Біохімічні ефекти впливу наночастинок на прокаріотичні та еуріотичні клітини

Синтез і характеристика наночастинок золота різного розміру. Дослідження взаємодії наночастинок з пухлинними клітинами та особливостей їх впливу на структурний стан ДНК. Розподіл золота в органах і тканинах щурів за умов внутрішньовенного введення.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык украинский
Дата добавления 16.07.2012
Размер файла 62,3 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

РЄЗНІЧЕНКО ЛЮДМИЛА СЕРГІЇВНА

УДК 577.15.0014:577.352.2

БІОХІМІЧНІ ЕФЕКТИ ВПЛИВУ НАНОЧАСТИНОК ЗОЛОТА НА ПРОКАРІОТИЧНІ ТА ЕУКАРІОТИЧНІ КЛІТИНИ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 2010

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі колоїдної технології природних систем Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України.

Науковий керівник - доктор хімічних наук, професор УЛЬБЕРГ Зоя Рудольфівна, директор Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, завідувач відділу колоїдної технології природних систем.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор МАТИШЕВСЬКА Ольга Павлівна, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка;

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник МІНЧЕНКО Олександр Григорович, заступник директора Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, завідувач відділу молекулярної біології.

Захист відбудеться «17» травня 2010 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (01601 Київ, вул. Леонтовича, 9).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розіслано «15» квітня 2010 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Кірсенко.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення особливостей впливу наночастинок металів на біохімічні процеси прокаріотичних та еукаріотичних клітин є актуальним завданням сучасної біохімії. Його вирішення відкриває нові перспективи як у фундаментальному розумінні дії наночастинок металів на стан та функціональну активність клітин, так і в практичному ефективному їх застосуванні у біотехнології [West J.L. et al., 2000; Li H. et al., 2004; Chah S. et al., 2005; Aslan K. et al., 2004; Aaron J. et al., 2008; Letfullin R.R. et al., 2006; Ozin G. et al., 2009], медицині та ветеринарії [Bawa R., 2008; Sahoo S.K. et al., 2007; Chen Po.C. et al., 2008; Lee J.S. et al., 2008; Moghimi S.M. et al., 2005; Vlerken L.E. et al., 2006; Cai W. et al., 2008].

Серед усього різноманіття існуючих наночастинок металів особливої уваги заслуговують наночастинки золота [Chen Po.C. et al., 2008; Zharov V.P. et al., 2006; Щербаков А.Б. и др., 2007]. В останнє десятиріччя кількість експериментальних робіт, присвячених їх медико-біологічному застосуванню, зростає в геометричній прогресії [Chen Po.C. et al., 2008]. Такий значний інтерес викликаний перспективністю використання наночастинок золота у технологіях конструювання високоефективних засобів діагностики та цільової терапії, зокрема онкологічних захворювань [Fu W. et al., 2005; Hainfeld J.F., 2006; Cai Q.Y. et al., 2007]. Увага дослідників головним чином зосереджена на вивченні біологічних ефектів впливу наночастинок золота на клітинному рівні [Feng L. et al., 2009; Zhang S. et al., 2009; Pan Y. et al., 2007].

Однак, незважаючи на інтенсивні дослідження останніх років, відомості щодо біохімічних ефектів впливу наночастинок золота на прокаріотичні та еукаріотичні клітини є досить обмеженими і суперечливими.

Так, відсутні дані щодо особливостей впливу наночастинок золота різного розміру на бактеріальні клітини штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів імунобіологічних препаратів, що є актуальним для біотехнології.

Що стосується біохімічних ефектів впливу наночастинок золота на еукаріотичні клітини, існують лише поодинокі дані щодо інгібуючого впливу наночастинок золота середнього розміру 9 нм на активність ізоферментів цитохрому Р450 [Sereemaspun A. et al., 2008]. Дані щодо впливу наночастинок золота на інші ферментні системи відсутні.

Щодо токсичності наночастинок золота - існують суперечливі дані. Так, в роботі [Goodman C.M. et al., 2004] по визначенню токсичності наночастинок золота у концентраціях 0,38 - 3 мкМ по відношенню до двох типів еукаріотичних та одного типу прокаріотичних клітин зазначається виражена цитотоксичність катіонних наночастинок золота порівняно з аніонними, однак в інших роботах [Connor E.E. et al., 2005; Shukla R. et al., 2005] повідомляється про відсутність токсичного впливу наночастинок золота.

У зв'язку з вище викладеним вивчення біохімічних ефектів впливу наночастинок золота на прокаріотичні та еукаріотичні клітини є нагальним та актуальним.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена дисертаційна робота відноситься до пріоритетних напрямків досліджень, відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу колоїдної технології природних систем Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України (зав. - д.х.н., професор Ульберг З.Р.): тема № 2.16.1.7, Державний реєстраційний номер 0107U008520 «Дослідження колоїдно-хімічних і молекулярних механізмів біотрансформації ультрадисперсних фаз металів в клітинних і біомінеральних системах»; Проект «Молекулярні механізми взаємодії, транспорту та трансформації наночастинок в біологічних системах як основа створення засобів цільової терапії» програми «Наноструктурні системи, наноматеріали, нанотехнології» (розділ «Біонаносистеми») (№ Державної реєстрації 0108V005964) - 2008-2009 рр.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи полягала в оцінці біохімічних ефектів впливу наночастинок золота різного розміру на прокаріотичні та еукаріотичні клітини.

Відповідно до поставленої мети в роботі вирішувалися такі завдання:

синтез і характеристика наночастинок золота різного розміру;

вивчення впливу наночастинок золота на Н+-АТР-азну активність, в-лактамазну активність та проникність клітинної оболонки бактеріальних клітин штамів-пробіонтів (Escherichia coli Г 35-№1-413 та Enterococcus faecalis Г 35-№4-410) та виробничих штамів - продуцентів імунобіологічних препаратів (Escherichia coli №4, 19, 20, 24, 25, 57);

дослідження взаємодії наночастинок золота з пухлинними клітинами лінії U937 та особливостей впливу наночастинок золота на структурний стан ДНК клітин лінії U937 та СНО-К1; Na+,К+-АТР-азну, Mg2+-АТР-азну активності мембранної фракції та лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції клітин лінії U937;

вивчення впливу наночастинок золота на співвідношення білкових фракцій плазми крові (альбумінів, б-, в-, г-глобулінів) щурів у нормі та за умов перещепленої карциноми Герена, резистентної до цисплатину;

дослідження розподілу наночастинок золота в органах і тканинах піддослідних щурів за умов внутрішньовенного введення.

Об'єкт дослідження - вплив наночастинок золота різного розміру на прокаріотичні та еукаріотичні клітини.

Предмет дослідження - біохімічні ефекти впливу наночастинок золота різного розміру на бактеріальні клітини штамів-пробіонтів і виробничих штамів-продуцентів імунобіологічних препаратів; на пухлинні клітини гістіоцитарної лімфоми людини та пухлинні клітини перещепленої карциноми Герена, резистентної до цисплатину.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої в роботі мети були використані методи препаративної, аналітичної та фізичної біохімії; молекулярної біології; колоїдної хімії; статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено системні дослідження біохімічних ефектів впливу наночастинок золота розміром 10, 20, 30 і 45 нм на активність мембранозв'язаних та цитозольних ферментів прокаріотичних і еукаріотичних клітин; на співвідношення білкових фракцій крові щурів у нормі та за умов перещепленої карциноми Герена, резистентної до цисплатину. Вперше проведено визначення розподілу синтезованих наночастинок золота розміром 20 нм в органах і тканинах щурів.

Внаслідок проведених експериментів вперше отримано такі результати:

- наночастинки золота розміром 30 і 45 нм на 20-40 % підвищують Н+-АТР-азну активність мембранної фракції бактеріальних клітин та на 30-50 % в-лактамазну активність клітин E. сoli.

- встановлена здатність наночастинок золота розміром 20 і 30 нм стабілізувати клітинну оболонку як грампозитивних (Enterococcus faecalis), так і грамнегативних (Escherichia coli) бактеріальних клітин.

- наночастинки золота здатні проникати всередину пухлинних клітин лінії U937 (гістіоцитарної лімфоми людини), при цьому наночастинки розміром 10 і 20 нм переважно локалізуються у вакуолях, а наночастинки 30 і 45 нм - у лізосомах пухлинних клітин лінії U937.

- концентраційний оптимум взаємодії наночастинок золота з пухлинними клітинами лінії U937 складає 0,1-1,0 нг металу на одну клітину; максимум зв'язування наночастинок золота пухлинними клітинами досягається протягом 3-5 хв.

- наночастинки золота розміром 30 і 45 нм не впливають на структурний стан ДНК клітин лінії СНО-К1 (клітин яєчника китайського хом'ячка) та пухлинних клітин лінії U937, а наночастинки розміром 10 і 20 нм здатні ушкоджувати структурний стан ДНК обох типів клітин.

- наночастинки золота розміром 10 нм на 70% інгібують Na+,K+-АТР-азну активність мембранної фракції та у 4-4,5 разів стимулюють лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937, а наночастинки розміром 30 нм на 20-40% підвищують Na+,K+-АТР-азну та у 1,5-2,5 рази - лактатдегідрогеназну активність фракцій цього типу клітин.

- у досліджених органах щурів у нормі вміст золота не фіксується ані через 1 годину, ані через 24 години після внутрішньовенного введення 1 мл препарату наночастинок розміром 20 нм у концентрації 38,6 мкг/мл за металом. У щурів з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину, виявлено накопичення наночастинок золота в пухлинах як через 1 годину, так і через 24 години після внутрішньовенного введення.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані сприяють поглибленню уявлень щодо взаємодії прокаріотичних та еукаріотичних клітин з наноматеріалами та з наночастинками золота зокрема.

Здатність наночастинок золота залежно від їх розміру впливати на деякі біохімічні показники у бактеріальних клітинах свідчить про перспективність застосування наночастинок золота певних розмірів у біотехнології як протекторів та стимуляторів культуральних, репродуктивних та біологічних властивостей виробничих штамів бактерій.

Виявлена висока афінність наночастинок золота до пухлинних клітин є науковим підґрунтям для нанотехнологій конструювання засобів діагностики і цільової доставки фармацевтичних препаратів на основі наночастинок золота.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною роботою автора. Головна ідея і напрям досліджень сформульовані здобувачем спільно з науковим керівником. Автором дисертаційної роботи здійснено аналіз літератури, виконано весь обсяг експериментальних досліджень та статистичну обробку отриманих результатів. Узагальнення, інтерпретацію, формулювання основних положень і висновків роботи було проведено разом із науковим керівником.

Всі розділи дисертації та її автореферат написані автором самостійно.

Частину експериментів було проведено спільно з к.б.н., н.с. Дибковою С.М. (вплив наночастинок золота на структурний стан ДНК); к.мед.н., с.н.с. Шпильовою С.І. (культивування культури клітин лінії U937); провідним інженером Паніною З.О. та к.ф.-мат.н., с.н.с. Горчевим В.Ф. (візуалізація наночастинок золота та їх взаємодії з прокаріотичними та еукаріотичними клітинами); к.б.н., с.н.с. Тодором І.М. та інженером Трембач Л.В. (перещеплення штамів пухлин лабораторним тваринам, внутрішньовенне введення наночастинок золота та декапітація тварин), к.ф.-м.н., м.н.с. Максимчуком О.Г. (атомна абсорбція зразків органів і тканин лабораторних щурів).

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, викладені у дисертаційній роботі, представлено та обговорено на 10 вітчизняних та міжнародних наукових конференціях і симпозіумах: Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology (December 14-16, 2006, Kyiv, Ukraine); X Міжнародна науково-практична конференція студентів, аспірантів та молодих вчених "Екологія. Людина. Суспільство" (16-21 травня, 2007, Київ, Україна); Конференція "Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2007" (7-8 червня, 2007, Київ, Україна); ІІ міжнародна конференція молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (19-21 листопада 2007, Харків, Україна); German-Ukrainian Symposium on Nanoscience and Nanotechnology (September 22-25, 2008, Essen, Germany); Міжнародна науково-практична конференція «Сучасні проблеми біотехнології, стандартизації та забезпечення контролю якості ветеринарних препаратів, кормів та кормових добавок», присвячена 10-річчю Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (жовтень 2008, Київ, Україна); Всеукраїнська конференція молодих вчених «Сучасне матеріалознавство, матеріали та технології» (12-14 листопада 2008 року, Київ, Україна); E-MRS Spring meeting - 2009 (за результатами участі диплом «European materials research society young scientist award») (June 8-12, 2009 Strasbourg, France); Научная конференция «Химическая биология - фундаментальные проблемы бионанотехнологии» (10-14 июня 2009, Новосибирск, Россия); VII Parnas conference on Biochemistry and Molecular Biology (October 3-7, 2009, Yalta, Crimea, Ukraine).

Результати роботи було представлено на Міжінститутському семінарі в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України.

Публікації. За матеріалами дисертації опублікована 21 наукова праця, а саме 9 статей у провідних вітчизняних фахових виданнях, 1 патент України на корисну модель та 11 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій і симпозіумів.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із «вступу», розділів: «огляд літератури», «матеріали та методи досліджень», «результати досліджень та їх обговорення», «заключного розділу», «висновків» та «списку використаних джерел», який містить 203 посилання. Робота викладена на 148 сторінках друкованого тексту, містить 1 таблицю та 37 рисунків.

наночастинка золото клітина щур

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Огляд літератури

Огляд літератури cкладається з чотирьох розділів. У першому розділі детально проаналізовано методи синтезу, фізико-хімічні характеристики, вплив функціоналізації поверхні на біосумісність наночастинок золота та дані щодо їх токсичності. У другому розділі представлені існуючі уявлення щодо структурних компонентів клітинної оболонки, відповідальних за зв'язування наночастинок золота золотофільними бактеріями, та біохімічних ефектів впливу наночастинок золота на бактеріальні клітини. У третьому розділі проаналізовані відомості щодо імовірних механізмів потрапляння наночастинок золота в еукаріотичні клітини; їх циркуляції, розподілу та елімінації в організмі, а також значення цього типу наночастинок для діагностики і онкотерапії.

Матеріали та методи дослідження

Наночастинки золота синтезували за методом Девіса [Перцов А.В., 1976] шляхом відновлення аурату калію ацетоном або етанолом. Вихідною речовиною слугувала золотохлористоводнева кислота H[AuCl4]•4H2O. Концентрація отриманих препаратів наночастинок золота складала 38,6 мкг/мл за металом відповідно для кожного розміру наночастинок.

Візуалізація наночастинок золота та їх контактної взаємодії з клітинами виконана методами лазерно-кореляційної спектрометрії (Zetasizer-3, «Malvern Instruments Ltd», Великобританія); трансмісійної електронної мікроскопії (JEM-1230, «JEOL», Японія); скануючої електронної мікроскопії (JSM-35C «JEOL», Японія) та конфокальної мікроскопії (LSM 510 META «Carl Zeiss», Німеччина).

Стабільність отриманих наночастинок золота в модельних системах крові визначали за методикою [Горбачук В.В. и др., 2001] за зміною положення, інтенсивності та форми піка абсорбції в області спектру 500-560 нм з інтервалом 10 нм після 30 хв інкубації наночастинок золота з розчинами модельних систем. У якості модельних систем крові було обрано комерційні препарати: фізіологічний розчин для ін'єкцій, плазмозамінник «Реополіглюкін» та плазмозамінник «Стабізол».

Методи роботи з бактеріальними клітинами. В роботі були використані бактеріальні культури штамів-пробіонтів Escherichia coli Г 35-№1-413 і Enterococcus faecalis Г 35-№4-410, а також виробничі штами Escherichia coli - продуценти вакцин проти коліентеротоксемії худоби: штами №№ 4, 19, 20, 24, 25 і 57. Культури отримані з колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів (м. Київ).

Ліофілізацію мікроорганізмів проводили за методикою [Пушкарь Н.С. и др., 1984]. Зразки ліофілізували на лотках із використанням ліофільної сушки ALPHA 1-4 LD-2 (Німеччина) протягом 24 год із попереднім виморожуванням при -70 0С протягом 24 год. Процес ліофілізації вважали завершеним при вмісті залишкової вологи не більш ніж 3%. Ліофілізат клітин зберігали при -20 0С.

Виділення мембранної фракції із бактеріальних клітин проводили за методикою [Карамушка В.И. и др., 1990] шляхом обробки суспензії клітин ультразвуком з подальшим центрифугуванням. Отримані препарати мембран бактеріальних клітин кількісно характеризували за вмістом білка, визначеного методом Лоурі [Lowry O.H. et al., 1951]. У якості стандартного білку для побудови калібрувальної кривої використовували бичачий сироватковий альбумін (BSA).

Величину Н+-АТР-азної активності (К.Ф. 3.6.3.6) мембранної фракції бактеріальних клітин реєстрували за накопиченням неорганічного фосфату (Рі), концентрацію якого в середовищі визначали методом Фіске-Суббароу [Варбанец Л.Д. и др., 2006]. Наночастинки золота вносили у середовище білка мембранної фракції та інкубували суміш протягом 3 хв. Кінцеві концентрації наночастинок золота складали 0,0125 - 0,2 мкг металу/мкг білку. Визначення ферментативної активності проводили у середовищі інкубації (об'єм - 1 мл): 10 мМ Трис-HCl, 3 мМ MgCl2, 3 мМ АТР (рН=7,5) [Карамушка В.И. и др., 1990]. Кількість мембранного білка - 15-20 мкг. Реакцію ініціювали введенням до середовища інкубації аліквоти мембранної фракції і зупиняли додаванням 1 мл 10% розчину трихлороцтової кислоти.

Проникність клітинної оболонки бактеріальних культур штамів-пробіонтів оцінювали за вмістом у зовнішньому середовищі клітинних метаболітів, які поглинають світло при довжині хвилі л 250-280 нм [Грузина Т.Г. и др., 2002].

в-лактамазну активність штаму-пробіонту E. сoli Г 35-№1-413 визначали йодометричним тестом [Эйдельштейн М.В., 2001].

Методи роботи з клітинними лініями та лабораторними тваринами. У дослідженнях використовували пухлинні клітини лінії U937 - клітинну лінію гістіоцитарної лімфоми людини з колекції Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України та клітини лінії СНО-К1 - яєчника китайського хом'ячка - з колекції Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів. Експерименти були проведені також на білих нелінійних самцях та самках лабораторних щурів із середньою вагою 180-230 г з віварію Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Усі досліди на тваринах проводились відповідно до «Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях».

Пухлинні клітини лінії U937 культивували у середовищі RPMI 1640, що містило 10% ембріональної телячої сироватки при 370С у СО2-інкубаторі у атмосфері 5% СО2 до титру 5•106 клітин/мл. Життєздатність клітин оцінювали з використанням 0,4% водного розчину трипанового синього. Кількість живих клітин під час проведення експериментів складала не менш ніж 90%.

Клітини лінії СНО-К1 нарощували на середовищі F10, що містило 5% ембріональної сироватки великої рогатої худоби при 370С у СО2-інкубаторі у атмосфері 5% СО2 до титру 5·105 клітин/мл. Кількість живих клітин, визначених за допомогою фарбування 0,3% розчином трипанового синього, складала не менш ніж 90%.

Ефективність взаємодії еукаріотичних пухлинних клітин U937 з наночастинками золота оцінювали методом мембранного фільтрування шляхом визначення зміни оптичної щільності фільтратів, отриманих при фільтруванні суміші наночастинок золота певного розміру з відповідною кількістю клітин лінії U937 через мембранні фільтри з діаметром пор 0,45-0,5 мкм. Визначення проводили за умов, коли кінцеві концентрації клітин складали 103, 104, 105, 106 клітин/мл при постійній кінцевій концентрації наночастинок золота - 12,7 мкг/мл за металом. Кінетику контактної взаємодії пухлинних клітин з наночастинками золота різного розміру визначали шляхом оцінки кількості зв'язаного золота в інкубаційній суміші через 1, 3, 5, 15 та 25 хвилин після внесення наночастинок до суспензії клітин. Кінцева концентрація пухлинних клітин становила 106 клітин/мл, наночастинок золота - 12,7 мкг/мл за металом.

Вплив наночастинок золота на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин оцінювали методом лужного гель-електрофорезу ізольованих еукаріотичних клітин «ДНК-комет» за методикою [Didenko V., 2002] у відношенні до еукаріотичних клітин обох типів. Оцінку структурного стану ДНК проводили після інкубації клітин у кінцевій концентрації 106 клітин/мл з наночастинками золота, кінцева концентрація яких становила (об'єм проби 100 мкл): для наночастинок золота розміром 10 нм - 11,06 мкг/мл та 11,06·10-5 мкг/мл; розміром 20 нм - 11,0 мкг/мл та 11,0·10-5 мкг/мл розміром 30 нм - 14,0 мкг/мл та 14,0·10-5 мкг/мл; розміром 45 нм - 38,6 мкг/мл та 38,6·10-5 мкг/мл за металом. Інкубацію здійснювали при 370С. Час інкубації наночастинок, обґрунтований даними електронної мікроскопії, складав: з клітинами СНО-К1 - 30 хв; з клітинами U937 - 5 хв.

Виділення цитозольної та мембранної фракцій пухлинних клітин лінії U937 проводили за методикою [Маянский Н.А. и др., 2004]. Отримані препарати клітинних фракцій характеризували за вмістом білку по методу Лоурі. У якості стандартного білку для побудови калібрувальної кривої використовували бичачий сироватковий альбумін (BSA).

Визначення Na+,K+-АТР-азної активності (К.Ф. 3.6.1.3) мембранної фракції клітин лінії U937 проводили за методом [Прохорова М.И., 1982]. Визначення проводили при 37 0С у середовищі інкубації наступного складу (об'єм - 1 мл, кількість мембранного білка - 15-20 мкг): 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 20 мМ KCl, 3 мМ АТР (рН=7,5). Тривалість інкубації - 10 хвилин. Вміст фосфору визначали за методом Фіске-Суббароу [Варбанец Л.Д. и др., 2006]. Визначення Mg2+-АТР-азної активності (К.Ф. 3.6.1.3) мембранної фракції клітин лінії U937 проводили за тих самих умов, але в присутності у середовищі інкубації 100 мкМ оуабаїну. Оцінку впливу наночастинок золота на ферментативну активність проводили шляхом преінкубації протягом 3 хв білку мембранної фракції (кінцева концентрація 150-200 мкг) з наночастинками золота у кінцевій концентрації 0,11-1,1 мкг/мл за металом.

Лактатдегідрогеназну активність (К.Ф. 1.1.1.27) цитозольної фракції клітин лінії U937 оцінювали спектрофотометрично за швидкістю окислення НАДН при довжині хвилі 340 нм за методикою [Прохорова М.И., 1982]. Середовище інкубації містило (об'єм проби - 3,15 мл): 50 мМ К-фосфатний буфер, 0,3 мМ піруват-Na та 9 мМ НАДН (рН 7,5). Оцінку впливу наночастинок золота на ферментативну активність проводили шляхом преінкубації протягом 3 хв білку цитозольної фракції (кінцева концентрація 150-200 мкг) з наночастинками золота у кінцевій концентрації 0,15-1,2 мкг/мл за металом.

Перещеплення карциноми Герена, резистентної до цисплатину піддослідним щурам проводили 23%-вою суспензією пухлинної тканини у фізіологічному розчині підшкірно на спину, із розрахунку 0,4 мл суспензії пухлини на тварину.

Тваринам дослідної групи вводили внутрішньовенно 1 мл наночастинок золота. Концентрація наночастинок золота певного розміру складала 38,6 мкг/мл за металом для однієї тварини. Забій тварин контрольних та дослідних груп здійснювали через 1 годину та через 24 години шляхом декапітації з використанням анестетика тіопенталу (з розрахунку 70 мг/кг маси тіла тварини).

Вміст білка визначали біуретовим методом.

Співвідношення білкових фракцій (альбуміни, б1-, б2- -, г-глобуліни) - турбодиметричним методом. Для оцінки біохімічних показників крові були використані набори стандартних діагностикумів для клініко-діагностичних та біохімічних лабораторій виробництва ТОВ НВП «Філісіт-Діагностика» та «АТ Реагент» (Дніпропетровськ, Україна).

Розподіл наночастинок золота в органах і тканинах піддослідних тварин через 1 годину та через 24 години після внутрішньовенного введення визначали атомно-абсорбційним методом [Бусев А.И. и др., 1973] на комплексі «Графіт-2» (Україна).

Статистичний аналіз отриманих результатів проводили загальноприйнятими методами [Лакин Г.Ф., 1990].

Результати досліджень та їх обговорення

Отримання та характеристика наночастинок золота різного розміру

Наночастинки золота були синтезовані методом хімічної конденсації. Середній розмір отриманих наночастинок за даними лазерно-кореляційної спектрометрії (ЛКС) та трансмісійної електронної мікроскопії становив 10, 20, 30 і 45 нм.

Синтезовані наночастинки золота являють собою типові гідрофобні колоїдні системи. Їх стабільність забезпечується наявністю подвійного електричного шару на поверхні наночастинок. Потенціало-утворюючі іони AuO2-, що міцно абсорбовані на поверхні синтезованих наночастинок, обумовлюють їх негативний заряд, який у фізіологічних умовах складає декілька десятків мілівольт.

Стабільність синтезованих наночастинок золота була оцінена за рівнем їх коагуляції в модельних експериментах з використанням фізіологічного розчину та комерційних препаратів плазмозамінників, застосування яких поширене в медичній практиці і може вважатися адекватною моделлю крові.

Показано, що наночастинки золота характеризувались високим рівнем стабільності за умов використання плазмозамінників. Їх стабільність в цих модельних системах обумовлена утворенням абсорбційного шару високомолекулярних сполук, що містяться в плазмозамінниках, на поверхні наночастинок. Цей абсорбційний шар і перешкоджає їх коагуляції.

У моделі з фізіологічним розчином наночастинки золота частково втрачали стабільність в результаті коагуляції, що є наслідком зниження електрокінетичного потенціалу наночастинок в результаті впливу одновалентних катіонів Na+ на їх заряд.

Біохімічні ефекти впливу наночастинок золота на бактеріальні клітини

Сучасна медицина та ветеринарія використовують широкий спектр імунобіологічних препаратів на основі бактеріальних клітин, підвищення фізіологічних показників та біологічних властивостей яких є актуальним завданням [Лобзин Ю.В. и др., 2003; Амосова Л.А. и др., 2009; Конев Ю.В., 2005]. Тому існує необхідність у пошуках агентів, здатних виконувати стабілізуючі та активуючі функції. Такими потенційними агентами можуть бути наночастинки золота [Грузина Т.Г. и др., 2004].

У зв'язку з цим, біохімічні ефекти впливу наночастинок золота вивчали на штамах-пробіонтах Escherichia coli Г35 №1-413 і Enterococcus faecalis Г35 №4-410. Ці штами виявили високу ефективність у складі розробленого нами пробіотичного препарату для нормалізації стану мікрофлори та обміну речовин молодняку сільськогосподарських тварин [Рєзніченко Л.С. та ін., 2007; Рєзніченко Л.С. та ін., 2008]. В роботі були також використані виробничі штами Escherichia coli №№4, 19, 20, 24, 25 та 57, які є продуцентами вакцин проти коліентеротоксемії худоби.

Методами конфокальної мікроскопії була продемонстрована здатність наночастинок золота акумулюватись на поверхні та всередині клітин штамів-пробіонтів та штамів-продуцентів імунобіологічних препаратів.

Отримані зображення свідчать про нерівномірність розподілу акумульованих клітинами наночастинок золота: наночастинки золота переважно акумулюються на одному з полюсів клітини (червоне забарвлення - максимальна концентрація наночастинок), проте зв'язування відбувається по всій поверхні клітини (жовте та зелене забарвлення).

Проведені дослідження виявили низку особливостей впливу наночастинок золота різного розміру на Н+-АТР-азну активність мембранних фракцій бактеріальних клітин штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів вакцин. Для штамів-пробіонтів E. coli Г35№1-413 та Ent. faecalis Г35№4-410 інкубація наночастинок золота усіх досліджених розмірів з препаратами мембранних фракцій не викликала значних змін величин гідролізу АТР. Стимуляція активності цього ферменту для обох штамів в середньому сягала 5-10 %, порівняно з контролем.

Особливості впливу наночастинок золота на Н+-АТР-азну активність мембранних фракцій виробничих штамів-продуцентів за умов стресу ліофілізації/регідратації характеризувались наступними закономірностями.

Встановлено, що наночастинки золота у діапазоні концентрацій 0,0125 - 0,2 мкг металу/мкг білку залежно від їх розміру стимулювали на 20-40% Н+-АТР-азну активність мембранних фракцій нативних та ліофілізованих/регідратованих клітин вивчених виробничих штамів E.coli. Наявність такого достовірно стимулюючого ефекту на мембранну Н+-АТР-азу може бути обумовлена наступними факторами. Наночастинки золота володіють добре розвиненою активною поверхнею, площа якої визначається їх розміром та обумовлює високу реакційну здатність наночастинок [Чекман І.С., 2009]. При цьому каталітична дія наночастинок золота може бути реалізована через безпосередній вплив на сам фермент (взаємодія з функціональними зарядженими групами білкової молекули, що приводить до певних конформаційних змін). Не виключається можливість хімічної взаємодії наночастинок з ліпідним оточенням цього мембранозв'язаного ферменту, що може викликати функціональні зміни його активності [Харчук И.А., 2005].

Ключова роль клітинної оболонки як захисного бар'єру бактеріальних клітин обумовлена перш за все її структурними особливостями. Найбільш виражено розрізняються оболонки грампозитивних і грамнегативних бактерій.

Дія наночастинок золота на клітини грамнегативного штаму Escherichia coli Г35 №1-413 призводила до зменшення рівня проникності клітинної оболонки бактеріальних клітин, що свідчить про її стабілізацію. Стабілізуючий вплив наночастинок золота на клітинну оболонку грамнегативних бактерій можна пояснити стеричним фактором взаємодії наночастинок певного розміру з поверхнею клітини. Зокрема можливе блокування пор, що призводить до зниження рівня виходу внутрішньоклітинних метаболітів у зовнішнє середовище.

Для грампозитивного штаму Enterococcus faecalis Г35 №4-410 спостерігалась інша картина. Так, лише за дії наночастинок золота середнього розміру 20 нм у концентрації 1,38 мкг/мл за металом та наночастинок розміром 30 нм у концентрації 1,10 мкг/мл за металом проникність клітинної оболонки знижувалась. Наночастинки золота іншого розміру та концентрації викликали підвищення рівня проникності клітинної оболонки грампозитивних бактеріальних клітин. Можна припустити, що наночастинки золота зв'язуються з функціональними групами пептидоглікану та тейхоєвих кислот, розташованих із зовнішнього боку клітинної оболонки. Внаслідок цього відбувається локальне структурування в місцях хімічного зв'язування наночастинок з одночасною появою дестабілізованих ділянок оболонки грампозитивної бактеріальної клітини, що призводить до підвищення її проникності.

Дослідження впливу наночастинок золота на в-лактамазну активність штаму-пробіонту E. coli Г35 №1-413 виявили, що наночастинки золота розміром 10 та 20 нм у діапазоні концентрацій 0,1 - 1,1 мкг/мл за металом концентраційно-залежно інгібували в-лактамазну активність на 80% та 30 % відповідно. За дії наночастинок золота розміром 30 та 45 нм у всьому дослідженому концентраційному діапазоні підвищення в-лактамазної активності в середньому складало 30-50% (рис. 2).

Таким чином, отримані дані свідчать про виражену біохімічну активність наночастинок золота розміром 30 нм при їх дії на бактеріальні клітини штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів імунобіологічних препаратів.

Вплив наночастинок золота на пухлинні клітини лінії U937.

Методом конфокальної мікроскопії шляхом пошарового сканування була виявлена здатність клітин лінії U937 активно акумулювати наночастинки золота усіх досліджених розмірів як на поверхні, так і всередині клітини. Найбільш ефективно акумулювались клітинами лінії U937 наночастинки розміром 20 і 30 нм (червоне забарвлення - максимальна концентрація наночастинок) (рис. 3).

Встановлено, що взаємодія наночастинок золота з пухлинними клітинами характеризувалась вираженими концентраційними залежностями в діапазоні концентрацій 101-106 клітин/мл. Максимум зв'язування наночастинок розміром 10 і 20 нм пухлинними клітинами складав 103 клітин/мл, наночастинок розміром 30 нм - в діапазоні концентрацій 103 - 105 клітин/мл, наночастинок золота розміром 45 нм - в концентрації 104 клітин/мл.

В перерахунку на одну клітину концентраційний оптимум взаємодії наночастинок золота з клітинами лінії U937 знаходився у діапазоні ~(0,1-1,0) нг металу для наночастинок усіх досліджених розмірів.

При вивченні кінетики процесу взаємодії наночастинок золота з пухлинними клітинами лінії U937 було встановлено, що максимум зв'язування наночастинок усіх досліджених розмірів клітинами досягався протягом 3-5 хв (рис. 4).

Для наночастинок розміром 10 нм після досягнення максимального рівня акумуляції мав місце зворотний ефект - зменшення рівня зв'язування з часом. Це може бути обумовлено здатністю пухлинних клітин до активного їх «викиду».

Результати виконаних експериментів дозволяють зробити припущення щодо ймовірного механізму транспорту наночастинок золота в пухлинну клітину. Так, дані конфокальної мікроскопії та кінетики зв'язування наночастинок золота пухлинними клітинами свідчать про високий рівень акумуляції наночастинок розміром 30 нм. Імовірним механізмом потрапляння наночастинок золота розміром 30 нм у вивчені пухлинні клітини лінії U937 може бути рецептор-опосередкований ендоцитоз, що підтверджується даними літератури [Zhang S. et al., 2009; Shenoy D. et al., 2006].

Виявлено, що наночастинки золота різного розміру всередині клітини мали різну локалізацію: наночастинки золота розміром 10 нм та 20 нм переважно акумулювались у вакуолях, тоді як наночастинки розміром 30 і 45 нм - у лізосомах пухлинних клітин.

Дослідження особливостей впливу наночастинок золота на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин були виконані з використанням методу «ДНК-комет». При цьому були використані дві клітинні лінії еукаріотичних клітин: клітини лінії СНО-К1 та пухлинні клітини лінії U937.

Отримані дані засвідчили, що наночастинки золота розміром 10 і 20 нм після інкубації з нативними еукаріотичними клітинами обох типів у вивчених концентраціях виявляли здатність ушкоджувати структурний стан ДНК як клітин лінії СНО-К1, так і пухлинних клітин лінії U937. Однак, наночастинки золота середнього розміру 30 і 45 нм не впливали на структурний стан ДНК цих еукаріотичних клітин, що свідчить про їх біобезпечність.

Вплив наночастинок золота на структурний стан ДНК еукаріотичних клітин обумовлений здатністю наночастинок певного розміру проникати через пори ядерної мембрани та безпосередньо взаємодіяти з молекулою ДНК.

Подальші дослідження були спрямовані на вивчення особливостей впливу наночастинок золота різного розміру на ферментативні активності клітинних фракцій: Na+,K+-АТР-азну і Mg2+-АТР-азну активності мембранної фракції та лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937.

Встановлена здатність наночастинок розміром 10 нм на 70 % інгібувати величину Na+,K+-АТР-азної активності (рис. 5) та стимулювати у 4-4,5 разів лактатдегідрогеназну активність клітинних фракцій пухлинних клітин лінії U937.

Наночастинки розміром 20 нм на 20% інгібували Na+,K+-АТР-азну активність мембранної фракції та стимулювали у 1,5-2,5 рази лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції клітин лінії U937.

Наночастинки розміром 30 нм стимулювали на 20-40% величину Na+,K+-АТР-азної активності та у 1,5-2,5 рази - лактатдегідрогеназної активності.

Вплив наночастинок золота розміром 45 нм призводив до підвищення на 20-40% Na+,K+-АТР-азної активності мембранної фракції клітин. Величина лактатдегідрогеназної активності цитозольної фракції інгібувалась у діапазоні концентрацій 0,15-0,6 мкг/мл за металом з подальшим переходом до стимуляції майже у 2 рази за максимальної дослідженої концентрації (1,2 мкг/мл за металом).

Mg2+-АТР-азна активність мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937 під впливом наночастинок золота усіх досліджених розмірів достовірно не змінювалась.

Регуляція наночастинками золота Na+,K+-АТР-азної активності мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937 може бути обумовлена взаємодією наночастинок певного розміру з SH-групами молекули фермента, які відповідають за його конформаційний стан, внаслідок стеричної відповідності.

Імовірним механізмом впливу наночастинок золота різного розміру на лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937 може бути їх взаємодія з основними амінокислотами (аргініном та гістідіном) активного центру фермента в результаті стеричної комплементарності.

Отримані результати свідчать про можливість регуляції ферментативних активностей пухлинних клітин наночастинками золота певного розміру, що має суттєве значення для онкотерапії з використанням золотовмісних препаратів.

Вплив наночастинок золота на співвідношення білкових фракцій плазми крові щурів

Дослідження впливу наночастинок золота на вміст білкових фракцій плазми крові були проведені за умов внутрішньовенного введення препаратів наночастинок лабораторним щурам: в нормі та з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину.

Отримані дані засвідчили, що наночастинки золота розміром 20, 30 і 45 нм не спричиняли значних змін у вмісті білкових фракцій плазми крові тварин у нормі.

Наявність перещепленої пухлини карциноми Герена, резистентної до цисплатину, викликала значний дисбаланс у співвідношені білкових фракцій плазми крові. Так, вміст білку у тварин-пухлиноносіїв перевищував на 22 % значення контрольного показнику тварин у нормі. Спостерігалось зниження вмісту альбумінів в середньому на 44 %, порівняно з контролем, вміст б1-глобулінів залишався на контрольному рівні, б2-глобулінів - був меншим за контроль на 20 %, а вміст в-глобулінів в середньому на 31 % перевищував контрольне значення для тварин у нормі. Найбільш виражені зміни було виявлено при дослідженні вмісту г-глобулінів. У плазмі крові тварин-пухлиноносіїв вміст г-глобулінів у 2 рази перевищував контрольне значення для тварин у нормі.

На фоні цього глибокого дисбалансу білкових фракцій під впливом ночастинок золота розміром 45 нм у крові тварин-пухлиноносіїв через 24 години після введення спостерігалось підвищення вмісту фракції б1-глобулінів, порівняно з контролем, що може бути наслідком початку некротичних процесів у пухлині. Крім того, після внутрішньовенного введення наночастинок цього розміру спостерігалась тенденція до нормалізації вмісту г-глобулінів, що може свідчити про позитивний вплив наночастинок на імунний статус тварин-пухлиноносіїв.

Розподіл наночастинок золота в органах і тканинах щурів

Важливим та необхідним етапом при вивченні біохімічних ефектів впливу наночастинок золота є дослідження особливостей розподілу та накопичення наночастинок золота в органах і пухлинах лабораторних тварин.

Методом атомної абсорбції, на прикладі наночастинок середнього розміру 20 нм, було досліджено розподіл наночастинок золота у тимусі, мозку, селезінці, печінці, нирках, надниркових залозах, легенях, серці та пухлині, які є потенційними мішенями акумуляції наночастинок золота.

Було виявлено, що у досліджених органах тварин у нормі ані через 1 годину, ані через 24 години після внутрішньовенного введення препаратів наночастинок вміст золота не фіксувався.

У тварин з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину, через 1 годину після ін'єкції вміст золота реєструвався у наступних органах: мозку (26,09±3,15 нгAu/г тканини), нирках (51,40±6,23 нгAu/г тканини), селезінці (60,00±5,78 нг Au/г тканини) та печінці (37,60±4,07 нг Au/г тканини) (табл. 1).

Таблиця 1 - Накопичення наночастинок золота (НЗ) розміром 20 нм у органах і тканинах лабораторних щурів з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину (внутрішньовенне введення 1 мл препарату наночастинок у концентрації 38,6 мкг/мл)

Органи і тканини-мішені

Концентрація золота, нг Au/г тканини

Контрольна група

1 година після введення НЗ

24 години після введення НЗ

Пухлина

-

78,90±5,27

31,70±2,69

Тимус

-

-

-

Мозок

-

26,09±3,15

-

Легені

-

-

-

Серце

-

-

-

Надниркові залози

-

-

-

Нирки

-

51,40±6,23

-

Селезінка

-

60,00±5,78

-

Печінка

-

37,60±4,07

12,70±1,92

Примітка: “-” - вміст золота не фіксується; (M±m; n=4, Р < 0,05).

Проте, через 24 години після ін'єкції рівень накопичення наночастинок золота у печінці, селезінці та нирках істотно зменшувався і складав відповідно 12,7±1,92 нгAu/г тканини для печінки, а у селезінці та нирках взагалі не фіксувався. Це вказує на провідну роль цих органів у детоксикації та виведенні наночастинок золота з організму.

Особливості накопичення наночастинок золота у мозку тварин-пухлиноносіїв засвідчили здатність наночастинок долати гемато-енцефалічний бар'єр, що може бути використано у діагностиці та цільовій терапії.

Найвищий, порівняно з вмістом у органах, рівень накопичення наночастинок золота (78,90±5,27 нг Au/г тканини) реєструвався у пухлинах через 1 годину після ін'єкції. Через 24 години вміст золота у пухлинах залишався на високому рівні і складав 31,7±2,69 нг Au/г тканини, що більш ніж у 2 рази перевищувало залишкову концентрацію золота у печінці - єдиному з органів, де золото фіксувалось через 24 години після введення.

Отримані експериментальні дані засвідчили високу афінність наночастинок золота до пухлинних клітин за умов внутрішньовенного введення препаратів наночастинок. Ці результати корелюють з даними, отриманими in vitro щодо ефективної взаємодії пухлинних клітин лінії U937 (гістіоцитарної лімфоми людини) з наночастинками золота (високий рівень акумуляції та швидка кінетика процесу), що вказує на перспективність використання наночастинок золота як векторів для цільового доставляння протипухлинних препаратів.

Таким чином, встановлено, що біохімічні ефекти впливу наночастинок золота на прокаріотичні та еукаріотичні клітини визначаються розміром наночастинок.

Для наночастинок розміром 10 нм є наявними: їх активний «викид» з пухлинних клітин лінії U937; пошкодження структурного стану ДНК при контакті наночастинок з клітинами ліній СНО-К1 та U937; інгібування на 70% Na+,K+-АТР-азної активності мембранної фракції та стимуляція у 4-4,5 разів лактатдегідрогеназної активності цитозольної фракції пухлинних клітин лінії U937.

Наночастинки розміром 20 нм виявляли здатність акумулюватись на поверхні та всередині пухлинних клітин лінії U937, накопичуватись пухлинними клітинами карциноми Герена, резистентної до цисплатину, пошкоджувати структурний стан ДНК при контакті з клітинами ліній СНО-К1 та U937, на 20% інгібувати величину Na+,K+-АТР-азної активності мембранної фракції та у 1,5-2,5 рази стимулювати лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції клітин лінії U937.

Наночастинки розміром 30 і 45 нм активно акумулювались бактеріальними та еукаріотичними клітинами, не впливали на структурний стан ДНК при контакті наночастинок з еукаріотичними клітинами ліній СНО-К1 та U937, стимулювали на 20-40% Н+-АТР-азну активність мембранної фракції бактеріальних клітин та на 30-50% в-лактамазну активність клітин E. сoli, на 20-40% підвищували Na+,K+-АТР-азну активність мембранної фракції пухлинних клітин лінії U937. Наночастинки розміром 30 нм у 1,5-2,5 рази стимулювали лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції клітин лінії U937. Наночастинки розміром 45 нм у діапазоні концентрацій 0,15-0,6 мкг/мл за металом інгібували лактатдегідрогеназну активність з подальшим переходом до стимуляції майже у 2 рази за максимальної дослідженої концентрації (1,2 мкг/мл за металом).

Здатність наночастинок золота певного розміру проявляти біохімічну активність у бактеріальних клітинах штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів в умовах стресу ліофілізації визначає перспективність використання синтезованих наночастинок у біотехнології як протекторів та стимуляторів бактеріальних клітин.

Виявлена висока афінність наночастинок золота до пухлинних клітин складає фундаментальну основу конструювання засобів діагностики і цільової доставки фармацевтичних препаратів в онкології.

ВИСНОВКИ

Дослідження останніх років свідчать про значні перспективи медико-біологічного застосування наночастинок золота. Однак, відомості щодо біохімічних ефектів впливу наночастинок золота на прокаріотичні та еукаріотичні клітини є досить обмеженими і суперечливими. В дисертації наведено результати вперше проведених системних досліджень по вивченню біохімічних ефектів впливу наночастинок золота різного розміру на прокаріотичні та нормальні і пухлинні еукаріотичні клітини.

1. Синтезовані сферичні наночастинки золота середнього розміру 10, 20, 30 і 45 нм, показана їх висока стабільність в модельних системах крові.

2. Показано, що наночастинки розміром 30 нм підвищують на 20-40 % Н+-АТР-азну активність мембранних фракцій бактеріальних клітин, на 30-50 % в-лактамазну активність клітин E. сoli; у концентрації 1,10 мкг/мл за металом стабілізують клітинну оболонку грамнегативних (E. сoli) та грампозитивних (Ent. faecalis) бактеріальних клітин.

3. В експериментах in vitro визначений концентраційний оптимум взаємодії наночастинок золота з пухлинними клітинами лінії U937, який у перерахунку на одну клітину складає 0,1-1,0 нг металу для наночастинок усіх досліджених розмірів; максимум зв'язування наночастинок пухлинними клітинами досягається протягом 3-5 хв.

4. Встановлено, що наночастинки золота активно акумулюються як на поверхні, так і всередині пухлинних клітин лінії U937. Всередині клітини наночастинки розміром 10 і 20 нм переважно локалізуються у вакуолях, а наночастинки 30 і 45 нм - у лізосомах пухлинних клітин лінї U937.

5. Виявлено, що наночастинки золота розміром 30 і 45 нм при взаємодії з клітинами лінії СНО-К1 та пухлинними клітинами лінії U937 не впливають на структурний стан їх ДНК, що свідчить про біобезпечність наночастинок цих розмірів. Наночастинки розміром 10 і 20 нм ушкоджують структурний стан ДНК обох типів клітин, що обумовлено їх здатністю проникати через пори ядерної мембрани та безпосередньо взаємодіяти з молекулою ДНК.

6. Показано, що наночастинки золота розміром 10 нм інгібують на 70% Na+,K+-АТР-азну активність мембранної фракції та у 4-4,5 разів стимулюють лактатдегідрогеназну активність цитозольної фракції клітин лінії U937, а наночастинки розміром 30 нм на 20-40% підвищують Na+,K+-АТР-азну та у 1,5-2,5 рази - лактатдегідрогеназну активності.

7. Встановлено, що у тварин з перещепленою карциномою Герена, резистентною до цисплатину, спостерігається накопичення наночастинок золота (78,90±5,27 нг Au/г тканини) у пухлинах через 1 годину після внутрішньовенної ін'єкції. Через 24 години вміст золота у пухлинах залишається на високому рівні і складає 31,7±2,69 нг Au/г тканини, що вказує на високу афінність наночастинок золота до пухлинних клітин та корелює з даними in vitro.

8. Здатність наночастинок золота проявляти біохімічну активність у бактеріальних клітинах штамів-пробіонтів та виробничих штамів-продуцентів в умовах стресу ліофілізації найбільш виражена для наночастинок розміром 30 нм визначає перспективність їх використання у біотехнології як протекторів та стимуляторів бактеріальних клітин.

9. Виявлена in vitro та in vivo висока афінність наночастинок золота до пухлинних клітин, складає фундаментальну основу для конструювання засобів діагностики і цільової доставки фармацевтичних препаратів в онкології.

СПИСОК РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Перспективність бактерій родів Escherichia та Enterococcus для створення полікомпонентного пробіотику / Л.С. Рєзніченко, В.В. Вембер, Т.Г. Грузіна, С.А. Неміро, З.Р. Ульберг // Вісник проблем біології і медицини. - 2007. - Вип. 1. - С. 31-37.

2. Вплив металів-мікроелементів на функціональний стан бактерій-пробіонтів / Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, В.В. Вембер, З.Р. Ульберг // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т. 80, №1.- C. 96-101.

3. Пробіотичний препарат для ветеринарії та його вплив на біохімічні показники крові молодняка сільськогосподарських тварин / Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, В.В. Вембер, Л.М. Скринник, З.Р. Ульберг // Укр. біохім. журн. - 2008. - Т.80, №3. - С.110-117.

4. Нормалізація біохімічних показників крові молодняка сільськогосподарських тварин під впливом пробіотичного препарату «Окарін-Вет» / Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, С.А. Немиро, Л.М. Скринник, В.О. Ушкалов // Ветеринарна біотехнологія (бюлетень). - 2008. - № 13 (2). - С. 195-204.

5. Вплив наночастинок золота та срібла на АТР-азну активність нативних і регідратованих клітин Escherichia coli / М.Є. Романько, Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, С.М. Дибкова, З.Р. Ульберг, В.О. Ушкалов, А.М. Головко // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, № 6. - С.70-76.

6. Визначення ушкоджень ДНК наночастинками металів, перспективних для біотехнології / С.М. Дибкова, М.Є. Романько, Т.Г. Грузіна, Л.С. Рєзніченко, З.Р. Ульберг, В.О. Ушкалов, А.М. Головко // Біотехнологія. - 2009. - Т. 2, № 3. - С. 80-85.

7. Контактна взаємодія наночастинок золота з пухлинними клітинами: вплив розміру та концентрації / Л.С. Рєзніченко, С.І. Шпильова, Т.Г. Грузіна, С.М. Дибкова, З.Р. Ульберг, В.Ф. Чехун // Доповіді НАН України. - 2010. - № 2. - С. 171-175.

8. Аналіз генотоксичності наночастинок золота методом лужного гель-електрофорезу ізольованих еукаріотичних клітин / С.М. Дибкова, Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, С.І. Шпильова, З.Р. Ульберг, В.Ф. Чехун // Доповіді НАН України. - 2010. - № 3. - С. 166-170.

9. Патент України МПК (2006): А61К 35/66 Біопрепарат, його застосування у ветеринарії для профілактики та лікування гастроентеритів молодняку тварин / З.Р. Ульберг, Т.Г. Грузіна, Л.С. Рєзніченко, В.А. Ушкалов, А.М. Головко, В.А. Прокопенко // Заявл. 30.03.2009; Опубл. 25.08.2009, Бюл. № 16. - 4 с.

10. Ефективність застосування пробіотику "Окарін-вет" у тваринництві / Л.С. Рєзніченко, Т.Г. Грузіна, В.В. Вембер, Л.М. Скринник, З.Р. Ульберг, А.М. Головко, С.А. Немиро // Чернігівщина аграрна. - 2007. - Т. 6, № 10. - С. 16-17.

11. Nanoparticles of colloidal metals as perspective components for creation of metal-containing probiotics / L. Reznichenko, T. Gruzina, V. Vember, S. Nemiro, Z. Ulberg // Ukrainian-German Symposium on Nanobiotechnology, 14-16 December, 2006: abstracts. - Kyiv, 2006. - P. 121.


Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.