Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВПЛИВ АНЕСТЕТИКІВ І ІНГІБІТОРІВ АНІОННОГО ТРАНСПОРТУ НА СТІЙКІСТЬ ЕРИТРОЦИТІВ ДО ЗМІН ТЕМПЕРАТУРНИХ І ОСМОТИЧНИХ ФАКТОРІВ СЕРЕДОВИЩА

Харків - 20071. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Зміна температури і осмолярності середовища є одними з важливих факторів, що викликають ушкодження клітин у процесі заморожування-відтавання. Згідно з накопиченими наразі даними, експозиція еритроцитів у гіпертонічних середовищах, що супроводжується зневоднюванням клітин, призводить до порушення бар'єрних властивостей мембрани, що, у свою чергу, може привести до лізису клітин [Bonangelino C.J., 2001, Iolasson A., 2003]. Крім цього, експозиція в гіпертонічних середовищах є фактором, що сенсибілізує еритроцити до наступного охолодження. Лізис клітин, що розвивається при охолодженні еритроцитів у гіпертонічному середовищі в області позитивних температур - гіпертонічний кріогемоліз, є одним з варіантів універсального феномена холодового шоку клітин. У свою чергу руйнування еритроцитів, попередньо інкубованих у гіпертонічних середовищах, які містять електроліти або неелектроліти, і за наступного перенесення клітин до ізотонічного розчину - постгіпертонічний лізис, показує роль змінювання осмотичних умов середовища у механізмі порушення структурної стабільності мембрани [Божок Г. А., 1996, Ніпот Е. Е., 1997, Олійник О. А., 2004,].

У процесі експозиції еритроцитів у гіпертонічному середовищі зневоднювання клітин призводить до зміни їх об'єму і форми, що, у свою чергу, викликає зміну просторової структури цитоскелета і асоціації його компонентів з мембраною. Порушення взаємодії білків з мембраною здатне призвести до часткового відкріплення цитоскелета від мембрани і до формування в мембрані потенційно нестабільних ділянок [Nigg E.A., 1980, Liu S.C., 1993]. Іншим фактором нестабільності мембрани є фазовий перерозподіл ліпідів, який виникає при охолодженні клітин. У цьому випадку формуються дефектні зони в граничних ділянках, що розділяють ліпідні домени у рідкокристалічному стані і у стані твердого гелю. Ці ділянки можна розглядати як області мембрани, у яких відбувається зародження і стабілізація трансмембранних дефектів, проникних для іонів, що є додатковим чинником сенсибілізації клітин до наступних змін умов середовища.

Механізм ушкодження клітин, який розвивається при зміні температури і осмолярності середовища, багато в чому залишається нез'ясованим. Це стосується, насамперед, змін, які розвиваються на початкових стадіях експозиції клітин в гіпертонічних розчинах, а також зміни температурної і осмотичної чутливості клітин під дією модифікаторів мембрани і цитоскелета. В якості агентів, здатних змінити чутливість клітин до температурного та осмотичного впливу, використовуються амфіфільні сполуки. Фенотіазіни, зокрема, хлорпромазін, істотно знижують рівень гемолізу еритроцитів як за умов гіпертонічного кріогемолізу, так і за умов гіпертонічного шоку. Це свідчить на користь висновку, що й інші схожі за фізико-хімічними властивостями сполуки здатні змінювати чутливість клітин до температурно-осмотичного впливу. До таких сполук варто віднести, насамперед, місцеві анестетики. Відомо, що місцеві анестетики здатні модифікувати як ліпідний бішар, так і білки мембрани. Здатність цих сполук змінювати плинність мембрани, а також температуру фазових переходів, які відбуваються в мембрані, може впливати на процеси ініціації, стабілізації та замикання трансмембранних дефектів. У свою чергу вплив анестетиків на білки мембрани може бути важливим чинником змінювання структурно-функціонального стану систем, які контролюють трансмембранний градієнт іонів (у першу чергу це стосується іонного транспортера - білка смуги 3).

Місцеві анестетики, наприклад, лідокаїн, а також похідні барбітурової кислоти (барбітал і фенобарбітал) широко використовуються в клінічній і експериментальній практиці. Відомий вплив цих сполук на ліпіди мембрани і їхня здатність змінювати форму еритроцитів. У меншій мірі вивчено вплив анестетиків на білки, що забезпечують транспорт іонів через мембрану еритроцитів, зокрема на функціональний стан білка смуги 3. Практично недослідженим є вплив місцевих анестетиків на чутливість клітин до осмотичного і температурного шоку.

У зв'язку з цим актуальним є вивчення впливу анестетиків на гіпертонічний кріогемоліз і постгіпертоничний лізис, а також дослідження зв'язку між температурною і осмотичною чутливістю клітин і функціональним станом аніонного транспортера.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у Харківському національному університеті на кафедрі фізіології людини і тварин за темою № 22-16-03 (№ держреєстрації 0100U003268) “Закономірності фізіолого-біохімічної й структурної адаптації біологічних систем до несприятливих факторів середовища в онтогенезі” і відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріофізіології клітини ІПКіК НАН України за темою “Фактори і механізми стійкості клітин до змін температурного і осмотичного параметрів середовища” (шифр теми 2.2.6.86, № держреєстрації 0101U003472)

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідження впливу місцевих анестетиків, похідних барбітурової кислоти, модифікаторів цитоскелет-мембранного комплексу на чутливість еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу, постгіпертоничного лізису та гіпертонічного гемолізу, а також вивчення комбінованого впливу модифікаторів і інгібіторів аніонного транспорту на резістентність еритроцитів у середовищах різного складу.

Для досягнення поставленої мети в роботі було необхідно вирішити такі задачі:

1. Дослідити вплив місцевого анестетика лідокаїну і похідних барбітурової кислоти (барбіталу, фенобарбіталу) на рівень постгіпертонічного лізису еритроцитів, попередньо інкубованих у присутності 1,5 Моль/л і 3 Моль/л NaCl, і гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів при охолодженні клітин у середовищах, які містять неелектроліт (0,86 Моль/л сахарози) і різні аніони.

2. Дослідити вплив лідокаїну, похідних барбітурової кислоти разом з модифікаторами цитоскелет-мембранного комплексу - парахлормеркурійбензоат (ПХМБ), йодоцетамід (ЙАА) на рівень гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів при охолодженні в середовищах, які містять неелектроліт (0,86 Моль/л сахарози) і різні аніони.

3. Дослідити вплив лідокаїну, похідних барбітурової кислоти на рівень гіпертонічного гемолізу в середовищі, яке містить 4,0 Моль/л NaCl.

4. Дослідити вплив лідокаїну і похідних барбітурової кислоти, а також їх спільної дії з інгібіторами аніонного транспорту (4,4ґ-діізотіоціаностілбене-2,2ґ-дісульфанат (ДІДС), діпірідамол) на Cl^-/SO₄-обмін у мембрані еритроцитів в ізотонічному і гіпертонічному середовищах. анестетик еритроцит резистентність кріогемоліз лізис гемоліз

5. Вивчити вплив лідокаїну та інгібіторів аніонного транспорту на активність асоційованого з аніонним переносником ферменту - ацетилхолінестерази в еритроцитах, інкубованих у середовищах, які містять хлорид натрію й сульфат натрію.

6. Оцінити параметри транспорту аніонів і активності ацетилхолінестерази в негемолізованій фракції клітин, отриманої після постгіпертонічного лізису еритроцитів, під впливом лідокаїну, похідних барбітурової кислоти та інгібіторів аніонного транспорту.

Об'єкт дослідження - гіпертонічний кріогемоліз еритроцитів, постгіпертонічний лізис і гіпертонічний гемоліз.

Предмет дослідження - стійкість еритроцитів до зміни температури і осмолярності середовища під дією лідокаїну, похідних барбітурової кислоти (барбіталу, фенобарбіталу), інгібіторів аніонного транспорту ДІДСу, діпірідамолу і модифікаторів мембрани ЙАА, ПХМБ.

Методи дослідження - спектрофотометричний, спектрофлуорометричний, метод рН-метрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримано нові дані щодо впливу різних концентрацій лідокаїну і похідних барбітурової кислоти (барбітал, фенобарбітал) на рівень гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів. Встановлено, що зі збільшенням концентрації барбіталу і фенобарбіталу рівень гіпертонічного кріогемолізу знижується. Підвищення концентрації лідокаїну спочатку викликає стимуляцію кріогемолізу, потім - його зниження.

Показано, що при обробці еритроцитів модифікаторами мембрани (ЙАА, ПХМБ) при внесенні в середовище інкубації барбіталу, фенобарбіталу, лідокаїну рівень гіпертонічного кріогемолізу не змінюється.

Вперше показано, що лідокаїн, барбітал, фенобарбітал суттєво знижують рівень гіпертонічного гемолізу у випадку збільшення їхньої концентрації у середовищі інкубації.

Разом з тим лідокаїн, барбітал і фенобарбітал не впливають на чутливість еритроцитів до постгіпертоничного лізису.

Вперше показано, що при функціонуванні аніонного каналу мембрани еритроцитів в ізотонічному і гіпертонічному середовищах під впливом лідокаїну і барбітуратів з підвищенням концентрації цих сполук у середовищі інкубації транспортна активність білка смуги 3 змінюється. Ступінь зміни транспортної активності залежить від виду використаної сполуки і тонічності середовища інкубації. Під дією лідокаїну у всіх випадках спостерігається зниження активності транспортера, у той час як під дією барбіталу і фенобарбіталу спостерігається збільшення активності в сульфатному середовищі при проміжних концентраціях сполук з наступним зниженням при підвищенні концентрації.

Показано, що зміна активності ацетилхолінестерази залежить від концентрації внесеного лідокаїну і складу середовища інкубації. Попередня обробка еритроцитів інгібітором аніонного транспорту (ДІДС) знижує ступінь впливу лідокаїну на активність ацетилхолінестерази.

Еритроцити негемолізованої фракції проявляють меншу чутливість до дії лідокаїну, барбіталу, фенобарбіталу і змін складу позаклітинного середовища. Для цієї фракції характерна більш низька швидкість обміну аніонів при підвищенні концентрації лідокаїну, барбіталу і фенобарбіталу в суспензії клітин, а також при підвищенні осмолярності позаклітинного середовища.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати можуть бути використані при розробці нових підходів, спрямованих на підвищення стійкості еритроцитів до зміни температури та осмолярності середовища. Зміна функціонування білків мембрани еритроцитів під впливом анестетиків, барбітуратів багато в чому визначає чутливість клітин до гіпертонічного середовища та охолодження.

Отримані результати дозволяють більшою мірою зрозуміти механізм ушкодження клітин при зміні температури та складу середовища інкубації.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота є самостійним дослідженням здобувача. Разом з науковим керівником сформульовані мета і завдання дослідження. Розроблено методологічні підходи до вивчення впливу похідних барбітурової кислоти, лідокаїну, інгібіторів аніонного транспорту на функціонування еритроцитів. Особисто здобувачем здійснено: інформаційний пошук і аналіз літературних даних , експериментальні дослідження, статистична обробка і аналіз отриманих результатів; сформульовані висновки роботи.

В роботах [1, 6] автором досліджено вплив барбітуратів та середовища різного складу на функціонування аніонного транспортера в мембрані еритроцитів;

В роботах [2, 7] автором досліджено змінення активності ацетилхолінестерази під впливом лідокаїну та ДІДС.

В роботі [5] автором досліджено характер змінення транспорту аніонів під впливом барбітуратів та ДІДС.

В роботах [3, 4, 8, 9] автором досліджено чутливість еритроцитів людини до змінення осмолярності середовища під впливом барбітуратів та лідокаїну.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і обговорювались на: конференції “Холод у біології і медицині 2002” (м. Харків, 2002 р.); VII Міжнародній науково-практичній конференції “Наука і освіта '2004” (м. Дніпропетровськ, 2004 р.); III Міжнародній науково-практичній конференції “Динаміка наукових досліджень '2004” (м. Дніпропетровськ, 2004 р.); науково-практичній конференції “Перспективні розробки науки і техніки” (м. Дніпропетровськ, 2004 р.).

Публікації. Основні матеріали дисертації опубліковано в 9 наукових працях, у тому числі у 5 статтях у наукових фахових журналах і в 4 тезах доповідей міжнародних і національних конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 135 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу, присвяченого матеріалам і методам дослідження, розділу власних результатів, аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який містить 206 найменувань (25 сторінок). Робота містить 16 рисунків, 10 таблиць.

В роботі було досліджено вплив барбіталу, фенобарбіталу, лідокаїну в концентраціях 0,123ч12,3 мМоль/л на структурно-функціональні характеристики еритроцитів людини.

Одержання еритроцитів. Еритроцити одержували з консервованої донорської крові ІІ групи. Еритроцити негемолізованої фракції одержували шляхом їх перенесення з гіпертонічних розчинів, які містять 1,5 Моль/л NaCl (час інкубації 45 хвилин) або 3,0 Моль/л NaCl (час інкубації 10 секунд), у фізіологічний розчин.

Гіпертонічний кріогемоліз еритроцитів. Еритроцити з кінцевим гематокритом 2% поміщали в середовище, яке містило 0,86 Моль/л сахарози (рН=7,4), 0,86 Моль/л сахарози+0,15 Моль/л NaCl (рН=7,4), 0,86 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л сульфату натрію (рН=7,4). У середовище інкубації до внесення еритроцитів вносили барбітал, фенобарбітал, лідокаїн. Інкубували еритроцити при 37⁰С 45 хвилин, потім їх переносили на 5 хвилин на крижану баню.

Постгіпертонічний лізис еритроцитів. Постгіпертонічний лізис здійснювали шляхом перенесення еритроцитів із гіпертонічних розчинів, які містили 1,5 Моль/л або 3 Моль/л NaCl (рН = 7,4), а також барбітал, фенобарбітал, лідокаїн в ізотонічний розчин хлориду натрію. Час інкубації в розчині 1,5 Моль/л NaCl становив 45 хвилин, час інкубації в розчині 3 Моль/л NaCl - 10 секунд.

Модифікація цитоскелет-мембранного комплексу еритроцитів сульфгідрильними реагентами (ЙАА/ПХМБ). Еритроцити з 20% гематокритом вносили в середовище, яке містить 0,09 Моль/л КCl, 0,045 Моль/л NaCl, 0,044 Моль/л сахарози, 0,01 Моль/л трис-буфера (рН=7,4) [Haest C. W. M 1981]. У середовище обробки, яке містить еритроцити, вносили ЙАА в кінцевій концентрації 15 мМоль/л. Обробку проводили протягом 30 хвилин на водяній бані при 37⁰С. Потім у середовище обробки додавали ПХМБ у кінцевій концентрації 1 мМоль/л і продовжували обробку протягом 1 години за тих самих умов.

Гіпертонічний гемоліз еритроцитів. Еритроцити розводили у співвідношенні 1:1 розчином NaCl (0,15-1,1 Моль/л) або розчином сахарози (0,3-1,1 моль/л). Попередню інкубацію проводили протягом 10 хвилин при заданій температурі (0⁰С або 37⁰С). Гіпертонічний вплив здійснювали шляхом перенесення еритроцитів у середовище 4,0 Моль/л NaCl (1 мл) у співвідношенні 1:10 при температурі попередньої інкубації. Інкубацію проводили протягом 10 хв. У гіпертонічне середовище до внесення еритроцитів вносили фенобарбітал, барбітал і лідокаїн.

Визначення рівня гемолізу еритроцитів спектрофотометричним методом. Клітини осаджували центрифугуванням при 1500 g протягом 3 хвилин. Вміст гемоглобіну в супернатанті визначали спектрофотометричним методом на СФ-4А в проточній кюветі на довжині хвилі 543 нм. Вихід гемоглобіну із клітин розраховували у відсотках відносно гемолізу еритроцитів, який приймали за 100%, після перенесення попередньо інкубованих еритроцитів у дистильовану воду.

Вивчення транспорту сульфату в еритроцити. В термостатовану комірку вносили 2 мл розчину 0,12 Моль/л Na₂SO₄, 0,5 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄, 0,86 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄ (37⁰С), барбітал, фенобарбітал або лідокаїн. Потім до комірки вносили 50 мкл осаду еритроцитів. Графічно змінювання рН середовища інкубації фіксували за допомогою самописця, з'єднаного з рН-метром [Ellory J.C., Young J.D., 1982]. Функціонування білка смуги 3 характеризували значенням константи k₂ - константи швидкості змінювання рН суспензії еритроцитів у фазі залуження.

Вивчення функцій мембранозв'язаної ацетилхолінестерази. Інтенсивність флуоресценції вимірювали протягом 45 хвилин на спектрофлуориметрі “HITACHI 2MF” на довжині хвилі збудження _збудж=486 нм. та флуоресценції _флуор=517 нм. Вимірювання проводили з інтервалом 5 хв. в кюветі, до якої вносили 2 мл середовища інкубації: а) 1 Моль/л NaCl; б) 1 Моль/л Na₂SO₄; в) 0,15 Моль/л NaCl; г) 0,12 Моль/л Na₂SO₄; д) 0,86 Моль/л сахарози+0,15 Моль/л NaCl; е) 0,86 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄, лідокаїн, еритроцити з кінцевим гематокритом 0,02%, флуоресцеіндіацетат у концентрації 32 мкМоль/л.

Обробка еритроцитів інгібітором аніонного транспорту 4,4^?-діізотіоціаностілбене-2,2^?-дісульфанатом (ДІДС) для аналізу активності ацетилхолінестерази. Еритроцити з 20% гематокритом розміщували в пробірці з фізіологічним розчином (рН=7,4) і ДІДС у кінцевій концентрації 50мкМоль/л. Обробку клітин проводили протягом 1 години на водяній бані при 37⁰С.

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Вплив барбітуратів і лідокаїну на рівень гіпертонічного кріогемолізу.

Інкубація еритроцитів у гіпертонічному середовищі при постійній позитивній температурі (наприклад, 37⁰С) з подальшим охолодженням до температури нижче 12⁰С, але вище температури формування кристалів льоду в клітинній суспензії призводить до ушкодження клітин і розвитку гіпертонічного кріогемолізу.

На рисунку 1 подано дані щодо залежності рівня кріогемолізу еритроцитів людини від концентрації фенобарбіталу, барбіталу і лідокаїну при інкубації клітин у гіпертонічному сахарозному середовищі (0,86 Моль/л) з наступним охолодженням до 0⁰С. Інкубацію та охолодження клітин проводили в середовищах різного складу: 0,86 Моль/л сахарози (рис. 1а), а також у комбінованих середовищах 0,86 Моль/л сахарози+0,15 Моль/л NaCl (рис. 1б), 0,86 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄ (рис. 1в).

Видно, що дія досліджуваних речовин залежать як від їхньої концентрації, так і від складу середовища. У сахарозному середовищі (рис. 1а) максимальний рівень кріогемолізу спостерігається при низьких концентраціях речовин, причому лідокаїн в концентрації 1 мМоль/л підвищує рівень кріогемолізу (рис. 1а, крива 3), що відрізняє дію цього анестетика від дії фенобарбіталу і барбіталу (рис. 1а, криві 1 і 2, відповідно), у випадку яких аналогічний ефект відсутній. При збільшенні концентрації речовин рівень гіпертонічного кріогемолізу знижується: він є мінімальним при максимальній з досліджених концентрації речовин. Барбітурати (фенобарбітал і барбітал) однаковим чином впливають на рівень кріогемолізу, однак при цьому більш ефективно підвищує стійкість клітин до кріогемолізу фенобарбітал (рис. 1, крива 1). Більш низькою є захисна ефективність лідокаїну (рис. 1, крива 3), однак при високих концентраціях вона вища, ніж ефективність барбіталу (рис. 1, крива 2).

При включенні в сахарозне гіпертонічне середовище електроліту (0,15 Моль/л NaCl) загальний характер впливу речовин на кріогемоліз не змінюється (рис. 1б), однак у цьому випадку мають місце певні відмінності. Вони стосуються, насамперед, впливу барбіталу і фенобарбіталу на клітини при мінімальних концентраціях. У цьому випадку рівень кріогемолізу знижується у порівнянні з таким при інкубації та охолодженні еритроцитів у сахарозному середовищі без NaCl (рис. 1а). У той же час і в комбінованому середовищі зберігається стимулюючий вплив низьких концентрацій лідокаїну на розвиток кріогемолізу (рис. 1б, крива 3). При високих концентраціях лідокаїн впливає на кріогемоліз, подібно до дії фенобарбіталу, яка спостерігається у сахарозному середовищі (рис. 1а).

У цілому можна говорити, що в досліджуваному інтервалі концентрацій у комбінованих середовищах, які містять NaCl, дія фенобарбіталу і барбіталу не виявляє вираженої концентраційної залежності, що відрізняє їх від дії лідокаїну, для якого концентраційна залежність має місце й у комбінованому середовищі (рис. 1б).

З графіків, наведених на рис. 1в, видно, що заміна в комбінованому середовищі аніонів хлориду на аніони сульфату (SO₄^2-) відновлює картину, яка спостерігається при інкубації й охолодженні еритроцитів у сахарозному середовищі без електроліту (рис. 1а). Той факт, що зміна складу аніонів у комбінованому середовищі, яке містить 0,86 Моль/л сахарози, призводить до змінення чутливості еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу при низьких концентраціях діючих речовин дозволяє зробити припущення, що в цьому випадку причиною зміни чутливості клітин є вплив лідокаїну і барбітуратів на стан аніонного транспортера (білка смуги 3). У зв'язку з цим виникає питання, як модифікація білків мембрани і цитоскелету впливає на дію лідокаїну і барбітуратів при гіпертонічній інкубації та охолодженні еритроцитів.

На рис. 2 приведені дані, що відображають рівень гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів, модифікованих SH-реагентами (йодоцетамідом і ПХМБ) за умов гіпертонічної інкубації та охолодження в гіпертонічному сахарозному середовищі в присутності лідокаїну і барбітуратів.

Видно, що обробка еритроцитів SH-реагентами істотно змінює чутливість клітин до дії лідокаїну і барбітуратів (фенобарбіталу і барбіталу). Цей ефект хімічної модифікації насамперед стосується лідокаїну. Видно, що у всіх випадках після обробки еритроцитів йодоцетамідом і ПХМБ відсутній ефект стимуляції кріогемолізу в присутності низьких концентрацій лідокаїну. У гіпертонічному сахарозному середовищі (рис. 2а) йодоцетамід і ПХМБ усувають залежність рівня кріогемолізу від концентрації використаних речовин і в цьому випадку рівень кріогемолізу є такм, як при інкубації та охолодженні клітин за відсутності лідокаїну і барбітуратів. Подібна картина спостерігається як у сахарозному, так і в комбінованих середовищах (рис. 2б, в).

При обробці еритроцитів ПХМБ він зв'язується з SH-групою одного з гідрофобних фрагментів білка смуги 3. Це зв'язування призводить до порушення зв'язку білка смуги анкірін-спектрин, що, у свою чергу, призводить до порушення зв'язку цитоскелет-мембрана. Йодоцетамід зв'язується із цитоплазматичним пулом SH-груп і так само з половиною загальної кількості SH-груп мембрани клітини, однак не блокує групу, з якою зв'язується ПХМБ. У свою чергу обробка клітин йодоцетамідом і ПХМБ підвищує ефективність дії ПХМБ. Можна припустити, що вплив SH-реагентів реалізується в першу чергу на попередньому етапі дегідратації еритроцитів у гіпертонічному середовищі, коли змінюється об'єм і форма клітин. При модифікації білків мембрани і цитоскелета реакція клітин на зміну об'єму може істотно відрізнятися від реакції немодифікованих клітин і в цьому випадку вихідний стан еритроцитів на етапі перед охолодженням може характеризуватися істотно більш низькою сприйнятливістю до дії лідокаїну і барбітуратів у порівнянні з нормальними клітинами. Це означає, що вихідний стан еритроцитів, модифікованих йодоцетамідом і ПХМБ, є значимим фактором, що контролює чутливість клітин до охолодження.

Були проведені дослідження впливу лідокаїну й барбітуратів на чутливість еритроцитів до постгіпертонічного лізису, що здійснювався шляхом перенесення клітин з 3 і 1,5 Моль/л розчину NaCl в 0,15 Моль/л водний розчин NaCl при постійній температурі (22⁰С). У цьому випадку характер впливу на клітини досліджуваних речовин був подібний такому у випадку гіпертонічного кріогемолізу при обробці еритроцитів йодоцетамідом і ПХМБ (дані не представлені). На відміну від кріогемолізу, коли динамічною фазою в процесі є зрушення температури, у випадку постгіпертонічного лізису динамічною фазою є швидка зміна об'єму клітин при перенесенні з гіпертонічного середовища в середовище з фізіологічної тонічністю. У цьому випадку процес відновлення вихідного об'єму клітин на етапі регідратації може характеризуватися порушенням погодженості об'ємних змін мембрани і цитоскелету при цьому знижується стабілізуючий вплив цитоскелету на бішар.

Вплив барбітуратів і лідокаїну на рівень гіпертонічного гемолізу

Як і гіпертонічний кріогемоліз гіпертонічний гемоліз обумовлений змінами, які відбуваються в плазматичній мембрані при різкій дегідратації еритроцитів але без зміни температури.

На рис. 3 подані графіки залежності рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів від концентрації барбіталу, фенобарбіталу, лідокаїну при перенесенні клітин з ізотонічного середовища в гіпертонічний водний розчин (4,0 Моль/л NaCl) при температурах 37⁰С і 0⁰С (рис. 3а і 3б, відповідно).

Відомо, що максимальний рівень гемолізу спостерігається при мінімальних концентраціях речовин при 37⁰С (рис. 3а). І при збільшенні концентрації анестетиків рівень гемолізу зменшується і досягає мінімуму при максимальній концентрації. При цьому найбільш виражену захисну дію появляє фенобарбітал (рис. 3а, крива 1). Трохи менш виражений вплив має лідокаїн (рис. 3а, крива 3), однак цей вплив більш помітний у порівнянні з дією барбіталу (рис. 3а, крива 2).

При зниженні температури середовища до 0⁰С зберігається подібний характер зміни чутливості еритроцитів до гемолізу (рис. 3б). Максимальний рівень гемолізу спостерігається при мінімальній концентрації речовин, однак він істотно нижче, ніж при 37⁰С. Зі збільшенням концентрації речовин рівень гемолізу поступово знижується. Не спостерігається істотних розходжень у характері дії барбітуратів і лідокаїну при 0⁰С і при 37⁰С. Максимальний ефект спостерігається під впливом фенобарбіталу (рис. 3б, крива 1), дія лідокаїну слабкіша (рис. 3б, крива 3), але більш виражена в порівнянні з впливом барбіталу (рис. 3б, крива 2).

У зв'язку з тим, що барбітурати і лідокаїн змінюють чутливість еритроцитів до гіпертонічного гемолізу, виникає питання: наскільки можлива зміна рівня гемолізу в залежності від початкових умов, у яких знаходяться клітини. На рис. 4 представлені дані щодо зміни рівня гіпертонічного гемолізу при попередній частковій дегідратації еритроцитів в електролітних середовищах в інтервалі 0,15-1,2 Моль/л NaCl при температурах 37⁰С і 0⁰С у присутності барбітуратів і лідокаїну (рис. 4а і 4б, відповідно).

Видно, що чутливість еритроцитів до гіпертонічного гемолізу в значній мірі залежить від осмотичних умов середовища перед їхнім перенесенням у висококонцентрований розчин NaCl (4,0 Моль/л) (рис. 4). Як при температурі 37⁰С (рис. 4а, крива 1), так і при температурі 0⁰С (рис. 4б, крива 1) максимальна збереженість еритроцитів спостерігається при попередній дегідратації в середовищі 0,3-0,5 Моль/л NaCl. Підвищення концентрації NaCl у середовищі дегідратації приводить до підвищення рівня гемолізу (рис. 4). При 37⁰С (рис. 4а) рівень гемолізу перевищує відповідний рівень при 0⁰С (рис. 4б). Захисна ефективність анестетика і барбітуратів проявляється в умовах попередньої дегідратації при всіх використаних концентраціях NaCl. Максимальне зменшення рівня гемолізу спостерігається під впливом фенобарбіталу (рис. 4а, крива 2, рис. 4б, крива 2), менш ефективним є лідокаїн (рис. 4а, крива 4, рис. 4б, крива 4). Найменший вплив на рівень гемолізу спостерігається під впливом барбіталу (рис. 4а, крива 3, рис. 4б, крива 3). Можна припустити, що включення барбітуратів і лідокаїну у мембрану еритроцитів призводить до підвищення внутрішньомембранного (латерального) тиску, що сприяє замиканню трансмембранних дефектів і не дозволяє їм досягти критичного рівня, що призводить до лізису клітин.

Вплив барбітуратів і лідокаїну на функціонування аніонного каналу

До теперішнього часу неясним залишається характер впливу барбіталу, фенобарбіталу, лідокаїну на функціонування аніонного переносника - основного інтегрального білка мембрани еритроцитів - білка смуги 3. Були проведені дослідження залежності функціонального стану білка смуги 3 від концентрації барбіталу, фенобарбіталу і лідокаїну (рис.. 5 а, б, в, відповідно) в ізотонічному (0,12 Моль/л Na₂SO₄) і гіпертонічному (0,5 Моль/л і 0,86 Моль/л сахарози) середовищах в інтактних еритроцитах і в еритроцитах негемолізованої фракції після впливу 3 Моль/л NaCl (рис. 5а₁, 5б₁, 5в₁, відповідно).

Обмін аніонів кріз мембрану еритроцитів супроводжується транспортом протонів та зміною рН середовища. У даному випадку аналіз інтенсивності транспорту аніонів проводили на основі аналізу зміни величини k₂ - константи, що характеризує швидкість змінення рН при транспорті аніонів за допомогою білка смуги 3. У випадку інтактних еритроцитів в ізотонічному середовищі при низьких концентраціях барбіталу і фенобарбіталу спостерігається активація транспортних процесів (рис. 5а, б, крива 1), однак лідокаїн у низьких концентраціях не виявляє стимулюючої дії. При підвищенні концентрації лідокаїну і барбітуратів інтенсивність транспорту знижується і сягає мінімуму при максимальній концентрації досліджених речовин у середовищі. При цьому має місце їх неоднаковий вплив на аніонний переносник. Фенобарбітал у більшій мірі знижує транспортну активність (рис.5б), барбітал (рис. 5а) менше впливає на стан білка смуги 3, ніж лідокаїн.

У сахарозному (0,5 Моль/л і 0,86 Моль/л) середовищі загальний характер впливу фенобарбіталу, барбіталу і лідокаїну на аніонний переносник не змінюється, однак з'являються деякі відмінності. Барбітурати і лідокаїн зі збільшенням концентрації в середовищі тільки інгібують транспортні процеси (рис. 5, криві 2 і 3) і не виявляють стимулюючої дії.

На рисунку 5 (а₁, б₁, в₁) представлені дані, що відображають змінення значення константи k₂ стійкої до постгіпертонічного лізису фракції еритроцитів, отриманої після впливу на клітини 3 Моль/л NaCl в залежності від складу середовища і концентрації барбіталу, фенобарбіталу, лідокаїну. Як видно з представлених даних для еритроцитів, стійких до постгіпертонічного лізису характерне зниження транспортної активності білка смуги 3. Проявляються також деякі відмінності в дії похідних барбітурової кислоти (барбіталу і фенобарбіталу) і лідокаїну на характер змінення інтенсивності транспорту аніонів. Це стосується, у першу чергу, впливу фенобарбіталу і барбіталу на транспорт аніонів в умовах ізотонії (рис. 5а₁, б₁, крива 1). Видно, що у разі еритроцитів, стійких до постгіпертонічного лізису, не характерна стимуляція транспорту, викликана низькими концентраціями барбітуратів. У цілому для досліджених речовин у заданому діапазоні концентрацій характерно менш виражене інгібування транспортних процесів (рис. 5а₁, б₁, в₁), ніж у випадку еритроцитів, які не підлягали попередній інкубації у гіпертонічних розчинах (рис. 5а, б, в).

Отримані дані свідчать про те, що барбітал, фенобарбітал і лідокаїн змінюють транспортну активності білка смуги 3. При цьому попередня інкубація еритроцитів у гіпертонічному середовищі може істотно знижувати чутливість клітин до дії барбітуратів і анестетика.

Вплив анестетиків на функціонування мембранозв'язаної еритроцитарної ацетилхолінестерази

Модифікація анестетиками клітинної мембрани здатна змінювати не тільки функціонування систем аніонного транспорту, але й мембранних ферментів. Нами досліджено вплив місцевого анестетику (лідокаїну) на функціонування розташованого в зовнішньому ліпідом моношарі білка - ацетілхолінестерази. Вивчалось функціонування даного білка в умовах різної тонічності в присутності аніонів хлориду, сульфату і лідокаїну (рис 6а, б, в), а також після попередньої обробки еритроцитів специфічним інгібітором аніонного транспорту ДІДС (рис. 6а₁, б₁, в₁).

Ацетилхолінестераза здатна гідролізувати субстрат для естераз флуоресцеїндіацетат. При заданій довжині хвилі під час гідролізу виникає флуоресценція, яка зростає при збільшенні кількості гідролізованого субстрату.

З даних, представлених на рис. 6 (а, б, в) видно, що заміна в середовищі інкубації аніона хлориду на аніон сульфату призводить до збільшення функціональної активності ацетилхолінестерази в середовищах різної осмолярності (криві 1, 4, 5 і криві 2, 3, 6, відповідно). Підвищення осмолярності середовища знижує функціональну активність ферменту (рис. 6б, в) у порівнянні з умовами ізотонії (рис. 6а). Попередня обробка еритроцитів інгібітором аніонного транспорту ДІДС значно знижує активність ацетилхолінестерази, що найбільш виражено в середовищі 0,15 Моль/л NaCl (рис. 6а, а₁, криві 1). Також у цьому випадку знижується чутливість клітин до дії гіпертонії (рис. 6 б₁, в₁, відповідно).

Зміна активності ацетилхолінестерази внаслідок модифікації мембрани за допомогою інгібітору аніонного транспорту ДІДС вказує на можливість існування структурно-функціонального комплексу між ацетилхолінестеразою і білком смуги 3.

Висновки

У дисертаційній роботі представлені теоретичні та експериментальні дані, стосовно вивчення особливостей реакції еритроцитів на змінення температури і осмолярності середовища інкубації. Наразі достатньо добре відома дія похідних барбітурової кислоти, місцевих анестетиків на ліпідний компонент мембрани, однак особливості функціонування білків мембрани в умовах змінення температури, осмолярності середовища інкубації, а також при додаванні в середовище інкубації зазначених сполук залишаються нез'ясованими.

1. Фенобарбітал, барбітал і лідокаїн інгібують розвиток гіпертонічного кріогемолізу еритроцитів. Інгібіторний ефект більшою мірою залежить від концентрації використовуваної сполуки та у меншому ступені від її хімічної природи.

2. Барбітал, фенобарбітал, лідокаїн підвищують стійкість еритроцитів в умовах гіпертонічного гемолізу. Захисна дія залежить від концентрації досліджуваної речовини.

3. Барбітал, фенобарбітал, лідокаїн не проявляють захисної ефективності в умовах постгіпертонічного лізису в інтервалі використовуваних концентрацій.

4. Барбітал, фенобарбітал, лідокаїн інгібують транспорт аніонів через мембрану еритроцитів, контрольований білком смуги 3. Максимальне інгібування має місце в середовищі, яке містить 0,12 Моль/л Na₂SO₄ при використанні фенобарбіталу, у той час у сахарозних середовищах інгібування виражене слабкіше. У лідокаїну і барбіталу менш виражена інгібуюча дія в порівнянні з фенобарбіталом.

5. Фенобарбітал і барбітал проявляють здатність активувати транспорт аніонів в еритроцитах у середовищі, яке містить 0,12 Моль/л Na₂SO₄. Концентраційний інтервал, у межах якого спостерігається ця дія становить (0,125-0,5) мМоль/л. Підвищення концентрації фенобарбіталу і барбіталу призводить до інгібування транспорту.

6. В умовах інкубації еритроцитів у середовищах, які містять 0,12 Моль/л Na₂SO₄, 0,5 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄, 0,86 Моль/л сахарози+0,12 Моль/л Na₂SO₄ ефект модифікації за типом “барбітурат, лідокаїн+інгібітор транспорту аніонів” залежить від природи використаного інгібітору. У випадку діпірідамолу комбінована модифікація призводить до збільшення інгібування транспорту аніонів у порівнянні з умовами, коли барбітал, фенобарбітал, лідокаїн і діпірідамол застосовували окремо. У випадку ДІДС таке збільшення спостерігається тільки стосовно індивідуального використання барбітуратів і лідокаїну, але не ДІДС.

7. В інтервалі концентрацій (0,092-9,2) мМоль/л лідокаїн знижує активність ацетилхолінестерази в мембрані еритроцитів, причому ефект інгібувания зростає зі збільшенням концентрації анестетика. Інгібування ацетилхолінестерази більше виражено в сульфатному середовищі в порівнянні із середовищами, які містять хлорид. Як у сульфатному, так і в хлоридному середовищах ДІДС блокує вплив лідокаїну на активність ацетилхолінестерази.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Бондаренко Н. В., Рамазанов В. В., Бондаренко В. А. Вплив барбітуратів на обмін хлориду і сульфату в еритроцитах крові людини // Вісник проблем біології і медицини. - 2002. - Вип. 9-10. - С. 3-7.

2. Прокопенко Н. В. Влияние лидокаина на мембраносвязанный фермент - ацетилхолинэстеразы в эритроцитах человека. // Вісник проблем біології і медицини. - 2005. - №1. - С. 32-37.

3. Прокопенко Н. В., Бондаренко В. А. Особенности гипертонического криогемолиза и постгипертонического лизиса эритроцитов человека под воздействием фенобарбитала и барбитала // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 5. - №1. - С. 27-33.

4. Прокопенко Н. В., Бондаренко В. А. Влияние барбитуратов и лидокаина на устойчивость эритроцитов к гипертоническому гемолизу // Проблемы криобиологии. - 2006. - Т. 16. - №3. - С. 242-249.

5. Бондаренко Н. В., Рамазанов В. В., Бондаренко В. А. Вплив специфічних та неспецифічних інгібіторів на транспорт аніонів в еритроцитах людини // Біологія та валеологія. - 2002. - Вип. 5. - С. 31-36.

6. Бондаренко Н. В., Рамазанов В. В. Влияние гипертонических сред и барбитуратов на транспорт анионов в эритроцитах человека. // Проблемы криобиологии. - 2002. - №1. - С. 111-113.

7. Прокопенко Н.В. Влияние функционального состояния белка полосы 3 на активность мембраносвязанного фермента эритроцитов - ацетилхолинэстеразу // Материалы научно-практической конференции “Перспективные разработки науки и техники”. Том 16. Биология и сельское хозяйство. - Белгород - Днепропетровск: Наука и образование, 2004. - С. 26-29.

8. Прокопенко Н. В. Вплив деяких анестетиків на розвиток холодової чутливості еритроцитів. // Матеріали VII Міжнародної науково-практичної конференції “Наука і освіта `2004”. Том 54. Фізіологія людини та тварин. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2004. - С. 47-48.

9. Прокопенко Н. В. Влияние барбитала, фенобарбитала и лидокаина на развитие гипотонического гемолиза эритроцитов человека. // Матеріали III Міжнародної науково-практичної конференції “Динаміка наукових досліджень `2004”. Том 32. Біологічні науки. - Дніпропетровськ: Наука і освіта, 2004. - С. 58-59

Размещено на Allbest.ru