Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДІНА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВИЯВЛЕННЯ НЕОАНТИГЕННОЇ ДЕТЕРМІНАНТИ В МОЛЕКУЛІ ФІБРИНУ ТА ВСТАНОВЛЕННЯ ЇЇ ФУНКЦІОНАЛЬНОЇ РОЛІ

03.00.04 - Біохімія

ЛУГОВСЬКА Наталія Едуардівна

Київ 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор,

академік НАН і АМН України

Комісаренко Сергій Васильович, Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, директор, завідувач відділу

молекулярної імунології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Козлов Едуард Андрійович,

Інститут молекулярної

біології і генетики НАН України,

старший науковий співробітник відділу

біохімічної генетики;

доктор біологічних наук,

Гриненко Тетяна Вікторівна,

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України,

завідувач відділу хімії та біохімії ферментів.

Захист відбудеться “5” липня 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий “4” червня 2010 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

АНОТАЦІЯ

Луговська Н.Е. Виявлення неоантигенної детермінанти в молекулі фібрину та встановлення її функціональної ролі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. ? Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2010.

Дисертацію присвячено вивченню антигенної будови молекули фібрину, дослідженню механізмів його полімеризації та розробці імуноферментного методу визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини з діагностичною метою.

Досліджено імунохімічні властивості шести видів моноклональних антитіл, одержаних до фібрину desAABB людини, та показано їх високу специфічність та афінітет до фібрину. Вперше виявлено невідому раніше неоантигенну детермінанту в молекулі фібрину людини, яка знаходиться у фрагменті Вв118-134, експонується при перетворенні фібриногену на фібрин desAA та зникає після гідролізу фібрину плазміном. Вперше показано, що у фрагменті Вв121-138 молекули фібрину людини розташований невідомий раніше центр полімеризації, який бере участь у міжмолекулярному зв'язуванні фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил. Із використанням одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл розроблено твердофазний бісайтовий імуноферментний метод визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та апробовано його в клініці разом із імуноферментним методом визначення D-димеру. Дані методи лягли в основу створення вітчизняних імунотест-систем для визначення розчинного фібрину й D-димеру в плазмі крові людини. Передбачається широке застосування даних тест-систем у клінічних закладах із діагностичною метою.

Ключові слова: фібрин, розчинний фібрин, фібрин-специфічні моноклональні антитіла, неоантигенна детермінанта, центр полімеризації фібрину, імунодіагностична тест-система для визначення розчинного фібрину.

Луговская Н.Э. Выявление неоантигенной детерминанты в молекуле фибрина и определение ее функциональной роли. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. ? Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2010.

Диссертационная работа посвящена изучению антигенной структуры молекулы фибрина, исследованию механизмов его полимеризации и разработке иммуноферментного метода определения растворимого фибрина в плазме крови человека.

Для получения моноклональных антител, специфических к фибрину человека, методом гибридомной технологии в качестве антигена был использован частично денатурированный фибрин desAABB человека. В результате было получено шесть гибридом, продуцирующих моноклональные антитела подкласса IgG2а, которые с высокой специфичностью и афинностью реагируют с фибрином desAA и фибрином desAABB человека без перекрестной реакции с фибриногеном и конечными продуктами плазминового гидролиза фибрин(оген)а.

Установлено, что эпитопы для всех шести видов полученных моноклональных антител находятся во фрагменте Вв118-134 фибрина человека. Даный фрагмент располагается в суперспиральной области молекулы фибрина между его D- и Е-доменами. Результаты проведенных исследований указывают на то, что в этом фрагменте находится неизвестная ранее неоантигенная детерминанта молекулы фибрина, которая экспонируется в результате структурных перестроек при тромбиновом превращении фибриногена в фибрин desAA и исчезает после гидролиза фибрина плазмином.

Показано, что все полученные моноклональные антитела являются высокоспецифическими ингибиторами полимеризации фибрина, тормозящими стадию латеральной ассоциации протофибрилл. С использованием данных антител и синтетических пептидов впервые было обнаружено, что в суперспиральном фрагменте Вв121-138 фибрина человека расположен неизвестный ранее центр полимеризации фибрина, который принимает участие в межмолекулярном связывании фибрина на стадии латеральной ассоциации протофибрилл.

С использованием полученных фибрин-специфических моноклональных антител в качестве связывающих (кетч-) антител и полученных ранее в отделе молекулярной иммунологии Института биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины моноклональных антител II-4d, эпитоп для которых расположен в NH₂-концевом фрагменте г-цепи D-домена фибрин(оген)а, в качестве вторичных (тэг-) антител разработан твердофазный бисайтовый иммуноферментный метод определения в плазме крови человека одного из важнейших молекулярных маркеров активации системы свертывания крови и угрозы тромбообразования - растворимого фибрина.

Данный метод был апробирован в клинике вместе с разработанным ранее в отделе молекулярной иммунологии Института биохимии им. А.В. Паладина НАН Украины методом определения D-димера в плазме крови человека. Проведенная апробация показала выраженную корреляцию полученных результатов с литературными данными и предоставила новую информацию о содержании растворимого фибрина и D-димера в плазме крови беременных здоровых и с угрозой прерывания беременности, больных гипертонической болезнью с разной степенью развития ишемической болезни сердца и больных сахарным диабетом 1 и 2 типа с разной степенью развития сосудистых осложнений.

Иммуноферментные методы количественного определения растворимого фибрина и D-димера в плазме крови человека стали основой для создания соответствующих отечественных иммунотест-систем. Предполагается широкое применение даных тест-систем в медицинских учреждениях с диагностической целью.

Ключевые слова: фибрин, растворимый фибрин, фибрин-специфические моноклональные антитела, неоантигенная детерминанта, центр полимеризации фибрина, иммунодиагностическая тест-система для определения растворимого фибрина.

Lugovskaya N.E. The discovery of a neoantigenic determinant in fibrin molecule and the finding of its functional role. - Manuscript.

Dissertation for the PhD degree in Biology, speciality 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2010.

The thesis is devoted to the study of the antigenic structure of fibrin molecule, the investigation of fibrin polymerization mechanisms and carrying out of immunoenzyme method of soluble fibrin quantification in human blood plasma for diagnostics іn medicine.

The immunochemical properties of six various monoclonal antibodies obtained to human desAABB fibrin have been studied. High specificity and affinity of these monAbs to fibrin were shown. Previously nknown antigenic determinant in human fibrin molecule has been discovered which is situated in Bв118-134 fragment, exposed during fibrinogen transformation to desAA fibrin and destroyed on fibrin hydrolysis by plasmin. It has been shown for the first time that unknown site of fibrin polymerization, which takes part in the intermolecular binding of fibrin at the stage of protofibril lateral association is situated in Bв121-138 fragment. On the basis of one fibrin specific monAb double sandwich ELISA method for quantification of soluble fibrin in human blood plasma has been carried out. This method and double sandwich ELISA method for quantification of D-dimer in human blood plasma are tested now in clinics. These methods became the basis for designing immunodiagnostic test-systems for quantification of soluble fibrin and D-dimer in human blood plasma. The usage of these immunodiagnostic test-systems is planned in medicine.

Key words: fibrin, soluble fibrin, fibrin specific monoclonal antibodies, neoantigenic determinant, fibrin polymerization site, immunodiagnosis test-system for quantification of soluble fibrin.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми дисертації. Значна кількість патологічних станів в організмі людини супроводжується підвищеною активацією системи зсідання крові. Така активація призводить до утворення в кров'яному руслі тромбіну, який перетворює основний білок системи зсідання крові фібриноген на фібрин, здатний до спонтанної полімеризації [Wolberg A.S. et al., 2008]. Полімеризація фібрину відбувається шляхом міжмолекулярного зв'язування комплементарних центрів, утворених певними амінокислотними залишками. На сьогодні молекулярні механізми полімеризації фібрину повністю не з'ясовані. Невідомими залишаються кількість і точна локалізація всіх центрів полімеризації, особливо це стосується комплементарних центрів, які забезпечують латеральну асоціацію протофібрил [Yang Z. et al., 2000, Lounes K.C. et al., 2001, Sugo T. et al., 1999]. Виявлення локалізації невідомих раніше центрів міжмолекулярної взаємодії фібрину необхідне для більш глибокого розуміння механізмів полімеризації фібрину та формування його тривимірної сітки. Оскільки фібринова сітка є каркасом тромбів, пошуки нових центрів полімеризації фібрину є не тільки фундаментальною проблемою, але й актуальним завданням клінічної медицини [Matsuda M., 2001, Hanss M., 2001]. Полімеризація фібрину є прикладом самозбирання надмолекулярних структур у живих організмах, а отже, дослідження механізмів процесу полімеризації має загальнобіологічне значення [Луговской Э.В., 2003].

За останнє десятиріччя в Україні майже вдвічі збільшилось поширення хвороб системи гемостазу та смертність від них. Це такі тяжкі хвороби, як інсульт головного мозку, інфаркт міокарду, емболія легеневих артерій, ДВЗ-синдром та ін., які є наслідком аномальної активації системи зсідання крові, що призводить до внутрішньосудинного тромбоутворення. Тому сьогодні досить актуальними проблемами є профілактика, своєчасне виявлення та лікування цих патологій людини. Для діагностики захворювань системи гемостазу, а також для моніторингу ефективності їх лікування важливе значення має кількісне визначення в плазмі крові людини молекулярних маркерів, що характеризують стан системи зсідання крові. Одним із таких маркерів є розчинний фібрин, концентрація якого зростає при активації системи зсідання крові [Dempfle C.E., 1999]. Найбільш точним методом визначення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові є імуноферментний аналіз, заснований на використанні фібрин-специфічних моноклональних антитіл (монАТ). Такі антитіла повинні специфічно реагувати з розчинним фібрином без перехресної реакції з фібриногеном і з кінцевими продуктами розщеплення полімерного фібрину плазміном. Фібрин-специфічні монАТ можуть утворюватися завдяки появі неоантигенних детермінант, які формуються в процесі перетворення фібриногену на фібрин та здатні володіти певною функціональною активністю. Виявлення неоантигенних детермінант у молекулі фібрину необхідне для з'ясування її антигенної будови та для знаходження невідомих раніше центрів полімеризації, які можуть частково або повністю співпадати з такими детермінантами [Lugovskoi E.V., Komisarenko S.V., 2000].

В Україні не існує жодної імуноферментної тест-системи для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. Тому на сьогодні досить актуальним є отримання фібрин-специфічних монАТ, розробка з їх використанням імуноферментного методу кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини для створення на його основі вітчизняної тест-системи, яка б вигідно відрізнялась від декількох існуючих іноземних аналогів меншою вартістю та доступністю, не поступаючись їм при цьому в точності та надійності одержуваних результатів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України в рамках планів науково-дослідних робіт відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України: НДР 2.2.1.9 № 9 "Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів" (№ ДР 0199U000273 (1999-2003 р.р.) та № ДР 0104U003280 (2004-2008 р.р.)), НДР 2.2.1. № 15 "Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики та лікування", № ДР 0102U006218 (2002-2006 р.р.) та НДР 2.2.1. № 15 "Структурно-функціональний аналіз білків за норми та деяких патологій", № ДР 0107U007187 (2007-2011 р.р.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з використанням фібрин-специфічних моноклональних антитіл локалізувати неоантигенні детермінанти в молекулі фібрину, визначити їх можливу функціональну роль у процесі полімеризації фібрину та розробити імуноферментний метод визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Визначити імунохімічну характеристику моноклональних антитіл, одержаних до частково денатурованого фібрину desААВВ людини, та локалізувати епітопи для них у молекулі фібрину.

2. Дослідити вплив одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл та їх Fab-фрагментів на процес полімеризації фібрину за допомогою турбідиметричного аналізу та трансмісійної електронної мікроскопії.

3. Із застосуванням одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл розробити бісайтовий імуноферментний метод визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та апробувати його в клініці.

Об'єкт дослідження - фібрин, фібрин-специфічні моноклональні антитіла, розчинний фібрин.

Предмет дослідження - імунохімічні властивості одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл, локалізація в молекулі фібрину неоантигенної детермінанти, яка експонується при перетворенні фібриногену на фібрин; функціональна роль виявленої неоантигенної детермінанти фібрину в процесі його полімеризації. Розробка імуноферментного методу визначення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові людини та апробація даного методу в клініці.

Методи дослідження. Фібриноген виділяли з плазми крові людини методом фракційного висолювання Na₂SO₄. Фібрин desAA та фібрин desAABB одержували шляхом дії на фібриноген відповідно низьких та підвищених концентрацій тромбіну. D-димер виділяли з плазмінового гідролізату фібрину методом іонообмінної хроматографії на КМ-G50-сефарозі. Чистоту всіх одержаних білкових препаратів визначали методом електрофорезу в ПААГ із ДС-Na. Для одержання гібридом проводили злиття клітин селезінки імунізованих мишей з клітинами мієломи в присутності поліетиленгліколю. МонАТ із культурального середовища виділяли за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі та фібриноген-сефарозі. Зв'язування монАТ із різними білковими продуктами визначали за допомогою імуноферментного аналізу та імуноблотаналізу. Вплив монАТ та їх Fab-фрагментів на процес полімеризації фібрину визначали за допомогою турбідиметричного аналізу та трансмісійної електронної мікроскопії. Для математичної обробки одержаних результатів використовували методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що у фрагменті Вв118-134 фібрину людини знаходиться невідома раніше неоантигенна детермінанта, яка експонується при перетворенні фібриногену на фібрин desAA та зникає після гідролізу фібрину плазміном.

Вперше виявлено, що в суперспіральному фрагменті Вв121-138 фібрину людини знаходиться невідомий раніше центр полімеризації фібрину, який функціонує на стадії латеральної асоціації протофібрил.

Показано, що одержані до фібрину людини монАТ, епітопи для яких розташовуються у фрагменті фібрину Вв118-134, мають високу специфічність та афінітет до фібрину і є придатними для визначення з їх застосуванням концентрації розчинного фібрину в плазмі крові людини.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Відкриття невідомої раніше неоантигенної детермінанти у фрагменті Вв118-134 молекули фібрину, яка експонується при перетворенні фібриногену на фібрин і зникає після розщеплення полімерного фібрину плазміном, надало важливу фундаментальну інформацію щодо антигенної будови молекули фібрину.

Одержані дані щодо існування у фрагменті Вв121-138 фібрину людини невідомого раніше центру полімеризації, який бере участь у забезпеченні латеральної асоціації протофібрил фібрину, є важливими для з'ясування молекулярних механізмів полімеризації фібрину та утворення фібринового каркасу тромбів.

Із застосуванням одержаних фібрин-специфічних монАТ розроблено бісайтовий імуноферментний метод кількісного визначення в плазмі крові людини одного з найважливіших молекулярних маркерів активації системи зсідання крові - розчинного фибрину, можливість визначення якого має важливе значення для ранньої діагностики загрози тромбоутворення.

Клінічна апробація розробленого методу визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та розробленого раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України імуноферментного методу визначення D-димеру в плазмі крові людини довела їх важливе значення для діагностики стану системи зсідання крові, показала виражену кореляцію одержаних результатів із літературними даними та надала нову інформацію щодо вмісту розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові вагітних здорових та із загрозою переривання вагітності, хворих на артеріальну гіпертензію з різним ступенем розвитку ішемічної хвороби серця та хворих на цукровий діабет із різним ступенем розвитку судинних ускладнень. Дані методи стали основою для створення вітчизняних імунотест-систем для визначення розчинного фібрину й D-димеру в плазмі крові людини. Передбачається широке застосування даних тест-систем у медичних закладах.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено аналіз та узагальнення літературних даних за темою дисертації. Головна ідея та завдання дослідження сформульовані разом із науковим керівником - д.б.н., професором, академіком НАН і АМН України С.В. Комісаренком. Здобувач особисто проводила електрофорези, різні варіанти імуноферментних аналізів та імуноблотаналізів для імунохімічної характеристики одержаних до фібрину моноклональних антитіл та локалізації епітопів для них у молекулі фібрину, для дослідження молекулярної структури розчинного фібрину, а також для відбору чистих клонів гібридних клітин, які продукують необхідні монАТ. Автор проводила імуноферментні аналізи для розробки та апробації в клініці імуноферментного методу визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та розробленого раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України імуноферментного методу визначення D-димеру в плазмі крові людини. Дисертант виділяла такі білки, як фібриноген і фібрин desAABB людини. Фібрин desAA, D-димер фібрину, Х-фрагмент фібриногену та фібриноген-сефарозу автор одержувала разом із пров. інженером відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України Г.К. Гоголінською. Моноклональні антитіла, які використовувалися в дослідженні, були одержані к.б.н., ст. н. співр. відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України І.М. Колесніковою зі співробітниками. Автор брала участь в одержанні фібрин-специфічних монАТ на стадії виділення та підготовки антигену для імунізації мишей, у виявленні наявності очікуваних антитіл у сироватці мишей, у скринінгу одержаних гібридом за допомогою імуноферментного аналізу та у виділенні монАТ із культурального середовища. Турбідиметричні дослідження полімеризації фібрину в присутності фібрин-специфічних монАТ та їх Fab-фрагментів автор виконувала самостійно та разом із к.б.н., ст. н. співр. відділу структури та функції білка П.Г. Гриценком. Електронно-мікроскопічні дослідження проводилися під керівництвом к.б.н., ст. н. співр. групи електронної мікроскопії Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України В.І. Чернишова. Аналіз та узагальнення одержаних даних дисертант проводила разом із науковим керівником. Усі розділи дисертації написані автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Експериментальні дані дисертації були представлені на наступних конференціях: 8^th International Congress on Thrombosis, June 20-24, 2004, Ljubljana, Slovenia; XX^th Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, Australia, August 6 - 12, 2005; 20^th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11^th FAOBMB Congress in Kyoto, Japan, June 18-23, 2006; 18^th International Congress on Fibrinolysis

and Proteolysis in San Diego, USA, August 27-31, 2006; IX Український біохімічний з'їзд у м. Харкові, Україна, 24-27 жовтня 2006 р. (на з'їзді отримана грамота); конференція-конкурс робіт молодих вчених на здобуття стипендії імені видатних учених-біохіміків та стипендії дирекції Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, 2006 р. (усна доповідь, представлена робота отримала премію ім. В.О. Бєліцера); XXI^st Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis in Geneva, Switzerland, July 6-12, 2007; ІІІ Международная конференция „Фундаментальные науки - медицине”, Новосибирск, Россия - 2-8 сентября 2007; XX^th International Fibrinogen Workshop in Venice, Italy, July 10-13, 2008; XXIInd Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis in Boston, USA, July 11-16, 2009; загальноінститутські семінари та засідання Вченої ради Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За результатами, представленими в дисертації, опубліковано 7 статей у фахових виданнях, 1 патент та 9 тез у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, яка включає опис методів досліджень, викладення результатів та їх обговорення, заключної частини, висновків і списку використаних літературних джерел, який налічує 298 посилання. Робота викладена на 171 сторінці машинописного тексту, містить 1 таблицю та 36 рисунків.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури висвітлено та узагальнено сучасні погляди на структуру молекули фібриногену, механізми його перетворення на фібрин під дією тромбіну; утворення, діагностичну роль і методи визначення в плазмі крові людини розчинного фібрину; механізми полімеризації фібрину; розщеплення полімерного фібрину плазміном, утворення D-димеру та його діагностичну роль і методи визначення в плазмі крові людини.

Матеріали та методи досліджень. Фібриноген виділяли із плазми крові людини методом фракційного висолювання Na₂SO₄ [Варецкая Т.В., 1960]. Фібрин desAABB отримували за допомогою підвищених концентрацій тромбіну [Belitser V.A. et al., 1968]. Фібрин desAA одержували, використовуючи низькі концентрації тромбіну [Lougovskoi Е.V. et al., 1999]. Активний плазмін (КФ.3.4.21.7.) одержували шляхом активації плазміногену стрептокіназою (Varidase RN, "Lederle", Німеччина). D-димер виділяли з плазмінового гідролізату фібрину методом іонообмінної хроматографії на КМ-G50-сефарозі. Х-фрагмент фібриногену виділяли з плазмінового гідролізату фібриногену за допомогою гель-фільтрації на сефадексі G-200. Чистоту всіх одержаних білкових препаратів визначали методом електрофорезу в ПААГ з ДС-Na [Schдgger H. et al., 1987]. Для одержання гібридом проводили злиття клітин селезінки імунізованих мишей лінії BALB/c із клітинами мієломи (X63-Ag8.6.5.3, "Flow Laboratories", Англія) в присутності поліетиленгліколю [Kцhler G. et al., 1975]. МонАТ з культурального середовища виділяли за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі (“Pharmacia”, Швеція) та фібриноген-сефарозі. Fab-фрагменти монАТ одержували шляхом гідролізу монАТ папаїном (КФ.3.4.22.2) та виділяли за допомогою афінної хроматографії на протеїн-G-сефарозі (Amersham Biosciences, Швеція). Зв'язування монАТ із різними білковими продуктами визначали за допомогою непрямого твердофазного імуноферментного аналізу, бісайтового твердофазного імуноферментного аналізу та імуноблотаналізу (вестерн-блот аналіз) [Tsang V.C.W., 1983]. Константи афінності монАТ при їх взаємодії з фібрином desAABB та фібрином desAA визначали за допомогою непрямого конкурентного твердофазного імуноферментного аналізу [Friguet B., 1980] з поправкою на бівалентність монАТ [Stevens F. J., 1987]. Ізотип монАТ визначали з застосуванням козиних антисироваток до ізотипів імуноглобулінів миші (“Clinical Credential; ICN Immunobiologicals”, Lisle, IL, США). Вплив монАТ, їх Fab-фрагментів та синтетичних пептидів на процес полімеризації мономерного фібрину desAA, фібрину desAABB та фібрину, одержаного в системі фібриноген+тромбін визначали за допомогою турбідиметричного аналізу [Hantgan R., 1980]. Дослідження полімеризації фібрину, що утворюється в системі фібриноген+тромбін у присутності або за відсутності фібрин-специфічних монАТ та їх Fаb-фрагментів проводили також за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (електронний мікроскоп H-600, "Hitachi", Japan). Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою загальноприйнятих методів [Кокунин В.А., 1975].

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Імунохімічна характеристика моноклональних антитіл, одержаних до фибрину людини. Виявлення невідомої раніше неоантигенної детермінанти в молекулі фібрину.

Для одержання монАТ, специфічних до фібрину людини, за допомогою гібридомної технології як антиген нами було використано фібрин desААВВ людини, частково денатурований за допомогою 2 М сечовини. В результаті було одержано шість гібридом (1-3С-7С, 1-2С, I-3С-2В, I-4А, II-5А та IА-5С), які продукують монАТ, що належать до ізотипу IgG2а та специфічно реагують із фібрином людини без перехресної реакції з фібриногеном і D-димером (рис. 1).

Для кожного з одержаних фібрин-специфічних монАТ було визначено константи дисоціації (K_D) у їх реакціях із фібрином desААВВ та фібрином desАА, які показали високий афінітет даних монАТ до фібрину та можливість їх використання для визначення концентрації розчинного фібрину в діапазоні, який може спостерігатися в крові людини як у нормі, так і при різних патологічних станах (від 0,01 мкмоль/л до 1 мкмоль/л) (табл. 1).

Таблиця 1. Значення K_D в реакціях зв'язування монАТ із фібрином desААВВ та фібрином desАА, обчислені за допомогою непрямого конкурентного т-ІФА за методом Friguet із поправкою на бівалентність монАТ за Stevens.

Для визначення здатності до зв'язування одержаних монАТ із антигенами, які знаходяться в розчині, було проведено бісайтовий т-ІФА з використанням фібриногену, фібринів desAA та desAABB, Х-фрагменту фібрину, Х-фрагменту фібриногену, D-димеру фібрину та D- і Е-фрагментів фібриногену. Результат показав, що всі шість одержаних фібрин-специфічних монАТ добре реагують із фібрином desAA та desAABB людини, слабше - з Х-фрагментом фібрину та не реагують із фібриногеном, Х-фрагментом фібриногену та кінцевими продуктами плазмінового гідролізу фібриногену й фібрину (рис. 2).

Одержані результати свідчать про високу придатність одержаних монАТ для створення на їх основі імунохімічних методів визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини, а також про те, що епітопи для даних антитіл експонуються при перетворенні фібриногену на фібрин desAA та зникають після розщеплення фібрину плазміном.

Конкурентний імуноферментний аналіз показав, що всі шість одержаних фібрин-специфічних монАТ сильно конкурують за місце зв'язування на фібриновій молекулі, а отже, епітопи для даних антитіл у молекулі фібрину співпадають або частково перекриваються один з одним (рис. 3).

З метою локалізації епітопів для одержаних монАТ у молекулі фібрину було проведено імуноблотаналіз із використанням як антигенів фібрину desААВВ, D-димеру та t-NDSK фібрину, відновлених -меркаптоетанолом. Результат показав, що всі шість монАТ реагують лише з Вв-ланцюгом фібрину desААВВ і не реагують із жодним із поліпептидних ланцюгів t-NDSK й D-димеру фібрину (Рис. 4).

Враховуючи те, що -ланцюг фібрину включає амінокислотні залишки В15-461, а -ланцюги D-димеру та t-NDSK фібрину - В15-118 та В134-461 відповідно, було зроблено висновок про те, що епітопи (або їх основні структурні частини) для всіх шести одержаних монАТ розташовуються у фрагменті фібрину В118-134. Даний фрагмент знаходиться в суперспіральній області молекули фібрину між його D- і Е-доменами (рис. 5).

Наявність значної реакції одержаних монАТ із фібрином desАА та фібрином desААВВ і відсутність їх реакції з фібриногеном та з кінцевими продуктами плазмінового гідролізу фібриногену й фібрину, а також результати проведеного імуноблотаналізу вказують на те, що у фрагменті В118-134 фібрину людини розташовується невідома раніше неоантигенна детермінанта, яка експонується при перетворенні фібриногену на фібрин desAA в результаті структурних внутрішньомолекулярних перебудов, що виникають після тромбінового відщеплення фібринопептидів А від молекули фібриногену. Виявлена неоантигенна детермінанта зникає при гідролізі фібрину плазміном, коли розщеплюються пептидні зв'язки в суперспіральному регіоні Вв122-134 між D- і Е-доменами молекули фібрину. Цікаво, що при такому розщепленні експонується розташована поруч інша неоантигенна детермінанта у фрагменті фібрину Вв134-190, де знаходиться епітоп для одержаних раніше у відділі молекулярної імунологіі Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України D-димер-специфічних монАТ III-3b [Lugovskoy Е.V, 2003], які ми використовуємо для визначення D-димеру в плазмі крові людини.

Таким чином, два процеси, що йдуть один за іншим, - перетворення фібриногену на фібрин під дією тромбіну та руйнування фібрину плазміном - супроводжуються послідовними структурними перебудовами молекули з експонуванням неоантигенних детермінант у фрагментах фібрину Вв118-134, наступним їх руйнуванням і виникненням неоантигенних детермінант у найближчих фрагментах фібрину Вв134-190.

Було показано, що одержані монАТ здатні реагувати як із стабілізованим, так і з нестабілізованим фактором XIIIа фібрином. Завдяки здатності до реакції зі стабілізованим фактором XIIIа фібрином, дані антитіла можуть бути використані в медичній практиці для локалізації та усунення тромбів всередині судин.

Отже, нами було досліджено імунохімічні властивості шести видів монАТ, одержаних до фібрину desAABB людини, та показано їх високу специфічність та афінітет до фібрину. З'ясовано, що всі шість фібрин-специфічних монАТ є придатними для розробки на їх основі імунохімічних методів визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. Виявлено невідому раніше неоантигенну детермінанту в молекулі фібрину людини, яка знаходиться у фрагменті фібрину Вв118-134, експонується при перетворенні фібриногену на фібрин desAA та руйнується після гідролізу фібрину плазміном.

Виявлення невідомого раніше центру полімеризації в суперспіральній ділянці молекули фібрину, який бере участь у забезпеченні латеральної асоціації протофібрил.

Для встановлення функціональної ролі виявленої нами неоантигенної детермінанти в молекулі фібрину ми дослідили вплив одержаних фібрин-специфічних монАТ, епітопи для яких розташовуються у фрагменті фібрину Вв118-134, та їх Fab-фрагментів на процес полімеризації фібрину за допомогою турбідиметричного аналізу та трансмісійної електронної мікроскопії.

Результати, одержані при дослідженні полімеризації фібрину, що утворюється в системі фібриноген+тромбін, та полімеризації мономерних фібринів desAA і desAABB були подібними та вказували на те, що всі одержані фібрин-специфічні монАТ при їх еквімолярному співвідношенні до фібрину знижують максимальну швидкість полімеризації фібрину на 60-80 %, зменшують кінцеву мутність згустку, яка співвідноситься з товщиною фібрил, приблизно на 50 %, та не змінюють lag-період, який відповідає часу побудови протофібрил (рис. 6).

Електронно-мікроскопічні дослідження показали, що при полімеризації фібрину в присутності одержаних фібрин-специфічних монАТ утворюються значно тонші фібрили, ніж у контролі через однаковий проміжок часу (рис. 7 (а, б)). Ці дані вказують на те, що дані антитіла в процесі полімеризації фібрину інгібують стадію латеральної асоціації протофібрил.

Для виключення можливості інгібування одержаними монАТ процесу полімеризації фібрину за рахунок створення стеричних перешкод було проведено турбідиметричне та електронно-мікроскопічне дослідження полімеризації фібрину за присутності Fab-фрагментів даних антитіл. Результати показали, що Fab-фрагменти фібрин-специфічних монАТ також із високою специфічністю інгібують полімеризацію фібрину, зменшуючи максимальну швидкість полімеризації фібрину та кінцеву мутність згустку на 60 % і 50 % відповідно (рис. 6). Це свідчить про те, що ефект інгібування даними монАТ полімеризації фібрину визначається не стеричною перешкодою, а блокуванням центру полімеризації, який співпадає з епітопами для монАТ-інгібіторів, що розташовані у фрагменті Вв118-134 фібрину, або знаходиться поруч із ними.

За присутності в середовищі полімеризації Fab-фрагментів одержаних монАТ спостерігається суттєве збільшення лаг-періоду, яке визначається утворенням дуже довгих протофібрил фібрину, що майже не вступають у латеральну асоціацію через блокування моновалентними Fab-фрагментами центрів латеральної асоціації протофібрил (рис. 7, в). За присутності монАТ лаг-період не збільшується, оскільки в даному випадку, ймовірно, врівноважуються два процеси: бівалентні монАТ одночасно з блокуванням центрів латеральної асоціації протофібрил та гальмуванням їх асоціації можуть взаємодіяти з двома молекулами фібрину, які належать різним протофібрилам, сприяючи таким чином їх латеральній асоціації.

Отже, одержані дані підтверджують те, що фібрин-специфічні монАТ в процесі полімеризації фібрину інгібують стадію латеральної асоціації протофібрил, а також вказують на те, що у фрагменті Вв118-134 фібрину людини, де знаходяться епітопи для монАТ-інгібіторів, частково або повністю розташований невідомий раніше центр полімеризації, який бере участь у забезпеченні латеральної асоціації протофібрил.

З метою підтвердження даних, одержаних із використанням фібрин-специфічних монАТ та їх Fab-фрагментів, було проведено турбідиметричне дослідження інгібіторної активності синтетичного пептиду, який імітує амінокислотну послідовність фібрину B121-138, яка практично співпадає з амінокислотною послідовністю виявленої неоантигенної детермінанти. Було показано, що даний пептид специфічно інгібує полімеризацію фібрину в системі фібриноген+тромбін та мономерного фібрину desААВВ, а саме, концентрація пептиду, при якій максимальна швидкість полімеризації фібрину зменшується на 50 %, дорівнює 3,0110^-4 М в системі фібриноген+тромбін та 1,8810^-4 М при полімеризації мономерного фібрину desААВВ.

Отже, експериментальні дані, одержані з використанням фібрин-специфічних монАТ та вказаного синтетичного пептиду, дозволили зробити висновок про те, що в суперспіральному регіоні молекули фібрину B121-138 знаходиться центр полімеризації, який бере участь у міжмолекулярних взаємодіях фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил. Даний центр може функціонувати одночасно з центрами латеральної асоціації протофібрил, які знаходяться в 350-360 і 370-380 фрагментах D-доменів фібрину [Yang Z. et al., 2000].

Новий імуноферментний метод кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. Апробація в клініці даного методу та розробленого раніше імуноферментного методу кількісного визначення D-димеру в плазмі крові людини.

Розчиннй фібрин є одним із найголовніших молекулярних маркерів активації системи зсідання крові, яка веде до загрози тромбоутворення. Він являє собою димери, тримери та олігомери фібрину desАА, на кінцях яких можуть розташовуватися молекули фібриногену або фібрину desА. На даний час кількісне визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини має найбільше значення для діагностики передтромботичних станів, ДВЗ-синдрому та моніторингу антитромботичної терапії. Найточнішим методом визначення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові людини є імуноферментний аналіз, що базується на використанні фібрин-специфічних монАТ. Епітопи для таких антитіл мають знаходитися в неоантигенних детермінантах, що формуються в процесі перетворення фібриногену на фібрин.

Для розробки твердофазного бісайтового імуноферментного методу кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини було застосовано одержані фібрин-специфічні монАТ 1-3С-7С, які в подальшому вирішено називати як FnI-3C (рис. 8).

У даному методі ми застосували монАТ FnI-3C як зв'язуючі (кетч-) антитіла, а як вторинні (тег-) антитіла - одержані раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України монАТ II-4d, епітоп для яких знаходиться в NH₂-кінцевому фрагменті г-ланцюга D-домену фібрин(оген)у. Було показано, що в умовах розробленого методу фібриноген та інші білки плазми крові практично не впливають на зв'язування фібрин-специфічних монАТ FnI-3C зі своїм епітопом у молекулі фібрину при розведенні плазми крові в десять разів (рис. 9).

Розроблений метод нами було апробовано паралельно з розробленим раніше у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України імуноферментним методом визначення D-димеру в плазмі крові людини на плазмі крові пацієнтів із патологіями, за яких могла відбуватися активація системи зсідання крові. Одночасне застосування обох методів дає можливість отримувати інтегральну інформацію щодо стану системи зсідання крові та визначати ризик тромбоутворення.

Відомо, що при вагітності може відбуватися активація системи зсідання крові [Hellgren M., 2003, Kline J. A. et al., 2005], а стан загрози перериваня вагітності досить часто супроводжується тромбофілією [Brenner B., 2004, Rey E. et al., 2003].

За допомогою зазначених імуноферментних методів було досліджено вміст розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові вагітних здорових та із загрозою переривання вагітності на різних її термінах. Було показано існування позитивної кореляції між концентрацією D-димеру та терміном вагітності як у нормі, так і при загрозі переривання вагітності (рис. 10).

Середні значення концентрації D-димеру в плазмі крові пацієнток на одних і тих самих термінах нормальної та патологічної вагітності були однаковими.

Кількість розчинного фібрину в усіх вагітних була підвищеною. Вперше було показано достовірне збільшення концентрації розчинного фібрину у вагітних жінок із загрозою переривання вагітності (17,87±3,15 мкг/мл, n=13) у порівнянні зі здоровими вагітними (9,03±1,58 мкг/мл n=17) у період з 4-го по 24-й тиждень вагітності (рис. 11).

За допомогою імуноблотаналізу фосфатних висолів розчинного фібрину з плазми крові досліджуваних вагітних із використанням монАТ 2d-2a, епітоп для яких в молекулі фібрину включає розщеплюваний тромбіном зв'язок B14-15, було показано, що основним компонентом розчинного фібрину в плазмі крові вагітних як у нормі так і при загрозі переривання вагітності є фібрин desАА, нестабілізований фактором XIIIа (рис. 12).

Відомо, що артеріальна гіпертензія є важливим фактором ризику розвитку серцево-судинних захворювань, причиною яких у більшості випадків є тромбози кровеносних судин. Тому моніторинг стану системи зсідання крові хворих на артеріальну гіпертензію має важливе значення для діагностики та прогнозування тромбоутворення. Наші дослідження показали лише тенденцію до підвищення вмісту розчинного фібрину в плазмі крові хворих на гіпертонічну хворобу відповідно до ступеня розвитку ішемічної хвороби серця, в той час як вміст D-димеру в досліджуваній плазмі крові помірно зростав пропорційно до ступеня розвитку ішемічної хвороби. Таким чином, в досліджуваних пацієнтів фібринолітична система справлялася з незначною активацією системи зсідання крові, яка спостерігалася при розвитку ішемічної хвороби серця на фоні артеріальної гіпертензії.

Відомо, що цукровий діабет супроводжується активаційним станом системи зсідання крові та підвищеним ризиком розвитку серцево-судинних захворювань [Амосова Е.Н. и др., 2009, Томашевська О.Я. та ін., 2006]. За допомогою розроблених методів було досліджено вміст розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові хворих на цукровий діабет 1 і 2 типу із судинними ускладненнями різного ступеня. Було показано, що в плазмі крові хворих на цукровий діабет із початковими функціональними судинними ускладненнями концентрація розчинного фібрину достовірно зростає в 5,5 разів у порівнянні зі здоровими донорами, D-димеру - в 2,1 рази. В пацієнтів із судинними ускладненнями середнього ступеня - в 12,5 і 3,0 рази, а в пацієнтів із тяжкими органічними ураженнями судин - в 43,2 і 6,6 разів відповідно (рис. 13). Таким чином, у хворих на цукровий діабет було виявлено сильну активацію системи зсідання крові та показано, що збільшення концентрації розчинного фібрину та D-димеру в них позитивно корелює зі ступенем розвитку судинних уражень. Отже, одержані дані дозволили зробити висновок про те, що рівень розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові хворих на цукровий діабет може бути важливим діагностичним показником наявності судинних уражень, які призводять до розвитку різних серцево-судинних захворювань, ангіонейропатій, ретинопатій, нефропатій та ін.

Отже, нами було розроблено твердофазний бісайтовий імуноферментний метод визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та проведено його апробацію в клініці разом із апробацією імуноферментного методу визначення D-димеру в плазмі крові людини. Проведена апробація показала виражену кореляцію одержаних результатів із літературними даними та надала нову інформацію щодо вмісту розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові вагітних

здорових та із загрозою переривання вагітності, хворих на гіпертонічну хворобу із різним ступенем розвитку ішемічної хвороби серця та хворих на цукровий діабет 1 і 2 типу з різним ступенем розвитку судинних уражень. Імуноферментні методи визначення розчинного фібрину та D-димеру стали основою для створення вітчизняних імунотест-систем для визначення розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові людини. Передбачається широке застосування даних тест-систем в клінічних закладах із діагностичною метою.

ВИСНОВКИ

фібрин кров моноклональний

Структура молекули фібрину та механізми його полімеризації досліджуються вже багато років, однак недостатньо вивченими залишаються питання про антигенну будову молекули фібрину, а також про точну кількість і локалізацію в його молекулі всіх центрів полімеризації, насамперед центрів латеральної асоціації протофібрил. Розчинний фібрин є одним із найважливіших молекулярних маркерів активації системи зсідання крові та загрози тромбоутворення, а найточнішим методом його визначення в плазмі крові людини є імуноферментний аналіз. Проте, у нашій країні відсутні імуноферментні тест-системи для кількісного визначення розчинного фібрину. Із використанням одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл нами вперше було виявлено невідому раніше неоантигенну детермінанту в суперспіральному фрагменті Вв118-134 молекули фібрину людини, показано існування у фрагменті Вв121-138 фібрину невідомого раніше центру полімеризації, який фінкціонує на стадії латеральної асоціації протофібрил, та розроблено й апробовано в клініці твердофазний бісайтовий імуноферментний метод кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини.

1. Досліджено імунохімічні властивості шести видів моноклональних антитіл, одержаних у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України до фібрину desAABB людини, та показана їх висока специфічність і афінітет до фібрину.

2. Виявлено, що у фрагменті Вв118-134 молекули фібрину людини, де розташовані епітопи для шести одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл, знаходиться невідома раніше неоантигенна детермінанта, яка експонується при перетворенні фібриногену на фібрин desAA та зникає після розщеплення фібрину плазміном.

3. Показано, що в суперспіральній ділянці молекули фібрину у фрагменті Вв121-138 розташований невідомий раніше центр полімеризації, який бере участь у міжмолекулярному зв'язуванні фібрину на стадії латеральної асоціації протофібрил.

4. Із використанням одержаних фібрин-специфічних моноклональних антитіл FnI-3C розроблено твердофазний бісайтовий імуноферментний метод кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини та апробовано його в клініці разом із розробленим раніше імуноферментним методом кількісного визначення D-димеру на плазмі крові вагітних здорових та із загрозою переривання вагітності, хворих на артеріальну гіпертензію із різним ступенем розвитку ішемічної хвороби серця, а також хворих на цукровий діабет із різним ступенем розвитку судинних ускладнень.

5. Виявлено, що середні значення концентрації розчинного фібрину є достовірно більшими у вагітних із загрозою переривання вагітності, ніж у здорових вагітних у період із 4-го по 24-й тиждень вагітності. З'ясовано, що основним компонентом розчинного фібрину плазми крові здорових вагітних і вагітних із загрозою переривання вагітності є фібрин desAA, не стабілізований фактором XIIIа.

6. Виявлено, що при цукровому діабеті 1 і 2 типу відбувається активація системи зсідання крові, яка проявляється збільшенням вмісту розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові досліджуваних пацієнтів, що позитивно корелює зі ступенем розвитку судинних ускладнень. Таким чином, рівень розчинного фібрину та D-димеру в плазмі крові людини може бути важливим діагностичним показником судинних уражень при цукровому діабеті.

7. Розроблений імуноферментний метод визначення концентрації розчинного фібрину в плазмі крові людини ліг в основу створення вітчизняної імунотест-системи для кількісного визначення розчинного фібрину в плазмі крові людини. Передбачається широке застосування даної тест-системи в клінічних закладах із діагностичною метою.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Количественное определение D-димера и растворимого фибрина в плазме крови человека при ишемической болезни сердца и гипертонической болезни / Э.В. Луговской, И.Н. Колесникова, Н.Э. Луговская, Л.М. Литвинова, П.Г. Гриценко, Г.К. Гоголинская, Е.Д. Ляшко, Е.П. Костюченко, Г.А. Ремизовский, В.Н. Педченко, С.В. Комисаренко // Укр. биохим. журн. 2004. 76, №6. С. 136141.

2. Растворимый фибрин и D-димер при нормально протекающей беременности и при угрозе её прерывания / Э.В. Луговской, И.Н. Колесникова, Н.Э. Луговская, П.Г. Гриценко, Л.М. Литвинова, Г.К. Гоголинская, Е.Д. Ляшко, Е.П. Костюченко, В.Я. Голота, В.В. Курочка, С.В. Комисаренко // Укр. биохим. журн. 2006. 78, №4. С. 120129.

3. Молекулярный состав растворимого фибрина и продуктов расщепления фибрина. Методы их количественного определения / Э.В. Луговской, П.Г. Гриценко, Н.Э. Луговская, И.Н. Колесникова, С.В. Комисаренко // Трансфузиология и гематология. 2006. №5. С. 3943.

4. Розчинний фібрин. Молекулярна структура і кількісне визначення / Е.В. Луговськой, П.Г. Гриценко, Н.Е. Луговська, І.Н. Колеснікова, С.В. Комісаренко // Лабораторна діагностика. 2006. 3, №37. С. 1117.

5. Моноклональні антитіла, специфічні до фібрину людини / І. М. Колеснікова, Н.Е. Луговська, Е.В. Луговськой, П.Г. Гриценко, К.Д. Ляшко, Г.К. Гоголінська, Л.М. Литвинова, О.П. Костюченко, С.В. Комісаренко // ДАН України. 2006. № 9. С. 170-174.

6. A neoantigenic determinant in coiled coil region of human fibrin -chain / E.V. Lugovskoy, P.G. Gritsenko, I.N. Kolesnikova, N.E. Lugovskaya, S.V. Komisarenko // Thromb. Res. - 2009. - V. 123. - Р. 765770.

7. Растворимый фибрин и D-димер как молекулярные маркеры сосудистых осложнений у больных сахарным диабетом / Э.В. Луговской, Д.А. Ефимов, П.Г. Гриценко, И.Н. Колесникова, Н.Э. Луговская, Л.М. Литвинова, Е.П. Костюченко, А.С. Ефимов, С.В. Комисаренко // ДАН України. 2009. №12. С. 170174.

8. Пат. 87375 Україна. МПК (2009) С12N 5/20 C07K 16/36 (2009.01). Штам гібридомних тваринних клітин Mus musculus L., що культивуються та продукують моноклональні антитіла, специфічні до фібрину людини / Комісаренко С.В., Колеснікова І.М., Луговськой Е.В., Ляшко К.Д., Гриценко П.Г., Литвинова Л.М., Костюченко О.П., Луговська Н.Е., Гоголинська Г.К.; заявник та патентновласник Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. - № а200712284 ; заявл. 06.11.07 ; опубл. 10.07.09, Бюл. №13.

9. D-dimer and soluble fibrin at ischemic heart disease and acute impairment cerebral circulation / E.V. Lugovskoy, I.N. Kolesnikova, P.G. Gritsenko, N.E. Lugovskaya, S.V. Komisarenko // Аbstracts of 18^th International Congress on Thrombosis, June 20-24, 2004, Ljubljana, Slovenia, - Р. 104.

10. Molecular composition of soluble fibrin at various diseases and fibrinolysis products reacting with D-dimer-specific monoclonal antibody III-3b / P.G. Gritsenko, N.E. Lugovskaya, E.V. Lugovskoy, I.N. Kolesnikova, S.V. Komisarenko // Аbstracts of XX^th Congress The International Society on Thrombosis and Haemostasis in Sydney, Australia, August 6-12, 2005. Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2005. - V. 3. - Р. 1985.