільш патогенних мілкодисперсних циркулюючих імунних комплексів (мЦІК) [Сура В.У, 1980] на 7 добу ЕАЕ був у 9,8 разів вище за контрольні значення. Накопичення мЦІК у цей термін збігалося зі збільшенням кількості моноцитів периферичної крові в 5,7 рази і зменшенням у 2 рази кількості клітин перитонеальної порожнини (ПП) в порівнянні з контролем.

Компенсаторний ріст кількості клітин ПП у період 14-21 діб ЕАЕ на тлі підвищеної до 21 доби концентрації мЦІК (у 7,4 рази від рівня контролю) однозначно свідчить про причетність елементів МФС до розвитку ЕАЕ. Зниження вмісту мЦІК у період 28-35 доби патології поряд з підвищенням загальної фагоцитарної активності ПП із цього часу може свідчити про елімінацію ЦІК завдяки спонтанній нормалізації діяльності МФС в цілому у тварин з ЕАЕ.

При сукупному аналізі приведених вище даних складається враження, що пік імунозапального процесу приходиться на 21 добу після індукції патології. Саме в цей термін була проведена оцінка ступеня сенсибілізації ІКК тварин (лімфоцитів регіональних лімфовузлів) до енцефалітогенного субстрату, що формується в культурі ЕНК на 21-28 добу. Після 3 годин контакту ЕНК із суспензією лімфоцитів тварин з ЕАЕ спостерігалася виразна агрегація останніх навколо гліальних елементів і нервових волокон, відсоток агрегуючих клітин склав 67% у порівнянні з 14% у контролі (Рис.5). Через 1 добу співкультивування поряд з агрегацією спостерігалися перші ознаки альтерації культури: фрагментарне здуття нервових волокон і набрякання окремих гліальних клітин, що свідчить про прояв ефекторної активності ІКК у відношенні імуногенних структур [Кадийски Д., и др., 2001].

Таким чином, очевидно, що при ЕАЕ спостерігається зміна профілю всіх ланок імунної сістеми: клітинного, гуморального і МФС. Суперечливість даних про порушення обміну ліпідів і продуктів їхнього перекисного окислювання (ПОЛ) при ЕАЕ [Хондкариан и др., 1987, Штибель В.Г., 2000] призвели до необхідності оцінки внеску біохімічних змін в індукцію імунозапального процесу.

При визначенні інтенсивності ПОЛ у гомогенатах печінки і мозку було відзначено, що у тварин з ЕАЕ активація процесів ПОЛ в гомогенатах печінки і мозку відбувається вже на стадії доклінічних проявів захворювання (7 доба) з достовірним зниженням кількості ГПЛ до 14-ої доби патології. Разом з тим, АОА сироватки крові і вміст у ній ГПЛ вірогідно підвищувалися на 14 добу розвитку захворювання в порівнянні з контрольними значеннями. На 21 добу розвитку ЕАЕ відзначена активація процесів ПОЛ зі збільшенням кількості ГПЛ у сироватці крові на 13%, у гомогенатах мозку на 11%. При цьому кількість ГПЛ у гомогенатах печінки знижувалася на 23%, АОА сироватки залишалася на рівні 14 доби ЕАЕ.

Перші клінічні ознаки ЕАЕ, що виражаються втратою маси тварин і наростанням явищ набряку лап у місцях уведення енцефалітогенної суміші, спостерігалися у щурів між 8 і 10 днем після індукції патології. Пік клінічних проявів, що виражається парезом задніх, рідше передніх кінцівок, був відзначений на 18-21 добу, тобто в період, близький до максимуму проявів імунозапального процесу.

Зміна клініко-неврологічного стану тварин з ЕАЕ підтверджена також даними гістологічних досліджень. Насамперед, до 21 доби патології на рівні попереково-крижових сегментів спинного мозку з'являлися осередки запалення, інфільтровані мононуклеарними клітинами, відзначалося руйнування мієлінової оболонки аксонів.

Проведена терапія у вигляді трансплантації ЕНК істотно модулює ступінь прояву обумовлених вище показників. Більш того, встановлено, що введення нЕНК і кЕНК на різних етапах розвитку імунозапального процесу (7 і 14 доба після індукції ЕАЕ) диференційовано впливає як на інтенсивність і тривалість захворювання, так і динаміку зміни оцінюваних показників.

При застосуванні кЕНК на 7 добу розвитку ЕАЕ концентрація CD4⁺ і CD8⁺- максимально наближалася до контрольних показників. У тварин цієї ж групи відзначена також стабільна нормалізація ІРІ як інтегрального показника субпопуляційного складу селезінки. При введенні кЕНК на 14-у добу концентрація Тх_, і Тс (CD4⁺ і CD8⁺, відповідно) нормалізувалася на 21 добу ЕАЕ, тобто швидше, ніж при введенні нЕНК, хоча ІРІ в обох випадках був приблизно однаковим (0,91 і 0,93). Крім того, у тварин, яким уводили кЕНК, відносний вміст обох субпопуляцій Т-клітин був на стабільному і близькому до контролю рівні до кінця терміну спостереження .

Активність ЕК при введенні ЕНК на 7 добу трохи знижувалася в порівнянні з тваринами з ЕАЕ поза залежністю від виду трансплантата (Рис.3). При цьому важливо, що характер зміни активності ЕК, особливо при введенні кЕНК, не корелював зі ступенем зміни клініко-неврологічного статусу щурів. Не виключено, що високий рівень активності ЕК на 21, 28 і 35 добу може відбивати адаптаційно-компенсаторні механізми ІС в умовах розвитку хронічного імунозапального процесу.

Разом з тим, виражене зниження цитолітичного потенціалу ЕК просліджувалося при введенні як нЕНК, так і кЕНК на 14 добу патології (Рис.3). Схоже, що активність цих клітин ко-підпорядкована функції Т-супресорів, концентрація яких значно вище при введенні ЕНК на 14 добу, ніж на 7-у добу. Гарним підтвердженням цьому є той факт, що при введенні сЕНК на 14 добу активність ЕК була максимальною на 35 добу, коли ІРІ значно перевищував контрольний рівень за рахунок переваги Т-хелперів.

Динаміка зміни кількості мЦІК після введення ЕНК на 7 добу патологічного процесу (Рис.4) мала хвилеподібний характер із різним ступенем відхилення від контрольного рівня. При введенні сЕНК на 14 добу патології нормалізації вмісту мЦІК не було відзначено, тоді як характер впливу кЕНК і нЕНК на їхній вміст був подібним, наближаючи цей показник до норми вже на 21-у добу і забезпечуючи його на рівні контролю до кінця терміну спостереження.

При введенні нЕНК та кЕНК на 7 добу ЕАЕ фагоцитарна активність ПП (за даними зміни ФІ) в період 14-35 доби патології змінювалась хвилеподібно, тоді ж така особливість зміни ФЧ була відзначена тільки при введенні кЕНК. Значення ФІ залишалися вірогідно вищими за контрольні значення до кінця терміну спостереження при введенні нЕНК на 14 добу, у той же час їх інтегральна фагоцитарна активність (ФІ, ФЧ) у реципієнтів кЕНК була протягом 3-х тижнів після початку лікування нижчою, ніж у реципієнтів нЕНК.

Підтвердженням розходжень прояву активності кЕНК у порівнянні з нативними були результати тесту визначення ступеня сенсибілізації ІКК щурів з ЕАЕ в умовах in vitro. Так, внесення суспензії лімфоцитів у культуру ЕНК показало їхню різну контактну агрегацію з енцефалітогенними структурами до і після введення ЕНК на різні терміни патологічного процесу (Рис.5). Відзначено тенденцію до нормалізації даного показника в групі з уведенням кЕНК як на 7, так і 14 добу ЕАЕ, тоді як при введенні нЕНК зміна досліджуваного показника мала виражену залежність від терміну введення трансплантату.

При аналізі гістологічних препаратів головного і спинного мозку клінічно видужалих щурів після введення як нЕНК, так і кЕНК, відзначені запальні зміни у вигляді помірної лімфо-моноцитарної інфільтрації зі збереженням великих осередків демієлінізації. Дослідження у віддалений термін після клінічного видужання (через 1,5-2 місяці) показали незначні запальні зміни у вигляді дифузійної проліферації усіх видів глії і мілкоосередкову демієлінізацію попереково-крижових відділів спинного мозку.

Використовуючи як інтегральний показник ефективності терапії ЕНК зміну клініко-неврологічного статусу тварин, необхідно відзначити успішність застосування обох видів ЕНК на 7 і 14 добу розвитку патологічного процесу. Проте, при введенні нЕНК на 7 добу ЕАЕ (доклінічна фаза розвитку) у деяких тварин відзначена агравація проявів захворювання через 3-4 доби після введення (Рис.6). Стан тварин даної групи характеризувався проявом симптоматики в 3,2-2,5 бали до 20 доби. Уведення сЕНК на 7 добу ЕАЕ призводило до погіршення клінічної картини до 3,5-4 балів і різкого виснаження практично усіх тварин у групі.

Динаміка зміни тяжкості клінічної картини ЕАЕ при застосуванні ЕНК на 14 добу патологічного процесу в цілому носила якісно інший характер (Рис.6). Вже через 3 доби після введення як кЕНК, так і нЕНК відзначено тенденцію до поліпшення загального стану щурів з ЕАЕ, а до 10-12 доби спостерігалося повне відновлення клініко-неврологічного статусу. Ступінь тяжкості захворювання при введенні суспензії КДП був близьким до стану тварин з ЕАЕ на відповідну добу патологічного процесу. Уведення сЕНК на 14 добу розвитку ЕАЕ, подібно введенню на 7 добу, призводило до значного і тривалого погіршення клінічної картини захворювання в порівнянні з групою з ЕАЕ, що є підтвердженням необхідності збереження морфофункціональних властивостей трансплантатів і, до деякої міри, дозозалежного ефекту терапії. Складається враження, що руйнування клітин призводить до звільнення як регуляторних цитокинів, які впливають на імунозапальний процес, так і енцефалітогенних субстратів, одномоментне введення яких провокує погіршення клінічного стану тварин.

Таким чином, представлені дані свідчать про те, що успіх проведеного лікування визначається не тільки видом лікувального матеріалу, але й особливостями попередніх змін у ІС реципієнта, на тлі яких проводиться терапія. Хоча 7 доба розвитку ЕАЕ характеризується відсутністю видимих клініко-неврологічних порушень у тварин, однак для даної стадії захворювання вже характерні зміни як імунологічних, так і біохімічних показників. Можна припустити, що в реалізації терапевтичного ефекту ЕНК належне місце займають механізми корекції стану МФС. Відомо, що ІЛ-1, який продукується клітинами МФС, активує субпопуляцію Т-хелперів [Нестерова И.В., 1999]. У такому випадку відзначена мінімізація функціонального стану МФС після трансплантації кЕНК в умовах розвитку ЕАЕ повинна супроводжуватися перевагою протилежної Т-хелперам субпопуляції Т-супресорів, що і знаходить підтвердження при оцінці ІРІ. Отже функціонально змінені ЕНК після кріоконсервування можуть продукувати інший, ніж нативні клітини профіль і кількість регуляторних цитокінів, і по-іншому відповідати на “запит ситуації” у плані необхідності корекції стану організму, зокрема, його ІС. Даний факт свідчить як про селективний вплив факторів кріоконсервування на ЕНК, і відповідно, спектр продукованих ними регуляторних медіаторів, так і про модифікацію антигенного спектра й імуногенних властивостей ЕНК після циклу заморожування-відігрівання, що відкриває нові можливості кріобіології в керуванні вихідними властивостями використовуваних тканинних біологічно активних субстанцій.

ВИСНОВКИ

Створення запасів кріоконсервованих ЕНК, які використовують для лікування нейродегенеративних і травматичних ушкоджень нервової системи, дотепер залишається актуальною проблемою. Не вирішеними є питання, що стосуються як оптимізації режиму кріоконсервування, так і відпрацьовування методів оцінки структурно-функціональної організації кріоконсервованого матеріалу. Вирішенню саме цих актуальних питань присвячена дана дисертаційна робота.

1. Розроблено режим заморожування ЕНК зі швидкістю 1 град/хв і проведенням температурної ініціації кристалоутворення, що в порівняльному аспекті з іншими режимами кріоконсервування (двохетапне заморожування з постійною швидкістю 1/хв і триетапна програма з температурною зупинкою при -25С) забезпечує найбільшу збереженість основних морфологічних і функціональних характеристик ЕНК у системі in vitro та in vivo.

2. ЕНК людини 10-11 тижнів гестації і щурів 11 діб розвитку мають подібний морфологічний і субпопуляційний склад, вихідний рівень збереженості після виділення і динаміку розвитку при культивуванні в умовах in vitro, що дозволяє використовувати ЕНК щурів зазначеного терміну гестації як модельну систему при подальшій оптимізації умов їхнього кріоконсервування.

3. Установлено факт наявності різного ступеня змін адгезивної здатності кріоконсервованих за різними режимами ЕНК у порівнянні з нативними, що може бути обґрунтуванням одержання матеріалу з різними властивостями для вирішення різних експериментальних задач.

4. Ефективність культивування кріоконсервованих ЕНК залежить як від складу живильного середовища, так і умов культивування. Уведення до складу середовища інсуліну (0,2 Ед/мол) і глюкози (600 мг%) забезпечує оптимальні умови росту ЕНК. Наявність фідерного шару сприяє пролонгуванню терміну їхнього культивування з реалізацією програми дендрогенезу і формуванням зрілих форм нейронів.

5. Клініко-неврологічний та імунологічний статус щурів з ЕАЕ при введенні кріоконсервованих ЕНК має особливості в порівнянні з його характеристиками при використанні нативних ЕНК. Уведення кріоконсервованих ЕНК на 7 і 14 добу індукції ЕАЕ за більшістю клініко-лабораторних показників призводило до більш вираженої інтегральної мінімізації патологічного процесу.

6. Відпрацьовано і запропоновано як діагностичну тест-систему оцінки ступеня сенсибілізації ІКК до енценфалітогенних структур до і після введення тваринам з ЕАЕ нативних і кріоконсервованих ЕНК з використанням культури ЕНК. Установлено, що введення кріоконсервованих ЕНК на 7 добу знижує число специфічно сенсибілізованих лімфоцитів на 58,1±2,3%, на 14 добу на 68,1 ±3,1% у порівнянні з групою тварин з ЕАЕ.

7. Різний характер і ступінь відповіді систем організму, прояву терапевтичного ефекту після введення в ті самі терміни, і в аналогічних дозах нативних і кріоконсервованих ЕНК тваринам з ЕАЕ свідчить про те, що кріоконсервування може виступати в ролі фактора спрямованої регуляції структурно-функціонального стану цього біооб'єкту.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Бабенко Н.Н., Вотякова И.А., Лобынцева Г.С. Особенности пролиферации и дифференцировки нативных и криоконсервированных эмбриональных нервных клеток человека. Сообщение 1. Клеточный состав мозга эмбрионов человека 5-13 недель гестации // Пробл. криобиологии.- 1998.- №1.- С. 35-40 (Дисертантом проведено фарбування та аналіз препаратів ЕНК людини різних строків гестації).

2. Бабенко Н.Н. Особенности пролиферации и дифференцировки нативных и криоконсервированных эмбриональных нервных клеток человека. Сообщение 2. Подбор оптимальных условий культивирования нативных клеток эмбрионального мозга человека // Пробл. криобиологии. - 1999. - №1.- С. 39-45. енк щур людина кріоконсервування культивування

3. Грищенко В.И., Гольцев А.Н., Бабенко Н.Н. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит как возможная модель изучения механизма действия продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса при лечении аутоиммунных заболеваний // Пробл. криобиологии. - 2002. - №2. - С. 34-43.

4. Гольцев А.Н., Гурина Т.М., Бабенко Н.Н., Останков М.В. Влияние различных режимов криоконсервирования на некоторые характеристики эмбриональных нервных клеток // Пробл. криобиологии.- 2003.- №1.-С.46-50. (Дисертантом відпрацьовано методику проведення повільного заморожування з проведенням температурної ініціації кристалоутворення).

5. Гольцев А.Н., Бабенко Н.Н. Обоснование возможности использования эмбриональных нервных клеток при лечении органоспецифических аутоиммунных заболеваний // Пробл. криобиологии.- 2003.- №2.- С.49-61. (Дисертантом проведено експерименти щодо впливу трансплантації нативних і кріоконсервованих ЕНК щурам з ЕАЕ на клініко-неврологічний і імунологічний статус реципієнтів).

6. Патент України 58192А, МПК 7 С12N5/08. Спосіб культивування ембріональної нервової тканини / Грищенко В.І., Гольцев А.М., Бабенко Н.М., Дубрава Т.Г.- Заявл. 24.10.2002; Опубл. 15.07.2003, Бюл. №7.-2 с.

7. Сипитый В.И., Чмут В.А., Егоркина О.В., Лобынцева Г.С., Вотякова И.А., Бабенко Н.Н. Реконструктивно-восстановительные операции при травматическом повреждении спинного мозга и его корешков // Бюл. укр. асоц. нейрохірургів.-1998.- №6.- с. 32-33.

8. Гольцев А.Н., Бабенко Н.Н. Органотипическое культивирование как метод оценки функциональной активности эмбриональной ткани мозга // Пробл. криобиологии. - 2002. - №1. - С.127-128

9. Гольцев А.Н., Овсянников С.Е., Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н., Рассоха И.В., Бондарович Н.А. Изучение характера взаимодействия между степенью развития аутоиммунных заболеваний и интенсивностью перекисного окисления липидов // Укр. біохім. журн.- 2002.- т.74.- № 4а (додаток 1).- С.123

10. Babenko N.N., Kozlova Ju.A., Goltsev A.N., Ovsyannikov S.E., Ostankova L.V. Possibility of correction of experimental allergic encephalomyelitis with embryofetoplacental complex products // Збірник тез III Міжнародної конференції студентів та молодих вчених “Медицина-здоровя-XXI сторіччя”.- Дніпропетровськ.- 2002.-С. 292

11. Козлова Ю.А., Бабенко Н.М., Гольцев А.М., Овсянніков С.Е. Вивчення корелятивного ваємозвязку між ступенем розвитку експериментального алергійного енцефаломієліту та інтенсивністю пероксидного окислення ліпідів // Укр. біохім. журнал.-2002.- т.74.- № 4.-С.156

12. Гольцев А.Н., Гурина Т.М., Бабенко Н.Н., Цогоєва Л.М. Возможность использования нативных и криоконсервированных эмбриональных нервных клеток (ЭНК) в качестве корректоров экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ) //Збірник тез Ш міжнародної науково-практичної конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”.- Харків.-2003.- С.251.

13. Гольцев А.Н., Рассоха И.В., Горская А.Ю., Бабенко Н.Н. Коррекция состояния центрального органа иммунитета - тимуса продуктами эмбриофетоплацентарного комплекса при аутоиммунных заболеваниях // Збірник тез науково-практичної конференції “Сучасні напрямки розвитку ендокринології (Другі Данілевські читання)”.- Харків.- 2003.- С.46.

14. Гольцев А.М., Бабенко Н.М., Останкова Л.В., Луценко О.Д. Застосування кріоконсервованих продуктів ембріофетоплацентарного комплексу (ПЕФПК) як коректорів аутоімунних захворювань на моделі експериментального алергійного енцефаломіеліта (ЕАЕ) // Трансплантологія.- 2003.- т.4.- №1.- С. 207-209

Размещено на Allbest.ru