Структура белков. Методы гибридизации

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Глутатион (2-амино-5-{ [2 - [ (карбоксиметил) амино] - 1- (меркаптометил) - 2-оксоэтил] амино}-5-оксопентаноевая кислота - это трипептид г-глутамилцистеинилглицин. Глутатион содержит необычную пептидную связь между амино-группой цистеина и карбокси-группой боковой цепи глутамата. Важность глутатиона в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. Фактически глутатион не только защищает клетку от таких токсичных агентов, как свободные радикалы, но и в целом определяет редокс-статус внутриклеточной среды. [1]

В клетке тиоловые группы находятся в восстановленном состоянии (SH) в концентрации около 5 мМ. Фактически, такая высокая концентрация глутатиона в клетке приводит к тому, что он восстанавливает любую дисульфидную связь (S-S), образующуюся между цистеинами цитозольных белков. При этом восстановленная форма глутатиона GSH превращается в окисленную GSSG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктаза, которая постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе. Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень внутриклеточной токсичности (уровень оксидативного стресса).

Суммарный заряд в указанных средах положительный.

2. Полиаланин и полиизолейцин могут образовывать альфа-спиральные конфигурации, при этом образование первого витка альфа-спирали может организовываться спиральная форма различных аминокислотных, например, 12-мерного полиаланина, полноценные витки спирали всегда наблюдались лишь после Asp.

3. Первичная структура каждого индивидуального белка закодирована в молекуле ДНК (участке, называемом геном) и реализуется в ходе транскрипции (переписывания информации на мРНК) и трансляции (синтез пептидной цепи).

Каждый из 50 000 индивидуальных белков организма человека имеет уникальную для данного индивидуального белка первичную структуру. Все молекулы индивидуального белка (например, альбумина) имеют одинаковое чередование аминокислотных остатков, отличающее альбумин от любого другого индивидуального белка.

Последовательность аминокислотных остатков в пептидной цепи можно рассматривать как форму записи некоторой информации.

Эта информация диктует пространственную укладку длинной линейной пептидной цепи в более компактную трехмерную структуру.

Линейные полипептидные цепи индивидуальных белков за счет взаимодействия функциональных групп аминокислот приобретают определенную пространственную трехмерную структуру, или конформацию. В глобулярных белках различают два основных типа конформации пептидных цепей: вторичную и третичную структуры.

Вторичная структура белков

Вторичная структура белков - это пространственная структура, образующаяся в результате взаимодействий между функциональными группами пептидного остова. При этом пептидная цепь может приобретать регулярные структуры двух типов: ос-спирали и р-структуры.

В ос-спирали водородные связи образуются между атомом кислорода карбоксильной группы и водородом амидного азота пептидного остова через 4 аминокислоты; боковые цепи аминокислотных остатков располагаются по периферии спирали, не участвуя в образовании водородных связей, формирующих вторичную структуру.

Большие объемные остатки или остатки с одинаковыми отталкивающимися зарядами препятствуют формированию а-спирали.

Остаток пролина прерывает а-спираль благодаря его кольцевой структуре и невозможности образования водородной связи из-за отсутствия водорода у атома азота в пептидной цепи.

B-Структура формируется между линейными областями одной полипептидной цепи, образуя при этом складки, или между разными полипептидными цепями. Полипептидные цепи или их части могут формировать параллельные (N - и С-концы взаимодействующих пептидных цепей совпадают) или антипараллельные (N - и С-концы взаимодействующих пептидных цепей лежат в противоположных направлениях) р-структуры.

В белках также встречаются области с нерегулярной вторичной структурой, которые называются беспорядочными клубками, хотя эти структуры не так сильно изменяются от одной молекулы белка к другой.

4. Белки выполняют множество самых разнообразных функций, характерных для живых организмов, с некоторыми из которых мы познакомимся более подробно при дальнейшем изучении курса. Ниже рассматриваются главные и в некотором смысле уникальные биологические функции белков, несвойственные или лишь частично присущие другим классам биополимеров.

Каталитическая функция. К 1995 г. было идентифицировано более 3400 ферментов. Большинство известных в настоящее время ферментов, называемых биологическими катализаторами, является белками. Эта функция белков, хотя и не оказалась уникальной, определяет скорость химических реакций в биологических системах.

Транспортная функция. Дыхательная функция крови, в частности перенос кислорода, осуществляется молекулами гемоглобина - белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Ряд других сывороточных белков образует комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы-мишени.

Защитная функция. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунная система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков-антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов, вирусов или чужеродных белков. Высокая специфичность взаимодействия антител с антигенами (чужеродными веществами) по типу белок-белковое взаимодействие способствует узнаванию и нейтрализации биологического действия антигенов. Защитная функция белков проявляется и в способности ряда белков плазмы крови, в частности фибриногена, к свертыванию. В результате свертывания фибриногена образуется сгусток крови, предохраняющий от потери крови при ранениях.

Сократительная функция. В акте мышечного сокращения и расслабления участвует множество белковых веществ. Однако главную роль в этих жизненно важных процессах играют актин и миозин - специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам цитоскелета, что обеспечивает тончайшие процессы жизнедеятельности клеток (расхождение хромосом в процессе митоза).

Структурная функция. Белки, выполняющие структурную (опорную) функцию, занимают по количеству первое место среди других белков тела человека. Среди них важнейшую роль играют фибриллярные белки, в частности коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, коже, эластин в сосудистой стенке и др. Большое значение имеют комплексы белков с углеводами в формировании ряда секретов: мукоидов, муцина и т.д. В комплексе с липидами (в частности, с фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клеток.

Гормональная функция. Обмен веществ в организме регулируется разнообразными механизмами. В этой регуляции важное место занимают гормоны, синтезируемые не только в железах внутренней секреции, но и во многих других клетках организма (см. далее). Ряд гормонов представлен белками или полипептидами, например гормоны гипофиза, поджелудочной железы и др. Некоторые гормоны являются производными аминокислот.

Питательная (резервная) функция. Эту функцию выполняют так называемые резервные белки, являющиеся источниками питания для плода, например белки яйца (овальбумины). Основной белок молока (казеин) также выполняет главным образом питательную функцию. Ряд других белков используется в организме в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ, регулирующих процессы метаболизма.

Можно назвать еще некоторые другие жизненно важные функции белков. Это, в частности, экспрессия генетической информации, генерирование и передача нервных импульсов, способность поддерживать онкотическое давление в клетках и крови, буферные свойства, поддерживающие физиологическое значение рН внутренней среды, и др.

5. Уридин, урацилрибозид, органическое вещество, нуклеозид, состоящий из остатков пиримидинового основания урацила и углевода рибозы. Белый порошок либо длинные игло- или призмоподобные кристаллы. Растворим в воде, кислотах, щелочах, нерастворим в эфире, концентрированном этаноле; молярная масса 244,2. Присутствует во всех живых клетках в составе рибонуклеиновых кислот. Играет важную роль в углеводном обмене, входя в состав многих коферментов.

Уридин

Уридиловая кислота

Псевдоуридиловая кислота:

6. Фрагмент одной цепочки ДНК содержит следующую последовательность нуклеотидов:

ГЦТГТАГГАТ. Какую последовательность содержит фрагмент комплементарной цепочки этой же молекулы.

ГЦТГТАГГАТ

АТЦАЦГААГЦ

структура белок нуклеотид цепочка

7.

Метод блот-гибридизации по Э. Саузерну

Метод предложен в 1975 г. Суть его заключается в том, что геномная ДНК подвергается расщеплению и образующиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламизном геле. После электрофореза ДНК денатурируют и переносят с геля на плотный носитель. Перенос осуществляют за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. После авторадиографии определяют положение искомого фрагмента ДНК на электрофореграмме. Блот-гибиридизация - высокочувствительный, но дорогостоящий и трудоемкий метод выявления специфических последовательностей ДНК.

Метод нозерн-блот-гибридизации - Nothern-blot

Метод используется для определения уровня экспрессии гена путем количественной оценки иРНК. Метод сложен и длителен по выполнению (5-7 суток). Трудности связаны с необходимостью блокировать при выделении РНК так называемые РНКазы, которые чрезвычайно стабильны и устойчивы по отношению к многим химическим процедурам, применяемым при экстракции РНК.

Процедуры блот-гибридизации по Э. Саузерну и нозерн-блот-гибридизации не нашли рутинного применения в клинической микробиологии, поскольку они трудоемки. Точками приложения данных методов явились задачи, связанные с проведением научных исследований и задач по изучению геномной структуры ДНК (РНК), а также для выявления точечных мутаций.

Метод гибридизации in situ (ISH - in situ hybridizationlSH - in situ hybridization)

Метод основан на проведении процессов гибридизации непосредственно на срезе или в мазке с использованием любых зондов. Частная методика гибридизации in situ - FISH (fluorescent in situ hybridization), позволяет установить наличие патогена в препаратах, фиксированных в формалине, и залитых парафином срезах и пунктатах ткани, что особенно важно при патоморфологическом анализе. Метод гибридизации in situ базируется на основных принципах гибридизации твердофазной и гибридизации в растворе. Чувствительность метода гибридизации in situ ограничена возможностью проникновения зондов внутрь клеток для связывания с искомой мишенью. Процесс гибридизации проходит в тканях, при этом зонд снабжен флуоресцентной меткой. После промывки материала и удаления несвязавшихся молекул осуществляется детекция, для чего мазок или срез просматривают в флуоресцентном микроскопе. Метод ISH сложен для осуществления и по сравнению с другими молекулярными методами малочувствителен. Метод наиболее удобен для определения мишеней, например, вирусов в инфицированных клетках, которые представлены большим числом копий.

Метод разветвленной ДНК (branch-DNA)

Искомая нуклеиновая кислота связывается с улавливающим зондом, один конец которой комплементарен мишени, а другой - определенному концу усиливающего зонда. При этом усиливающий зонд может быть комплементарен следующему зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофорами, которые по мере увеличения количества связанных зондов усиливают (хеми-, флуоро-) люминесценцию. Преимуществом данного метода является возможность использования в одной реакции нескольких улавливающих и связывающихся с мишенью зондов, что обеспечивает выявление агентов, характеризующихся значительной геномной гетерогенностью, например, вирус иммунодефицита человека.

В последнее время в практике нашел применение метод гибридизации в растворе с зондами, меченными акридином. Результаты гибридизации регистрируют по испусканию меткой света определенной длины волны после обработки щелочью.

В настоящее время ведутся интенсивные разработки по совершенствованию методов гибридизации в следующих направлениях.

1. Упрощение процедуры генного зондирования до одной - двух стадий процесса.

2. Отказ от сорбции на мембране.

3. Повышение чувствительности гибридизационных методов за счет использования процедуры амплификации сигнала с зонда.

Активные разработки по третьему направлению стали возможными лишь с момента появления и внедрения в практику методов амплификации нуклеиновых кислот.

Существует большое количество методов амплификации нуклеиновых кислот, но в данной главе будут рассмотрены лишь те, которые уже применяются в лабораторной диагностической практике, а также перспективные в практическом отношении.

По сути, все методы амплификации имитируют природную возможность репликации ДНК. При этом in vitro происходит изолированное умножение гена или его фрагментов (амплификация) в миллионы раз.

М.А. Чернески предложил подразделить все методы амплификации, применяемые в клинической практике, в зависимости от технологии на три основные категории.

1. Амплификация мишени, в частности метод ПЦР, самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей (3SR), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ).

2. Амплификация с использованием QB-peпликазы, лигазная цепная реакция (ЛЦР).

3. Амплификация сигнала, при которой усиление сигнала каждой молекулы зонда происходит за счет использования сложных зондов или технологии разветвленной ДНК.

Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от изменения температурных режимов на:

1) методы амплификации с циклической сменой температурных параметров: (методы ПЦР, ЛЦР и их модификации);

2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот (метод изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающая репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.

Все методы амплификации состоят из трех основных этапов (рис.25.3).

1. Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из клеток.

2. Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК (РНК).

3. Детекция продуктов ПЦР, полученных на втором этапе.

Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из клеток

Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать. Пробо-подготовка проводится также для удаления из полученного материала ингибиторов Taq-ДНК-полимеразы (гемоглобина и др.) и различных РНКаз. Обработка проб проводится в микроцентрифужных пробирках типа "Эппендорф" объемом 1,5 мл. Время обработки в зависимости от метода доходит до 3-4 ч. Выбор метода обработки зависит как от вида возбудителя, так и от вида клинического материала.

Разработан целый ряд методов для выделения ДНК (РНК) из клеток:

Метод выделения ДНК одношаговый (РНК) с использованием "Tri reagent"

Материал (соскоб из уретры, цервикального канала) переносится в пробирки "Эппендорф" с 500 мкл 0,9% раствора хлорида натрия и центрифугируется при 5000 об. /мин в течение 10 мин дважды с заменой супернатанта 0,9% раствором NaCl. Затем осадок обрабатывают лизирующим раствором - раствор "Tri reagent" фирмы Sigma (США) с добавлением детергентов (рН 8,0) и инкубируют при +95°С в термостате или кипящей водяной бане в течение 10 мин. Затем центрифугируют для осаждения нелизируемых клеточных структур и капель жидкостей на стенках пробирки. Разработаны различные варианты "Trireagent" в зависимости от исследуемого материала. Для выделения монослойной ткани, клеток, культур клеток рекомендуется использовать Tri reagent. Для выделения ДНК (РНК) из цельной крови, плазмы или сыворотки используется Tri reagent BD. A Tri reagent LS применяют для выделения нуклеиновых кислот из жидких материалов, таких как клеточные суспензии, цереброспинальная и амниотическая жидкости.

Метод выделения ДНК (РНК) путем термического лизиса в присутствии сорбента

Вместо лизирующего раствора для лизиса клеток применяется высокая температура. В пробу добавляют катиониты, которые связывают белки, и кипятят на водяной бане в течение 5-10 мин. Полученный материал готов для исследования.

Метод выделения ДНК (РНК) с помощью фенольно-спиртовой депротеинезации

Данный метод получил широкое распространение, и его модификации используются в качестве основных способов экстракции ДНК (РНК).

Реактивы.

1. Гуанидинизотиоцианат.

2.0,1 М Трис-HCl буфер с рН 6,4.

3.0,2 М раствор ЭДТА с рН 8,0.

4. Тритон XI00.

5. Суспензия сорбента: 60 г оксида кремния (SiO₂) суспендируют в 500 мл дистиллированной воды, оставляют на 24 ч при комнатной температуре. Удаляют 440 мл надосадочной жидкости и вносят в колбу 500 мл деионизированной дистиллированной воды, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 5 ч. Удаляют 440 мл надосадочной жидкости и вносят в колбу 0,6 мл соляной кислоты (32% вес/объём) для доведения рН до 2,0.

6. Отмывающий раствор: 120 г гуанидинизотиоцианата растворяют в 100 мл 0,1 М трис-НСI буфера с рН 6,4.

7. Элюирующий буфер: 10 мМ трис-НСI - 1 мМ ЭДТА (рН 8,0).

8. Фенол.

8. В-ДНК и родственные ей C-ДНК, D-ДНК и T-ДНК принадлежат В-семейству двойных спиралей. В B-форме, как и в А-форме, спираль ДНК является правой. У этого семейства фуранозные кольца имеют конформацию С2'-эндо (или близкую ей С3'-экзо), расстояние между соседними фосфатами увеличивается до 7 А, а угол, описывающий вращение вокруг гликозидной связи С1'-N, оказывается в области - ак, в диапазоне - 90. - 120 град.

В В-ДНК на виток спирали приходится около 10 пар оснований и расстояние между нуклеотидами вдоль оси спирали составляет от 3,3 до 3,4 А. В результате у оснований наблюдается лишь небольшой отрицательный наклон - 6 град. Эти характеристики и определяют макроскопическую структуру В-ДНК, представленную на Рис. B-ДНК.

Шаг = 33,8 А

Расстояние между остатками = 3,38А

Угол спирального вращения = 36,0 град

Ширина желобков = 5,7А

Глубина = 8,5А

9. Структура и функции витамина D

Витамин Д

Структура Витамином D называют несколько соединений (эргокальциферол - D2, холекальциферол - D3) близких по химической структуре и обладающих способностью регулировать фосфорнокальциевый обмен. Как уже говорилось выше, витамин был открыт Гоулендом Хопкинсоном в 1922 г., после чего было доказано, что для проявления биологической активности витамина D последний проходит два этапа превращения с образованием его активных метаболитов.

Первый этап превращения витамина осуществляется главным образом в печени. Этим органом поглощается из кровотока до 70% витамина D, который распределяется по клеткам печени - ретикулоцитам и гепатоцитам. Превращение витамина D в его первый активный метаболит (25-окси-D) осуществляется в гепатоцитах. Ретикулоциты по отношeнию к витамину выполняют роль депо, откуда он постепенно транспортируется в гепатоциты. Такое распределение витамина D по клеткам печени осуществляется только при достаточном обеспечении организма этим витамином и имеет глубокий физиологический смысл.

Во-первых, накопление витамина D в ретикулоцитах обеспечивает поддержание в организме необходимого уровня его активных форм в течение 2-3 месяцев.

Во-вторых, такое распределение витамина по клеткам печени создает оптимальные условия для его превращения в 25-окси-D, т.к. активность ферментов, которые регулируют этот процесс, ингибируется самим витамином. При накоплении в гепатоцитах значительных количеств витамина D процент образования его активных форм будет уменьшаться, поэтому его одноразовая доза не должна более чем в 10 раз превышать физиологическую дозу, то есть 5000 ME.

Образовавшаяся в печени первая активная форма витамина D переносится с помощью транспортных белков в почки, где подвергается дальнейшему превращению с образованием гормонально активных соединений, среди которых наиболее важное физиологическое значение имеют два метаболита - 1,25-диоксихолекальциферол и 24,25-диоксихолекальциферол. При этом необходимо учитывать, что различные биологически активные формы витамина D принимают участие в регуляции одних и тех же процессов, но на разных его звеньях. Например, 1, 25-диоксихолекальциферол регулирует транспорт минеральных компонентов в кишечнике и их мобилизацию из скелета, а 24, 25-диоксихолекальциферол ответственен за транспорт минеральных компонентов в клетки костной ткани, а также он повышает чувствительность клеток к 1, 25-диоксихолекальцифе-ролу. Поэтому для регуляции физиологических процессов в организме очень важным фактором является наличие определенного соотношения основных метаболитов витамина D.

В последние годы показано, что способностью синтезировать метаболиты витамина D обладают клетки многих органов и тканей. При этом в клетках, находящихся в очаге воспаления, по сравнению со здоровыми клетками этого же органа, отмечается локальное повышение концентрации активных метаболитов витамина D, что имеет выраженный защитный характер. Так, при туберкулезе 1, 25-диоксихолекальциферол подавляет размножение микобактерий и ускоряет созревание альвеолярных макрофагов; при перитоните, активируя макрофаги, он способствует очистке очага воспаления.

Содержание в продуктах питания

Выяснилось, что восполнить в полной мере недостаток в витамине D за счет продуктов питания нельзя. Согласно литературным данным зарубежных витаминологов, содержание витамина D в продуктах питания незначительно. Так, в расчете на 100 г в печени животных содержится до 50 ME витамина, в яичном желтке - 25 ME, в говядине - 13 ME, в кукурузном масле - 9 ME, в сливочном масле - до 35 ME, в коровьем молоке - от 0, 3 до 4 ME на 100 мл. Суточная потребность в витамине составляет 400-500 ME, поэтому даже при полноценной диете потребность организма в витамине не может быть полностью обеспечена. Именно этими факторами и объясняется необходимость дополнительного применения препаратов витамина D на всем протяжении жизни.

10. В тех случаях, когда мультиэнзимный комплекс обслуживает единственный, многоступенчатый процесс биохимических преобразований, его называют метаболоном (от слова метаболизм - обмен веществ). Такие метаболоны гликолиза, биосинтеза шеренги аминокислот, цикла дикарбоновых и трикарбоновых кислот и пр.

В результате слаженного в времени и просторы действия всех трех видов входных в его состав ферментов мультиэнзим с огромной скоростью осуществляет преобразование пировиноградной кислоты. Именно в кооперативном характере каталитического процесса и кроется главное различие биокатализаторов от катализаторов неорганической природы, именно потому интенсивность биокатализа в десятки, сотни и тысячи раз превосходить мощность действия неорганических катализаторов.

Сравнительно недавно выявленная еще одна своеобразная черта в строении ферментов: некоторые с их являются полифункциональными, т.е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего-навсего одной полипептидной цепью. Справа в тем, что эта единственная цепь при формировании третичной стручок-туры образует несколько функционально и стерически обособленных глобулярных участков - доменов, каждый с которых характеризуется своей каталитической активностью.

При изучении мультиэнзимных комплексов и полифункциональных ферментов получилась понять наиболее важную особенность ферментативного катализа, а именно - эстафетную передачу промежуточных продуктов реакции от одного компонента каталитической системы к другого без их освобождения.

11. Тиомктовая кислотам (англ. Thioctic acid; синонимы: липоевая кислота, альфа-липоевая кислота) - лекарственное средство из группы витаминов. Является важным кофактором пируватдегидрогеназного и альфа-кетоглутаратдегидрогеназного комплексов. Обладает антиоксидантными свойствами.

Светло-жёлтый кристаллический порошок горьковатого вкуса. Нерастворим в воде (натриевая соль растворима) и растворим в этаноле.

Липоевая кислота

Способствует снижению концентрации глюкозы в крови и увеличению гликогена в печени, а также преодолению инсулинорезистентности. По характеру биохимического действия близка к витаминам группы В.

Никотинамидадениндинуклеотидфосфамт (НАДФ, NADP) - широко распространённый в природе кофермент некоторых дегидрогеназ - ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции в живых клетках. NADP принимает на себя водород и электроны окисляемого соединения и передаёт их на другие вещества. В хлоропластах растительных клеток NADP восстанавливается при световых реакциях фотосинтеза и затем обеспечивает водородом синтез углеводов при темновых реакциях. NADP, - кофермент, отличающийся от NAD содержанием ещё одного остатка фосфорной кислоты, присоединённого к гидроксилу одного из остатков D-рибозы, обнаружен во всех типах клеток.

12.

Размещено на Allbest.ru