Біотехнологія іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ

Григор'єва Марина Анатоліївна

УДК 577.152.3+663.15

БІОТЕХНОЛОГІЯ ІММОБІЛІЗОВАНОГО ГІДРОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТУ ЦИТОРЕЦИФЕН-М

03.00.20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі промислової біотехнології Національного технічного університету України «КПІ» Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат технічних наук, доцент Тодосійчук Тетяна Сергіївна, Національний технічний університет України «КПІ», заст. завідувача кафедри промислової біотехнології, заст. декана факультету біотехнології і біотехніки.

Офіційні опоненти: доктор технічних наук, член-кор. АТН України, професор Маринченко Віктор Опанасович, Національний університет харчових технологій, професор кафедри біотехнології продуктів бродіння, екстрактів та напоїв.

Кандидат біологічних наук Мацелюх Олена Вікторівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної академії наук України, старший науковий співробітник відділу біохімії мікроорганізмів.

Захист відбудеться «24» червня 2009 р. о 1400 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68, аудиторія А-310.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68.

Автореферат розісланий «15» травня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03, кандидат технічних наук, доцент Бублієнко Н.О.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гідролітичні ферменти знайшли застосування в широких галузях промисловості, медицини, народного господарства та науки завдяки своїй здатності до деградації різноманітних субстратів. Однак, у технології та медицині довгий час використовували препарати нативних ферментів, що обмежувало термін та умови їх використання. Іммобілізовані препарати, на відміну від нативних, мають ряд переваг: підвищена ефективність і стабільність, зручність та тривалість застосування. Лише основні вказані переваги обумовлюють інтерес науковців до пошуку оптимальних умов іммобілізації різних гідролаз та виправдовують витрати на тривалі дослідження та розробку їх технологій.

Використання мікробного біосинтезу для отримання гідролітичних ферментів за своїми економічними показниками значно перевищує інші способи. Тому, доцільним є розробка мікробних ферментних препаратів, а суттєвими параметрами удосконалення біотехнологій іммобілізованих гідролаз є підбір оптимального носія, умов і режимів іммобілізації, зниження витрат на стадіях виділення продукту. Актуальність роботи в даному напрямку обумовлюється відсутністю вітчизняних біотехнологій іммобілізованих гідролітичних препаратів, реалізованих у промисловості. Поряд з цим важливе науково-практичне значення має дослідження методів модифікації ферментів з метою створення препаратів із високою активністю та контрольованою специфічністю.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводилися згідно з науковою тематикою кафедри промислової біотехнології Національного технічного університету України «КПІ», а також у межах науково-дослідних робіт за замовленнями ДКНТ та Міністерства освіти і науки України «Розробка технології гідролітичного поліферментного препарату мікробного походження» (№ державної реєстрації 0103U008837, 2003-2005 рр.) та «Іммобілізація протеїн/пептидів (ензимів) для підвищення реактивності та стабільності» (№ державної реєстрації 0103U008883, 2003-2005 рр.).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка біотехнології іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату на основі відібраного штаму культури Streptomyces recifensis var. lyticus.

Для досягнення вказаної мети були поставлені наступні основні задачі:

відбір штаму-продуценту гідролітичного ферментного комплексу (ГФК) на основі визначення його біосинтетичної здатності;

оптимізація умов біосинтезу ГФК обраним штамом;

встановлення способу, умов та механізмів іммобілізації ГФК;

визначення технологічних режимів отримання іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату (ГФП) та його готової форми;

розробка технологічної та апаратурної схем отримання іммобілізованого ГФП;

дослідження напрямів практичного використання одержаного іммобілізованого ГФП.

Обєкт дослідження - штами культури Streptomyces recifensis var. lyticus (2435, 3В, 70К, 2435/М, 36/1, 31/6, 80/5, 6/4); процес біосинтезу гідролітичного ферментного комплексу; гідролітичний ферментний комплекс, синтезований відібраним штамом.

Предмет дослідження - умови іммобілізації та технологічні режими отримання іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату з використанням відібраного штаму.

Методи дослідження - мікробіологічні, біотехнологічні, фізико-хімічні, біохімічні, математичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено стимулюючу дію аеросилу у концентрації 0,1 % на процес біосинтезу ГФК штамом Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М. Визначено здатність штаму до утилізації нативного крохмалю та соєвого борошна спеціальної обробки, оптимізовано склад поживного середовища для біосинтезу ГФК.

Обґрунтовано доцільність застосування адсорбційного способу іммобілізації для одержання іммобілізованого ГФП з Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М. Вперше показано ефективність використання аеросилу для отримання іммобілізованого препарату в ході біотехнологічного виробництва та визначені основні умови проведення процесу іммобілізації. Спосіб одержання іммобілізованого ГФП Циторецифен-М захищено патентом України № 31448 (2008 р.). Показано, що запропонований спосіб іммобілізації одночасно може розглядатися як метод вилучення ГФК в ході виробничого процесу, що визначає удосконалення біотехнології в цілому.

Встановлено основні механізми іммобілізації ГФК на поліетиленгліколі, поліоксиетилені та аеросилі: утворення водневих зв'язків, електростатичні та багатоцентрові взаємодії. Отримані дані можуть бути використані як теоретичні засади у розробках інших іммобілізованих білкових препаратах.

Вперше визначено бактеріостатичну концентрацію іммобілізованого препарату Циторецифен-М, що становить 10 мг/см3. Показано, що активність іммобілізованого препарату у порівнянні з нативним у 1,5-2 рази вища.

Встановлено відсутність негативного впливу типових компонентів синтетичних миючих засобів (сульфонолу й синтанолу) на активність отриманого препарату. Обґрунтовано можливість створення комбінованих антисептичних препаратів на основі Циторецифену-М та антибіотику левоміцетину.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено науково-обґрунтовану біотехнологію іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М, що включає біосинтез ГФК штамом Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М, вилучення біомаси, іммобілізацію та отримання сухого гранульованого препарату з літичною активністю 50-55 тис. од/г. Запропонована розробка апробована у дослідно-промислових умовах ВО «Ензим» (м. Ладижин).

Встановлено доцільність застосування отриманого препарату у складі синтетичних миючих засобів з антисептичним ефектом, в тому числі у композиціях з гідролазами іншої специфічності (амілазами, протеазами) у визначених співвідношеннях. Сферами використання препарату можуть бути також процеси очищення та дезинфекції медичного інструментарію та систем, що не витримують термічного впливу. Показано можливість створення альтернативних готових форм препарату (присипка, гель), що може бути використано у подальшому як теоретична основа при розробці технології медичного або косметичного засобу.

Економічна доцільність розробки обумовлена зниженням собівартості запропонованого поживного середовища для біосинтезу продукту на 15% за рахунок проведеної оптимізації його складу при одночасному підвищенні рівня біосинтезу продукту на 20%.

Окремі результати досліджень були використані при розробці та виданні методичних вказівок до курсу «Загальна біотехнологія» для студентів, що навчаються за напрямом «Біотехнологія». Соціальний ефект роботи полягає у можливості розширення асортименту вітчизняної продукції для населення та промисловості, створенні нових робочих місць при впровадженні розробки у виробництво.

Особистий внесок здобувача полягає у визначенні актуальності та ступеню вивчення проблеми, проведенні експериментальної роботи, підготовці результатів досліджень до публікації. Особисто дисертантом проведена оптимізація поживного середовища для культивування штаму Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М, здійснено підбір оптимальних умов та носіїв для іммобілізації, запропоновано апаратурну та технологічну схеми виробництва іммобілізованого ферментного препарату, проведено статистичну обробку результатів досліджень. Планування основних напрямків роботи, аналіз, обговорення та узагальнення результатів експериментів проводились спільно з науковим керівником к.т.н., доц. Тодосійчук Т.С.

Оптимізацію умов біосинтезу ГФК планувати разом з к.б.н. Клочко В.В. (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України); дослідження умов іммобілізації ГФП здійснювали спільно з асп. Поліщук Н.В. (НТУУ «КПІ»); встановлення механізмів іммобілізації ГФК на обраних носіях проводили спільно з к.х.н. Менжерес Г.Я. (Інститут хімії високомолекулярних сполук НАН України); можливість створення комбінованих препаратів ГФК з антибіотиками визначали разом з м.н.с. Крупською Т.В. (Інститут хімії поверхні НАН України), які є співавторами робіт. Визначення бактеріостатичної активності іммобілізованого ГФП з використанням умовно-патогенних тест-культур здійснено к.мед.н. Покас О.В. (Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були викладені й обговорені на засіданнях кафедри промислової біотехнології НТУУ «КПІ», ІІ Міжнародній науково-технічній конференції студентів і аспірантів та молодих вчених «Хімія і сучасні технології» (Дніпропетровськ, 2005), Х Всеросійській конференції по проблемам науки і вищої школи «Фундаментальные исследования в технических университетах» (Санкт-Петербург, 2006), ІІ Міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2006), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Сучасні наукові дослідження» (Дніпропетровськ, 2006), ІІ Всеросійській конференції «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья», (Москва-Белгород, 2006), ІІ Міжнародній конференції молодих вчених і студентів «Біомедична інформатика, медична інженерія і телемедицина (нові погляди, ідеї і факти)», (Київ, 2006), Х Міжнародній конференції молодих вчених «Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики і біотехнології» (Київ, 2007), Науково-практичній конференції НТУУ «КПІ» (Київ, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 13 наукових праць, із них - 5 статей у наукових фахових журналах, затверджених ВАК України, 1 патент України на корисну модель, 1 стаття у науковому журналі, 6 тез конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 125 сторінках машинописного тексту і складається з таких структурних частин: «Вступ», «Огляд літератури» (розділ 1), «Матеріали і методи досліджень» (розділ 2), «Результати досліджень та їх обговорення» (розділи 3-5), «Висновки», «Список використаних джерел», якій містить 268 посилань (з них 207 іноземних авторів), «Додатки». Робота містить 14 таблиць та 29 рисунків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність дисертаційної роботи, сформульовано мету та задачі дослідження, визначено наукову новизну та практичну цінність результатів дисертаційної роботи, наведено відомості стосовно особистого внеску автора, апробації результатів дисертації, структури та обсягу роботи.

У першому розділі «Огляд літератури» на основі аналізу та узагальнення даних літератури наведена характеристика основних груп мікробних гідролаз, особливості їх біосинтезу, способи оптимізації біосинтезу та методи виділення і очистки. Проаналізовано сучасні та перспективні методи іммобілізації ферментів. Визначено фактори, що обумовлюють ефективність проведення процесу іммобілізації біомолекул. Розглянуто особливості розробки технологій готових іммобілізованих ферментних препаратів та аспекти практичного застосування іммобілізованих гідролаз.

У другому розділі «Матеріали і методи досліджень» наведено характеристику об'єктів та методів досліджень, викладено методики проведення експериментів.

Об'єкти та матеріали досліджень. В роботі використовували продуценти ГФК Streptomyces recifensis var. lyticus - штами 2435, 3В, 70К, 2435/М, 36/1, 31/6, 80/5, 6/4 з музею кафедри промислової біотехнології Факультету біотехнології та біотехніки НТУУ «КПІ». Streptomyces recifensis var. lyticus синтезує ГФК, що виявляє високу літичну (бактеріолітичну) активність.

Культивування продуцентів та біосинтез продукту. Досліджувані штами вирощували при 28 С впродовж 3-6 діб - на рідких середовищах в колбах при перемішуванні 240 хв-1 та впродовж 5-7 діб - на щільному поживному середовищі Чапека. Посівний матеріал вирощували на рідкому середовищі Чапека. Біосинтез ГФК здійснювали на поживному середовищі такого складу (г/дм3): соєве борошно - 8,0; крохмаль картопляний гідролізований - 10,0; NaCl - 14,0; К2НРО43Н2О -2,0; Мg Cl2-2,2; CaCl2 -2,0; MnCl24Н2О - 0,04; рН 7,8-8,2.

При оптимізації умов біосинтезу ГФК як джерела азоту та вуглецю використовували соєве, пшеничне та кукурудзяне борошно підвищенної поживної цінності (ТОВ «ЕСО», Україна ; ТУ У 13693522.022-96).

В лабораторних умовах ГФП отримували за наступною схемою: посівний матеріал вирощували у качалкових колбах на 750 см3, біосинтез проводили в лабораторному ферментері об'ємом 3 дм3, відділення біомаси здійснювали центрифугуванням. У фугат культуральної рідини вносили носій та проводили іммобілізацію адсорбційним способом, наведеним нижче. Препарат відділяли центрифугуванням та висушували контактним або ліофільним способом.

Як носії для іммобілізації ГФК використовували метилцелюлозу, поліетиленгліколь, поліоксиетилен, аеросил марки А-300, полівініловий спирт та поліакриламід. Вибір таких носіїв пов'язаний з їх потенційною здатністю стабілізувати і пролонгувати дію біологічно активних речовин, біологічною нешкідливістю та необхідними формоутворюючими характеристиками.

Для дослідження можливості створення ензимних композицій з вмістом іммобілізованого ГФП (Циторецифену-М) використовували ферментні препарати Протеаза С, Глюкозим L400, Термозим L340 (ВО «Ензим», м.Ладижин).

Для визначення впливу типових компонентів миючих засобів на активність отриманого ферментного препарату використовували іоногенні та неіоногенні речовини сульфонол та синтанол, відповідно.

Методи досліджень. Основні характеристики процесу біосинтезу визначали наступним чином: білок - методом Лоурі, літичну активність (ЛА) - турбідиметричним методом за здатністю до лізису суспензій тест-культур (Павлова, 1988), протеолітичну (ПА) - за азоказеїном (Петрова, 1966), амілолітичну (АА) - за рівнем гідролізу крохмалю (Рухлядєва, 1981).

Для визначення літичної активності використовували тест-культури Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Lactobacillus bulgaricus. Визначення бактеріостатичної активності біопрепаратів проводили за методом Голда (Gould, 1965) з використанням музейних та клінічних тест-культур. Оптимізацію поживного середовища проводили за методом ортогональних латинських прямокутників (Бірюков, Кантере, 1985).

Іммобілізацію здійснювали адсорбційним способом: вносили носій (3-15 %) у розчин ферменту або фугат культуральної рідини та перемішували протягом 30-60 хв при досліджуваних температурах 10-30 °С. Іммобілізацію проводили у водному розчині ферменту, а також у буферних системах: борно-лужній (рН 8,4), фосфатно-лужній (рН 6,2), цитратній (рН 4,1).

Спектральне дослідження зразків іммобілізованих препаратів здійснювали методом ІЧ-спектроскопії на спектрометрі Tensor-37 («Bruker», Німеччина). Електронне дослідження зразків препаратів проводили на скануючому електронному мікроскопі фірми GEOL GSM-6060. Статистичну обробку проводили з застосуванням t-критерію Стюдента при 5%-му рівні значущості.

У третьому розділі «Оптимізація умов біосинтезу гідролітичного ферментного комплексу Streptomyces recifensis var. lyticus» наведені результати роботи з вибору штаму-продуценту ГФК, визначення впливу досліджуваних компонентів у складі поживних середовищ для культивування продуценту, оптимізації складу поживного середовища для біосинтезу ферментного комплексу.

В ході культивування досліджуваних штамів-продуцентів було проведено відбір найактивнішого штаму за рівнем біосинтезу ГФК. Результати визначення біосинтетичної здатності штамів свідчать, що активність штаму 2435/М, що був раніше патентований як продуцент ГФП, практично удвічі вища за активність більшості інших штамів по відношенню до всіх тест-культур.

Рис. 1 - Характеристика біосинтетичної здатності штамів культури Str. recifensis var. Lyticus Наведені в роботі результати вказують також на вищу продуктивність штаму 2435/М по відношенню до найбільш близького за рівнем активності штаму 3В, що й визначило подальше використання у роботі саме штаму 2435/М.

Дослідження динаміки біосинтезу продукту вказаним штамом (рис. 2) показало, що ГФК з максимальною літичною активністю синтезуються на 72-у годину культивування. Максимальна протеолітична активність комплексу визначається на 4-у добу вирощування. Тому, при потребі, можливе отримання гідролітичних препаратів як з провідною літичною так і протеолітичною активністю.

Рис. 2. Динаміка біосинтезу ГФК комплексу штамом Str. recifensis var. lyticus 2435/М.

Оскільки для штаму 2435/М раніше не було підібрано оптимального складу поживного середовища, на наступному етапі роботи досліджували компоненти, що могли бути використані у складі поживного середовища при його подальшій оптимізації.

Як джерела вуглецю і азоту досліджували різні види борошна (ЕСО) з підвищеною поживною цінністю та визначали можливість їх використання у складі поживного середовища для культивування штаму 2435/М (табл.1).

іммобілізований гідролітичний ферментний комплекс

Таблиця 1 - Вплив досліджуваних джерел N та C у поживному середовищі на біосинтетичну здатність та продуктивність Str.recifensis var. lyticus 2435/М

Вид борошна (вміст у поживному середовищі, 8 мг/см3)	Літична активність, од/см3	Продуктивність, од/мг біомаси
Соєве (контроль)	1800± 2,9	95±0,07
Соєве (ЕСО)	2200± 4,4	120±0,14
Пшеничне (ЕСО)	1990±3,2	120±0,20
Кукурудзяне (ЕСО)	1850±3,0	105±0,11

Порівнюючи рівень бiосинтезу ГФК продуцентом на різних варіантах середовищ, очевидно, що найефективнішим є використання соєвого борошна ЕСО. Підвищення літичної активності при цьому складає 20 %, а продуктивність культури зростає на 25 %.

Аналіз впливу різних речовин на біосинтетичну здатність мікробних культур показав, що одними з них є кремнійорганічні сполуки (Чуйко, 1993; Курдіш, 1997, 2003; Геращенко, 2001, 2003). Тому, досліджували вплив високодисперсного кремнезему аеросилу (SiO2) марки А-300 на біосинтетичну здатність штаму 2435/М. В роботі показано стимулюючий ефект аеросилу в концентрації 0,1 %, що призводить до підвищенні рівня синтезу ГФК на 20 %.

Вихідне поживне середовище для біосинтезу ГФК штамом 2435/М, серед основних компонентів містило гідролізований крохмаль, що позначається на його вартості. Тому, зважаючи на присутність у ГФК амілаз, досліджували можливість застосування у поживному середовищі нативного крохмалю.

Визначені альтернативні компоненти (соєве борошно «ЕСО», аеросил, нативний крохмаль) використовували при наступному проведенні оптимізації поживного середовища за 8 факторами (кількість компонентів середовища) на 4 рівнях (концентрації кожного компоненту). За значенням літичної активності наприкінці вирощування продуценту на кожному варіанті середовища проводили оцінку ефектів впливу компонентів у досліджуваних діапазонах концентрацій (табл. 2).

На основі аналізу ефектів впливу компонентів у досліджуваних концентраціях отримано поживне середовище для біосинтезу продукту такого складу (г/дм3): соєве борошно - 10,0; крохмаль - 15,0; NaCl - 10,0; К2НРО43Н2О - 1,5; Мg Cl2 - 1,0; CaCl2 - 6,0; MnCl24Н2О - 0,1; аеросил - 1,0.

Таблиця 2 - Ефекти впливу компонентів поживного середовища на рівень біосинтезу продукту

Крохмаль	Конц-ція, г/дм3	5	10	15	20
	Ефект	-265,94	+27,81	+179,06	+59,06
Соєве борошно	Конц-ція, г/дм3	10	15	20	25
	Ефект	+81,56	+4,06	+67,81	153,44
NaCl	Конц-ція, г/дм3	1	5	10	15
	Ефект	+75,31	-62,19	+110,31	123,44
CaCl2	Конц-ція, г/дм3	1,5	3,0	4,5	6,0
	Ефект	+56,56	-132,19	-22,19	+97,81
K2HPO4	Конц-ція, г/дм3	0,5	1,5	2,0	2,5
	Ефект	-3,44	+16,56	+4,06	-17,19
MgCl2	Конц-ція, г/дм3	0,5	1,0	2,0	3,0
	Ефект	-98,44	+170,31	-125,94	+54,06
MnCl2	Конц-ція, г/дм3	0	0,04	0,08	0,1
	Ефект	-37,19	+7,81	+12,81	+16,56
Аеросил	Конц-ція, г/дм3	0	1	5	10
	Ефект	-148,44	+129,06	+12,81	+6,56

Перевірка ефекту оптимізації показала, що вирощування досліджуваного продуценту на оптимізованому середовищі підвищує вихід продукту на 20 %, проте, доцільність використання такого середовища визначається також заміною гідролізованого крохмалю в його складі на нативний. За наведеними в роботі економічними розрахунками це дозволяє знизити собівартість середовища на 15 % та спростити його підготовку.

Оптимізоване поживне середовище було використане при подальшій розробці Технологічного тимчасового регламенту на стадії біосинтезу продукту. Результати досліджень, наведені в даному розділі викладені у публікаціях [3, 5] та впроваджені в учбовий процес.

У четвертому розділі «Розробка технології іммобілізованого ферментного препарату з Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М» викладені результати щодо дослідження способу та умов іммобілізації ГФК штаму 2435/М, а також визначення готової форми та технологічних режимів отримання іммобілізованого ГФП (Циторецифен-М).

Проаналізувавши сучасні розробки, особливості різних способів іммобілізації та враховуючи потенційні сфери застосування ГФП як антисептичного засобу, для реалізації поставленого завдання був обраний спосіб адсорбційної іммобілізації. Перевагами даного способу іммобілізації є простота, ефективність та технологічність процесу.

Як свідчать експериментальні дані, найвища залишкова активність на рівні 50-70 % відзначається у іммобілізованих препаратів на основі поліоксиетилену, поліетиленгліколю та аеросилу, що є прийнятним показником ефективності при розробці аналогічних препаратів (табл. 3).

Таблиця 3 - Визначення літичної активності ферментних препаратів, іммобілізованих на різних носіях

Носій Тест-ультура	Літична активність, од/см3
	Поліокси-етилен	Поліетилен-гліколь	Аеросил	Полівініло-вий спирт	Метил-целюлоза	Поліакриламід	Контроль
L. bulgaricus	570±7	350±7	370±7	320±6	360±8	250±7	680±14
S. aureus	230±5	250±3	250±3	290±5	210±6	270±10	770±19
E. coli	240±4	150±3	140±6	60±3	120±4	50±2	380±8

В роботі наведені спектри, що характеризують наявність функціональних груп та зв'язків у нативному ферментному препараті, використаних носіях та отриманих іммобілізованих препаратах.

Аналіз спектрів дає змогу встановити взаємодію ферменту з поліетиленгліколем та поліоксиетиленом по пептидному зв'язку та простій ефірній групі носія, а також по гідроксильним групам, що беруть участь в утворенні водневого зв'язку.

Представлені спектри аеросилу та іммобілізованого на ньому ферменту (рис. 3) вказують на відмінності у розташуванні та наявності окремих характеристичних смуг, що свідчать про утворення водневих зв'язків із силанольними групами поверхні кремнезему. Наявність на білковій молекулі великої кількості центрів, здатних утворювати водневі зв'язки з ОН-групами кремнезему, значно посилює адсорбцію. Поява смуги в області 3437 см-1, за даними літератури, ідентифікує гідроксильні групи та вказує на взаємодію аеросилу та ферменту по ОН-групам, в якій приймають участь й залишки зв'язаної з ферментом води по типу міжмолекулярної взаємодії.

При дослідженні іммобілізованого на аеросилі препарату окремі функціональні групи ферменту не ідентифікувалися, однак активність препарату була високою. Вірогідно, відбувається закріплення ферменту за багатоцентровим механізмом, внаслідок чого одна молекула утворює одночасно декілька зв'язків з носієм за участю різних функціональних груп.

Спектральне дослідження іммобілізованих зразків вказує, що механізми взаємодії ферменту з аеросилом є різноманітнішими, а наявність великої кількості гідроксильних груп на його поверхні обумовлює утворення додаткової кількості водневих зв'язків (рис. 4). Це визначає загалом вищу міцність адсорбційної іммобілізації ферменту на аеросилі і обумовило його вибір як носія для подальшої роботи.

Рис. 3 - Спектральні характеристики: а)- аеросил; б) -іммобілізований на аеросилі ГФП.

Рис. 4 - Схема міжмолекулярних водневих зв'язків аеросилу та ферменту.

До основних параметрів процесу іммобілізації відносять рН, температуру, концентрацію носія та тривалість контакту. Тому, на наступному етапі роботи визначали вплив даних параметрів процесу на ефективність іммобілізації ГФК адсорбційним способом.

Вплив рН на ефективність іммобілізації визначали у борно-лужній (рН 8,4), фосфатно-лужній (рН 6,2), цитратній (рН 4,1) реакційних системах та фізіологічному розчині (рН 7,4). Встановлено, що проведення іммобілізації з використанням готового препарату у фосфатно- або борно-лужних системах підвищує її ефективність в середньому на 10-15 %. Однак, в роботі показано, що при проведенні іммобілізації з використанням фугату культуральної рідини продуценту, корегування рН є недоцільним, оскільки підвищення ефективності в такому випадку практично не відбувається. Очевидно, це пов'язано із впливом окремих компонентів самого фугату.

Надалі досліджували можливість отримання іммобілізованого препарату безпосередньо в ході виробничого процесу, порівнюючи іммобілізацію ферментного комплексу з використанням розчину готового препарату та фугату культуральної рідини, отриманої в процесі біосинтезу (рис. 5).

Рис. 5. Порівняння ефективності іммобілізації ГФК з використанням фугату культуральної рідини продуценту (а) та розчину готового ферментного препарату (б)

Отримані дані вказують на значну різницю ефективності цих процесів. При іммобілізації ферменту з фугату зв'язується 85 % ГФК, а використання для цього розчину готового ферменту призводить до його іммобілізації лише на рівні 55 %. Очевидна перевага та можливість отримання іммобілізованого препарату в ході біотехнологічного виробництва. Тому, на наступному етапі визначали оптимальні умови іммобілізації ферментного комплексу (рис. 6).

Рис. 6 - Вплив умов іммобілізації ГФК на ефективність процесу: а) -температури; б) - концентрації носія; в)- тривалості процесу

Представлені дані вказують на підвищення ефективності іммобілізації зі збільшенням температури від 10 до 30 єС і досягнення практично максимального рівня при 30 єС . Подальше підвищення температури видається недоцільним, зважаючи на термолабільність ферменту. Оптимальною концентрацією носія (рис. 6,б) є 5-7 %. Максимальна адсорбція ферментного комплексу на аеросилі відбувається впродовж 30-45 хв, про що свідчить однаковий рівень активності зразків (2800 од/см3). Визначені параметри та особливості процесу були покладені в основу розробки способу отримання іммобілізованого ГФП (названого Циторецифен-М), на який було отримано Патент України.

Передбачувані області використання Циторецифену-М, як антисептичного засобу, зумовили необхідність вибору відповідної готової форми. Тому, досліджували можливість отримання готових форм сухого та гелеподібного іммобілізованих препаратів на основі Н2Одист. і фізіологічного розчину та визначали їх стабільність при зберіганні (рис. 7). Наведені дані свідчать про швидку втрату активності гелеподібного препарату впродовж 28 діб, причому в цілому схожа динаміка відзначається щодо літичної та протеолітичної активностей. Фізіологічний розчин виявляє негативний вплив на літичну активність ферментного препарату, але активує протеїнази ферментного комплексу.

Дослідження стабільності сухого препарату (рис. 8) показує, що втрати літичної активності при зберіганні протягом 4 тижнів майже не відбувається, а зниження рівня ПА наприкінці зберігання становить близько 5 %.

Рис. 7 - Дослідження динаміки літичної (а) та протеолітичної (б) активностей гелеподібної форми іммобілізованого ферментного препарату

Рис. 8 - Дослідження динаміки літичної та протеолітичної активностей сухого іммобілізованого препарату

Наведені дані свідчать про високу стабіль-ність сухої форми іммобілізованого Циторецифену-М (з провідною літичною активністю) та вказують на доцільність створення готової форми порошку.

Для висушування іммобілізованого препарату використовували контактний та ліофільний способи сушіння, а отримані зразки аналізували методом скануючої електронної мікроскопії. Узагальнюючи дані мікроскопічного аналізу зразків препаратів (наведені в дисертації) можна сказати, що ліофілізований препарат відрізняється однорідною порошкоподібною структурою та більшою поверхнею контакту, а інший препарат - більш твердою структурою та частками/гранулами. Це обумовлює доцільність їх застосування у різних сферах: медичних або косметичних засобах та побутових антисептичних препаратах, відповідно.

Наведені результати дозволяють визначити оптимальну готову форму іммобілізованого Циторецифену-М, а саме порошок (гранули). Препарат може бути висушений контактним або ліофільним способом, що визначатиме його подальше застосування.

Враховуючи отримані дані, на основі базової технології нативного Циторецифену (Тодосійчук Т., 2000) розроблено апаратурну та технологічну схему отримання іммобілізованого препарату Циторецифен-М побутового призначення, а також створено Технологічний тимчасовий регламент виробництва.

Технологічна схема отримання продукту наведена в роботі і складається з наступних основних стадій: підготовка обладнання та матеріалів, підготовка та стерилізація поживних середовищ, підготовка посівного матеріалу, виробничий біосинтез ГФК, вилучення біомаси, іммобілізація та відділення ферментного препарату, сушіння контактним способом, подрібнення препарату, пакування та маркування продукції.

Розроблена апаратурна схема виробництва іммобілізованого препарату Циторецифен-М наведена на рис. 9. Технологія нативного препарату Циторецифен передбачала використання баромембранних методів очищення та концентрування продукту. Препарати технічного (побутового) призначення відрізняються, як правило, нижчими вимогами до чистоти готового продукту (вмісту домішок). Тому, зважаючи на отримані дані, які свідчили, що в процесі іммобілізації відбувається практично 90 % адсорбція ферментного комплексу з фугату культуральної рідини, було запропоновано не застосовувати баромембранні методи очистки та концентрування. Для іммобілізації ферменту використовували концентрацію аеросилу 5 % (див. рис. 6) з наступним розділенням рідкого гелю, що містить практично весь ферментний комплекс, центрифугуванням. Запропонований прийом дає змогу сумістити в собі виділення, концентрування та іммобілізацію ферменту, що зумовлює ефективність, технічну простоту та економічність розробки.

Реалізація запропонованої біотехнології дає змогу отримати сухий гранульований іммобілізований гідролітичний ферментний препарат Циторецифен-М з літичною активністю 50-55 тис. од/г. Препарат призначений для використання як індивідуальний антисептичний засіб побутового та виробничого призначення, а також у складі комбінованих препаратів, що показано у п'ятому розділі роботи.

Рис. 9 - Апаратурна схема виробництва іммобілізованого препарату Циторецифен-М: К-1 - колби для вирощування посівного матеріалу, Р-2 - реактор для приготування та стерилізації поживного середовища, Р-3 - інокулятор, Р-4 - біореактор, Ф-5 - центрифуга, В-6 - дозуючий пристрій (ваги), Р-7 - реактор для іммобілізації, СШ-8 - контактна сушарка, П-9 - подрібнювач, В-10 - дозуючий пристрій (ваги), Пз-11 - пристрій для запаювання.

Трубопроводи: -Т 1.0- Вода питна; -Т 2.0- Пара; -Т 3.0- Стерильне повітря; -Т 29- Каналізація.

У п'ятому розділі «Дослідження напрямів практичного використання Циторецифену-М» визначали характеристики отриманого препарату та сфери його практичного використання, зважаючи на широкий спектр протимікробної активності нативного Циторецифену (Тодосійчук, 1998, 2000, 2004; Гниломедова, 1986; Соколова, 1986).

Для встановлення можливості використання Циторецифену-М у складі синтетичних миючих засобів (СМЗ) досліджували вплив їх основних типових компонентів (сульфонолу та синтанолу) на препарат та характер взаємного впливу ферментів іншої специфічності (протеаз та амілаз).

Дослідження впливу сульфонолу та синтанолу у концентрації 5% на рівень деградації суспензії стафілококу Циторецифеном-М, показали, що вони не виявляють негативного впливу на літичну активність препарату, а отже він може бути застосований при розробці композицій СМЗ з антисептичним ефектом.

Результати визначення взаємного впливу Циторецифену-М та протеаз і амілаз (відповідно, Протеази С і Глюкозиму L 400, Термозиму L 340), що наведені в роботі, вказують на їх сумісність для підсилення протеолітичної та амілолітичної активностей композицій.

Встановлено оптимальні співвідношення препаратів у таких композиціях: Циторецифен-М : Протеаза С : Глюкозим 1:1:0,2 та Циторецифен-М :Глюкозим 1:0,5. Композиції виявляють високу активність при 37 °С та рН 8,5 (характерним для умов застосування СМЗ). Показано, що Циторецифен-М може бути використаний у складі СМЗ і як індивідуальний компонент з високим рівнем літичної, протеолітичної та певним рівнем амілолітичної активностей.

На основі токсико-гігієнічних досліджень попередньо було встановлено, що штам-продуцент Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М відноситься до непатогенних для теплокровних тварин. На підставі даного факту вивчали аспекти можливого медичного застосування Циторецифену-М при створенні відповідної готової форми.

Подані в роботі результати свідчать, що бактеріостатична активність препарату по відношенню до музейних та клінічних штамів Pseudomonas aеruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus зростає із збільшенням його концентрації у діапазоні 6-25 мг/см3, а при подальшому її підвищенні до 50-75 мг/см3 ефективність препарату знижується, що пояснюється збільшенням густини суміші та гальмуванням дифузійних та масообмінних процесів. Це дозволяє встановити бактеріостатичну концентрацію Циторецифену-М у діапазоні 6-20 мг/см3, а в середньому для всіх досліджуваних тест-культур - на рівні 10 мг/см3.

Проводили порівняльний аналіз бактеріостатичної активності нативного й іммобілізованого препаратів Циторецифен-М. Вирощування тест-культур з внесенням нативного Циторецифену призводило до зниження кількості життєздатних мікроорганізмів на 63 та 60 %, а при використанні його іммобілізованої форми на 87 та 81 % щодо E.coli та St.aureus, відповідно. (табл. 4).

Таблиця 4 - Визначення бактеріостатичної активності досліджуваних препаратів

Зразок	Відсоток життєздатних клітин E. coli після інкубації з препаратами	Відсоток життєздатних клітин St.aureus після інкубації з препаратами
Циторецифен (нативний)	37	40
Циторецифен-М (іммобілізований)	13	19
Контроль	100	100

Контроль - культури, вирощені на МПБ без додавання препаратів.

Отримані дані вказують на підвищену практично вдвічі бактеріостатичну дію іммобілізованого препарату Циторецифен-М у порівнянні з нативним, що визначає доцільність запропонованої розробки.

ВИСНОВКИ

1. Визначена здатність обраного штаму-продуценту гідролітичного ферментного комплексу Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М до утилізації нативного крохмалю та соєвого борошна спеціальної обробки. Вперше показана стимулююча дія аеросилу у концентрації 0,1 % на біосинтез ферментного комплексу. На основі встановлених даних оптимізовано склад поживного середовища для біосинтезу гідролітичного ферментного комплексу вказаним штамом, що дозволило підвищити вихід продукту на 20 % та спростити процес підготовки поживного середовища у виробничому процесі.

2. Основними механізмами іммобілізації гідролітичного ферментного комплексу Str. recifensis var. lyticus 2435/М на поліетиленгліколі, поліоксиетилені та аеросилі є утворення водневих зв'язків, електростатичні та багатоцентрові взаємодії. Взаємодії гідролітичного ферментного комплексу з аеросилом є більш різноманітними та включають додатково утворення ними водневих зв'язків із силанольними групами та чисельними ОН-групами поверхні носія за участю залишків зв'язаної з ферментом води, що визначає загалом вищу міцність закріплення ферменту на аеросилі.

3. Встановлені оптимальні параметри процесу іммобілізації гідролітичного ферментного комплексу адсорбційним способом на аеросилі марки А-300: температура 28-32 єС, концентрація носія 5-7 %, тривалість процесу 30-45 хв. Одержані дані були покладені в основу розробки способу отримання іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М, захищеного патентом України (№ 31448, 2008 р.).

4. На основі результатів досліджень розроблено технологічну і апаратурну схеми та Технологічний тимчасовий регламент на виробництво сухого гранульованого іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М з літичною активністю 50-55 тис. од/г. Проведена апробація запропонованої біотехнології у дослідно-промислових умовах ВО «Ензим» (м. Ладижин, Вінницька обл.).

5. Визначено, що бактеріостатична активність одержаного іммобілізованого препарату Циторецифен-М у 2 рази перевищує активність нативного препарату, а встановлена бактеріостатична концентрація іммобілізованого препарату становить 10 мг/см3.

6. Показана можливість використання Циторецифену-М у складі синтетичних миючих засобів з антисептичним ефектом як індивідуально, так і у композиціях з гідролазами іншої специфічності (амілазами, протеазами). Встановлені оптимальні співвідношеннях ферментів у композиціях: Циторецифен-М : Протеаза С : Глюкозим (1:1:0,2) та Циторецифен-М: Глюкозим (1:0,5). Розроблені композицїї проявляють високу активність в умовах, що характерні для застосування синтетичних миючих засобів (температура 37-40 °С, рН=8-9).

7. Визначені перспективи розробки готових форм Циторецифену-М медичного призначення (ліофілізований порошок-присипка та гель поверхневого застосування). Запропоновані готові форми гідролітичного ферментного препарату мають переваги, обумовлені властивостями обраного носія - підвищену адсорбуючу здатність та зручність нанесення.

8. Економічна доцільність розробки обумовлена зниженням собівартості запропонованого поживного середовища для біосинтезу продукту на 15 % за рахунок оптимізації його складу та заміни гідролізованого крохмалю нативним, що дає змогу економити 21тис. грн/рік (або більш ніж 2100 грн/т продукту).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Григор'єва М.А. Дослідження готових форм іммобілізованого ферментного препарату Циторецифен для медичного використання / М.А. Григор'єва, Н.В. Москаленко, Т.С. Тодосійчук // Український журнал медичної техніки і технології. - 2006. - №4. - С. 12-20 (Здобувачем визначено динаміку бактеріо- та протеолітичної активностей у досліджуваних формах іммобілізованого препарату, встановлено переваги порошку як готової форми, показана ефективність комбінованих препаратів).

2. Тодосійчук Т.С. Дослідження ефективності іммобілізації ферментного препарату Циторецифен адсорбційним методом / Т.С. Тодосійчук, М.А. Григор'єва, Н.В.Москаленко // Український журнал медичної техніки і технології. - 2007. - №1. - С. 17-25 (Здобувачем досліджені різні носії для іммобілізації ферментного препарату, досліджено вплив рН та температури на ефективність процесу, показані переваги аеросилу як носія).

3. Григор'єва М.А. Вплив альтернативних джерел живлення на біосинтетичну здатність продуценту лізоензимного комплексу / М.А. Григор'єва, Т.С. Тодосійчук, Н.В. Москаленко, В.М. Поводзинський // Наукові праці НУХТ. - 2007. - № 22. - С. 29-32 (Здобувачем особисто досліджено здатність продуценту лізоензимного комплексу до утилізації нативного крохмалю, різних видів борошна спеціальної обробки, показана стимулююча дія аеросилу на біосинтетичні процеси; встановлено діапазони робочих концентрацій вказаних компонентів у середовищах).

4. Григор'єва М.А. Іммобілізація ферментів як спосіб отримання ефективних біопрепаратів для практичного застосування / М.А. Григор'єва // Наукові вісті КПІ. - 2008. - № 1, (57). - С. 97-107.

5. Григор'єва М.А. Оптимізація складу поживного середовища для біосинтезу ферментного комплексу продуцентом р. Streptomyces / М.А. Григор'єва, В.В. Клочко, Т.С. Тодосійчук // Наукові вісті КПІ. - 2008. - № 3, (59). - С.111-118 (Здобувачем особисто проведено оптимізацію поживного середовища для біосинтезу ферментного комплексу штамом Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М).

6. Патент України, МПК С 12 N 1/00, A 61К 35/00. Спосіб одержання гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М / Тодосійчук Т.С., Григор'єва М.А., Поліщук Н.В.: заявники; Тодосійчук Т.С.: патентовласник. - № 31448; заявл. 30.11.07, опубл. 10.04.2008, Бюл. №7 (Здобувачем встановлено основні умови та технологічні режими проведення іммобілізації ферментного препарату Циторецифен-М адсорбційним методом).

7. Тодосійчук Т.С. Застосування Циторецифену для отримання біологічно активних структур клітин молочнокислих бактерій / Т.С. Тодосійчук, Л.М. Шинкаренко, М.А. Григор'єва // Сучасні наукові дослідження - 2006: матер. ІІ міжнар. наук.-практ. конф., 20-28 лютого 2006 р. - Дніпропетровськ: Наука і освіта. - 2006. - Т. 20. - С. 51-54 (Здобувачем визначені основні умови дезінтеграції клітин молочнокислих бактерій ферментним препаратом).

8. Крупская Т.В. Антимикробные свойства левомицетина, адсорбированного на поверхности высокодисперсного кремнезема / Т.В. Крупская, В.Н. Барвинченко, М.А. Григорьева, Т.С. Тодосийчук, О.В. Шульга, В.В. Туров // Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья: матер. ІІ Всероссийской науч. конф. с междунар. участ., 18-23 сентября 2006 г. - Москва-Белгород. - 2006. - С. 119-122 (Здобувачем особисто проведено визначення бактеріостатичної дії зразків біопрепаратів на основі високодисперсного кремнезему).

9. Крупська Т.В Дослідження процесів життєдіяльності та росту біомаси одноклітинних мікроорганізмів за наявності високодисперсного кремнезему і модифікованих кремнеземів / Т.В. Крупська, В.М. Барвінченко, М.А. Григор'єва, Т.С. Тодосійчук, В.В. Туров // Фармацевтичний журнал. - 2008. - №1. - С. 95-101 (Здобувачем проведено визначення впливу високодисперсного кремнезему на ростові процеси тест-культур).

10. Григор'єва М.А. Дослідження взаємного впливу гідролітичних ферментів у складі багатокомпонентних препаратів / Т.С. Тодосійчук, М.А. Григор'єва // Хімія і сучасні технології: ІІ міжнар. наук.-техн. конф. студентів і аспірантів та молодих вчених, 26-28 квітня 2005 р.: тези допов. - Дніпропетровськ. - 2005. - С. 309 (Здобувачем проведено визначення ферментативних активностей препаратів).

11. Григорьева М.А. Исследование противомикробной активности иммобилизованных биопрепаратов / М.А. Григорьева, Т.В. Крупская, Н.В. Москаленко // Фундаментальные исследования в технических университетах: матер. Х Всероссийской конф. по проблемам науки и высшей школы, 18-19 мая 2006 г. - Санкт-Петербург. - 2006. - С. 377 (Здобувачем підготовлені тест-системи для визначення протимікробної дії зразків препаратів).

12. Москаленко Н.В. Дослідження методів іммобілізації гідролітичного ферментного препарату Циторецифен / М.А. Григор'єва, Н.В. Москаленко, К.В. Козлова // Молодь та поступ біології: ІІ міжнар. наук. конф. студентів і аспірантів, 21-24 березня 2006 р.: зб. тез. - Львів. - 2006.- С. 43-44 (Здобувачем проведено визначення бактеріостатичної дії зразків біопрепаратів на основі різних носіїв).

13. Grygorieva M.A. Investigation of the antimicrobial activity of biocomposites on the base of high-dispersianally Silica / M.A. Grygorieva, V.V. Klochko // Сучасний стан і пріоритети розвитку фізіології рослин, генетики та біотехнології: матер. десятої конф. молодих вчених, 25-26 жовтня 2007 р. - Київ. - 2007. - С. 40-41 (Здобувачем особисто встановлено антимікробну активність зразків біопрепаратів на основі високодисперсного кремнезему).

АНОТАЦІЯ

Григор'єва М.А. Біотехнологія іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата технічних наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія (технічні науки). Національний університет харчових технологій МОН України, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено розробці біотехнології іммобілізованого гідролітичного ферментного препарату Циторецифен-М з використанням штаму-продуцента Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М.

Проведено оптимізацію поживного середовища для біосинтезу ферментного препарату вказаним штамом та показано можливість заміни в його складі гідролізованого крохмалю нативним, доцільність використання соєвого борошна спеціальної обробки та стимулююча дія аеросилу в концентрації 0,1 %. Визначено ефективність використання високодисперсного кремнезему (аеросилу) для отримання іммобілізованого препарату Циторецифен-М та встановлені оптимальні параметри проведення процесу іммобілізації адсорбційним способом.

На основі проведених досліджень розроблені апаратурна та технологічна схеми, а також Технологічний тимчасовий регламент виробництва іммобілізованого препарату Циторецифен-М. Розроблена технологія передбачає виробниче культивування продуцента на оптимізованому поживному середовищі, вилучення біомаси центрифугуванням, іммобілізацію ферменту на аеросилі (5 %) адсорбційним способом з наступним відділенням препарату центрифугуванням та висушуванням контактним способом. Запропонована технологія дає змогу сумістити виділення та іммобілізацію ферменту, що зумовлює ефективність, технічну простоту та економічність розробки. Проведена апробація технології у дослідно-виробничих умовах.

Встановлено бактеріостатичну концентрацію отриманого препарату (10 мг/см3), показана можливість використання Циторецифену-М у складі синтетичних миючих засобів з антисептичною дією, а також перспективи застосування його як медичного протимікробного засобу поверхневої дії.

Ключові слова: гідролітичний ферментний препарат, оптимізація поживного середовища, іммобілізація адсорбційним способом, готові форми, технологія іммобілізованого препарату, антисептичний засіб.

ANNOTATION

Grygorieva M.A. Biotechnology of immobilizing hydrolytic enzyme preparation Cytоrecifen-М. - Manuscript.

The thesis is for a scientific degree of the Candidate of Technical Sciences by specialty 03.00.20 - biotechnology (technical science). - National University of Food Technologies of Ministry of Education and Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

The dissertation is devoted to proved biotechnology of immobilizing hydrolytic enzyme preparation Cytоrecifen-М development on the base of Streptomyces recifensis var. lyticus 2435/М producer.

It was optimizing nutrient medium for biosynthesis of enzyme preparation by selected strain. It has shown opportunity of replacement in its composition of hydrolyzed starch by native, expediency using soya flour of special treatment and stimulating action of silica in 0.1% concentration. It has determined efficiency of high disperses silica (aerosil) using for obtaining of immobilizing Cytоrecifen-М preparation and it was specifying optimum parameters of immobilization processing with absorptive method.

According to research conduct, it has developed apparature and technological schemes and it has created of Technological temporary regulation for production of immobilizing preparation Cytоrecifen-М. Developed technology predicts industrial producer cultivation on optimized nutrient medium, separated biomass by centrifugation, enzyme immobilization on 5% silica (aerosil) with subsequent centrifugation separating and drying out in contact way. Proposed technology enables to combine allocation and enzyme immobilization that predetermines efficiency, technical simplicity and development profitability. It has conducted approbation technology in research-industrial conditions.

It has established bacteriostatic concentration of received preparation (10mg/cm3) and it has shown an opportunity of Cytоrecifen-М use in composition of synthetic cleansing agent with antiseptic effect and its prospects use as medical surface antimicrobial agent.

Key words: hydrolytic enzyme preparation, optimization of nutrient medium, adsorptive immobilization, ready forms, technology of immobilizing preparation, antiseptic means.

Размещено на Allbest.ru