Методы генетики для изучения популяций кумжи (Salmo trutta L.)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Абхазский Государственный Университет

Биолого-географический факультет

Кафедра экологии и морфологии животных

Курсовая работа

Методы генетики для изучения популяций кумжи (Salmo trutta L.)

г. Сухум 2011 г.

Введение

В популяционной генетике среди большого разнообразия исследуемых форм огромное значение имеют исследования видов, популяции которых имеют широкое распространение, разобщены в пространстве, характеризуются сложной популяционной структурой и репродуктивным поведением. Одним из таких видов, имеющих огромное промысловое значение, является кумжа Salmo trutta L., типичный представитель семейства лососевых (Salmoidae). Это анодромный вид с несколькими подвидами, образующий в пресных водах жилую расу (форель).

Кумжа является наиболее изученным в популяционно-генетическом отношении видом, на котором отрабатывается применение новых молекулярно-генетических методов анализа изменчивости. Эти методы направлены на изучение полиморфизма ДНК, отражающего состояние генофонда популяций.

В данной курсовой работе рассмотрены основные методы генетики, основанные на применении различных молекулярных маркёров, способствующих изучению полиморфизма ДНК. Для выявления изменчивости ДНК применяются минисателлитные и микросателлитные маркёры, RAPD- и AFLR-маркёры, SNP-маркёры и др. На основе данных о полиморфизме ДНК получают различные популяционно-генетические показатели, необходимые для оценки состояния генофонда популяций. Это имеет важное значение для генетического мониторинга видов, особенно для кумжи в связи с её большим промысловым значением.

Глава 1. Биологические особенности кумжи

1.1 Экология кумжи

Кумжа (Salmo trutta Linnaeus, 1758) существует в природе в разнообразных формах, отличающихся друг от друга внешне, по месту существования и экологии. Как и другие представители лососёвых, кумжа является анодромным видом, размножение и первые этапы жизни которой проходят в пресных водоёмах, а дальнейшее развитие, рост и нагул - в морских водах. Кроме того, вид характеризуется наличием полностью пресноводных жилых популяций. Поэтому проходную форму Salmo trutta L. называют кумжей, а пресноводную - форелью.

Подвиды кумжи, попав в реки и не имея возможности вернуться в море, остаются в пресной воде и превращаются в форель, которая не достигает величины кумжи и живёт и размножается в ручьях. Это наиболее распространённая теория образования ручьевой форели.

Кумжа является проходной рыбой, нерестящейся в реках. В зависимости от мест распространения, сроки нереста варьируют от сентября до февраля. Средняя плодовитость кумжи составляет 7-12 тысяч икринок. Нерестилища располагаются как в верховьях рек, так и в среднем течении. Икрометание в течение жизни от 4 до 11 раз. Считается, что там, где существует проходная и жилая формы кумжи, они составляют единое стадо, нерестующее вместе. В популяции проходной кумжи преобладают самки, недостаток самцов компенсируется за счёт жилой формы, т.е. ручьевой форели, где особи мужского пола обитают в большинстве. Во время нерестового хода кумжа не прекращает питаться. Молодь её нагуливается в реке от одного до семи лет, затем, при достижении длины 20 см, скатывается в море.

Для кумжи, как и для других лососёвых, характерен хоминг ( от англ. home), то есть инстинкт родного дома. При этом особь возвращается для нереста в те же пресные водоёмы, где и «родилась». Отклонение от строгого хоминга, т.е. возврат для нереста не вы место рождения, а на другие территории, называется стрэингом ( от англ. to stray - сбиться с пути, заблудиться). Хоминг является очень важной биологической особенностью зоологических видов. Он создаёт очевидные предпосылки для сильной внутривидовой дифференциации в соответствии с историей и географией видового ареала. Эта изоляция в период нереста, усиленная сложным репродуктивным поведением, способствует формированию множества репродуктивных популяций, или локальных стад, рассеянных на громадных пространствах.

1.2 Систематика

Кумжа ( Salmo trutta L.) - типичный представитель семейства Лососёвых (Salmonidae) из отряда Лососеобразных ( Salmoniformes). Вид имеет сложную популяционную структуру и делится на подвиды.

Систематики выделяют 6 подвидов Salmo trutta L., из которых в водах Росии и бывшего СССР обитают пять: 4 проходных и 1 озёрный:

Salmo trutta trutta L. - обыкновенная кумжа (проходная) и форель (пресноводная) - обитает в бассеинах Балтийского, Белого и Баренцова морей на восток до Печоры.

Salmo trutta caspius Kessler - каспийская кумжа - обитает в бассеине Каспийского моря; на нерест идёт в р. Куру, в бассеине которой образует жилую форму ( форель ).

Salmo trutta ciscaucasicus Dorofeeva - предкавказская кумжа - обитает в бассеине Каспийского моря; на нерест идёт в реки западного побережья (кроме Куры), повсеместно образует пресноводные формы форели.

Salmo trutta ezenami Berg - эйзенамская форель - пресноводная форель, обитает только в озере Эйзенам ( Дагестан ).

Salmo trutta labrax Pallas - черноморская кумжа (черноморский лосось) - обитает в бассеинах Чёрного и Азовского морей, образует пресноводные формы форели (Salmo trutta morpha fario L.).

1.3 Основное представление о генофонде кумжи

Кумжа представляет собой наиболее исследованный в популяционно-генетическом плане вид лососей. Наиболее важными популяционно-генетическими показателями являются уровень общей гетерозиготности, внутри- и межпопуляционного генного разнообразия. А. Фергюсон обобщил известные к концу 1980 годов данные о внутрипопуляционной аллозимной изменчивости кумжи. Наблюдаемая гетерозиготность популяций колеблется по ареалу от 0 до 0,122 (в среднем 0,047), а доля полиморфных локусов от 0 до 0,398 (в среднем 0,160). В целом в атлантической части кумжи межпопуляционное генное разнообразие составляет 60%.

Особенно значительна генетическая дифференциация между совокупностями популяции северных и южных районов на территории бывшего СССР и североатлантического и средиземноморского бассейнов на территории Западной Европы. В северных популяциях показатель GST в целом ниже, чем в южных. Это объясняется тем, что в южных регионах обитают популяции кумжи, во-первых, более древние из-за отсутствия здесь оледенений и соответственно с более длительным периодом дивергенции, а во-вторых, гидрографически связанные с разными морскими бассейнами - североатлантическим и средиземноморским. Наиболее велика межпопуляционная изменчивость в этих регионах по локусам СК-2*, GPI-2*, MEP-1* и -3*, а среди популяций североатлантического бассейна - по PEP-LT*, LDH-5*, GPI-2*, LDH-1*.

Генетическое своеобразие субпопуляций кумжи наблюдается в отсутствии каких-либо изолирующих физических барьеров и сопровождается хорошо выраженной морфологической и экологической дифференциацией.

В распределении аллелей отдельных локусов по ареалу кумжи наблюдаются определённые закономерности, отражающие как полагают, историю происхождения современных популяций в ходе послеледникового заселения Северной Европы, начавшегося 10-18 тысяч лет назад.

Предполагается, что картина географического распространения аллелей локуса LDH-5 (*100 и *90) в определённой степени обусловлено историей этого заселения. Так, среди популяций кумжи, связанных с бассейнами Средиземного, Чёрного и Каспийского морей, в локусе LDH-5 фиксирован аллель 100* , тогда как в популяциях бассейнов Балтийского и Белого морей встречаются оба аллеля *100 и *90. Была предложена гипотеза о том, что Скверная Европа заселялась двумя «расами» кумжи. Первая, по-видимому, более древняя раса, обладавшая аллелем LDH-5 *100, могла распространяться из рефугиума, находившегося в бассеине Бискайского залива. Вторая, более молода раса, обладавшая аллелем LDH-5 *90, могла расселяться из рефугиума, располагавшегося в бассеинах Балтийского или Белого морей, и вытеснять в той или иной мере «древнюю» расу.

Исследование митохондриального ДНК в популяциях кумжи позволили уточнить историю их формирования, при анализе кодирующих и некодирующих сегментов мтДНК в выборках, охватывающих весь видовой ареал, обнаружено 5 основных филогенетических линий, составляющих современный митохондриальный генофонд кумжи. Популяции атлантического бассейна принадлежат к одной атлантической линии, а популяции бассейнов Чёрного, Каспийского, Аральского и Дуная относятся к дунайской линии. Все остальные типы митохондриального ДНК подразделяются ещё на три филогенетические группы, найденные в популяциях средиземноморской территории от Испании до Турции.

Кумжа, как уже отмечалось, - один из наиболее изученных и изучаемых в популяционно-генетическом плане видов рыб, на котором отрабатывается применение новейших молекулярных методов анализа изменчивости. Именно для групп популяций кумжи из разных участков ареала, изучавшихся по аллозимным генам, получены оценки межпопуляционной генетической изменчивости (FST) на основе полиморфизма фрагментов мтДНК и минисателлитных локусов. Сравнение показывает, что оценки FST по аллозимным и минисателлитным локусам весьма сходны, но могут оказаться как сходными, так и отличающимися от оценок FST по мтДНК.

Оценки FST, полученные для популяций кумжи по отдельным минисателлитным локусам (селективно нейтральные участки генома), довольно близки между собой, как и должно быть для нейтральных маркёров. Следовательно, и усреднённый по многим аллозимным генам величины FST, будучи сходными с соответствующими величинами по минисателлитам, также могут рассматриваться как оценки уровня селективно нейтральной дифференциации. Но величины FST, полученные по отдельным аллозимным генам, в отличие от оценок по минисателлитам, варьируют гораздо сильнее, что очевидно, служит указанием на разнообразие селективной значимости аллозимных генов.

Наконец, приведём для кумжи усреднённые пор регионам величины основных популяционно-генетических показателей: величина общего генного разнообразия НТ = 0,0837, величина внутрипопуляционного генного разнообразия (HS) равна 0,0526 и величина межпопуляционного генного разнообразия (GST) составляет 37,10 (Алтухов, 2004).

1.4 Искусственное воспроизводство

В настоящее время мировые масштабы искусственного воспроизводства лососей составляют более 5 млрд экземпляров молоди, что примерно равно 20% от общего количества скатывающейся в море молоди лососей. Бурно развивается аквакультура - садковое (товарное) выращивание лососей на специальных фермах. При этом неизбежным представляется генетическое последствие искусственного разведения. Эти последствия можно выявить при сравнении природных и искусственно поддерживаемых популяций атлантических лососей - сёмги Salmo salar и кумжи S. trutta - обнаруживаются два противоположно направленных процесса, связанных с перераспределением внутри- и межгрупповой компонент генного разнообразия.

Так, у сёмги, воспроизводимой на рыбоводных заводах, межпопуляционная генетическая дифференциация существенно выше, а внутрипопуляционный полиморфизм ниже, чем в природных условиях. Прямо противоположная, но ещё более рельефная картина характерна для испанских и французских стад кумжи. Очевидно, что в случае с сёмгой рыбоводная деятельность приводит к нарастанию инбридинга, чему способствует малая численность производителей, используемых для воспроизводства. В случае же кумжи нарастание внутрипопуляционной гетерозиготности и стирание межпопуляционной генетической дифференциации есть следствие либо перемешивания генофондов различных по происхождению маточных линий, либо отбора в пользу гетерозигот. В случае с сёмгой наблюдаются последствия инбридинга, а в случае с кумжей - аутбридинга. Есть сведения, что гибридизация заводских и природных стад кумжи разрушает репродуктивную изоляцию популяций.

В целом, выявление противоположных генетических процессов, сопровождающих искусственное разведение, свидетельствует о том, что при этом может нарушаться равновесие между инбридингом и аутбридингом, которые взаимно уравновешивают друг друга в условиях нормального воспроизводства дифференцированного генофонда (т. е. в нативных системах популяций).

Таблица 1. Генетическая изменчивость природных и заводских популяций лососей:

Вид, район	Природные	Заводские	Ссылка
	HT	HS	GST	HT	HS	GST
S. trutta Испания	0,069	0,027	0,610	0,092	0,083	0,028	Garsia-Marin et al.,1991
Франция	0,111	0,050	0,550	0,077	0,072	0,063	Krieg, Guyomard, 1985
S. salar Бассеины Балтийского моря, восток и запад Атлантики	0,041	0,038	0,064	0,037	0,030	0,196	Stahl, 1987

Глава 2. Генетические методы исследования популяций

2.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Принцип метода полимеразной цепной реакции (Polymerase chain reaction) был разработан Кэри Мюллисом (США) в 1983 г. и в настоящее время широко используется как для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении и службе госэпидемнадзора. Метод очень эффективен для изучения полиморфизма ДНК. Он позволяет относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК животного и растительного происхождения, включая ископаемые образцы.

Для реализации ПЦР необходимы следующие компоненты:

Ї ДНК-матрица (ДНК или её часть, содержащая искомый специфический фрагмент);

Ї Праймеры (синтетические олигонуклеотиды, включающие 20-30 пн, комплементарные последовательностям ДНК на границах определённого специфического фрагмента);

Ї Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), т. е. смесь четырёх дНТФ, являющихся материалом для синтеза новых комплементарных цепей ДНК.

Ї Фермент Taq-полимераза (термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из термофильных бактерий Thermisaquaticus, катализирующая удлинение цепей праймеров путём последовательного присоединения нуклеотидных оснований к растущей цепи синтезируемой ДНК).

Ї Буферный раствор (реакционная среда, содержащая ионы Мg2+, необходимые для поддержания активности фермента).

ПЦР представляет собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка ДНК, катализируемое ферментом Tag-полимеразой. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах (Приложения, рис. 1):

1.Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°С в течение 30-40 сек.

2. Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига Ї 20-60 сек.

3. Достраивание цепей ДНК (синтез новых цепей). Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5/- конца к 3/- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Процесс синтеза, катализируемый Taq-полимеразой, проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n Ї число циклов амплификации (экспотенциальное увеличение числа цепей). Поэтому, если в исходном растворе первоначально находилась только одна двуцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.

Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматически осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации (Приложения, рис 2).

Метод ПЦР используется для изучения полиморфизма ДНК при помощи таких молекулярных маркёров, как STR, RAPD, AFLR, SNP и др., о которых речь пойдёт дальше.

2.2 Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)

Открытие и выделение рестриктирующих эндонуклеаз, или рестриктаз, позволило разработать маркёры полиморфизма ДНК. Рестриктазы были открыты Верненом Арбером в 1979 г. при заражении фагом л различных штаммов Е. coli. Оказалось, что внутри бактерии ДНК фага разрезается и утрачивает свою инфекционность. Впоследствии выяснилось, что подобным образом обезвреживается не только фаговая, но и любая другая чужеродная ДНК, если она попала в бактериальную клетку.

Такое разрезание (рестрикция) осуществляется специальными ферментами - эндонуклеазами (рестриктазами). Поскольку рестриктазы индифферентны к собственной ДНК, обнаруженное явление рассматривают как защитный механизм бактериальной клетки. Эндонуклеазы вступают в реакцию лишь со специфическими, состоящими из 4-6 пар оснований, деметилтрованными участками ДНК-сайтами узнавания, которые в гомологичной ДНК бактерии защищены метильными группами.

При обработке ДНК рестриктазами образуется фрагмент с так называемыми «липкими» концами, так как после разрезания двуцепочечной ДНК одна из цепей оказывается на несколько нуклеотидов длиннее другой. Липкие концы одного фрагмента могут легко соединяться с такими же участками любого другого фрагмента ДНК, что лежит в основе технологии формирования рекомбинантных молекул ДНК.

В настоящее время выделено несколько сотен рестриктаз, различающихся по сайтам ДНК, которые они распознают и разрезают.

Рестриктазы применяются для различных экспериментальных целей. Особенно важно пользование этих эндонуклеаз для выявления полиморфизма ДНК.

Полиморфизм ДНК вызывается несколькими причинами: точковыми мутациями в виде единичных нуклеотидных замен, ошибками при репликации ДНК в виде инсерций или делеций протяжённостью от одного до сотен или тысяч нуклеотидов, крупными делециями, вставками, транслокациями, транспозициями мобильных генетических элементов и т. п. Определённую роль играют и другие реорганизации ДНК в промежутках между сайтами рестрикции. Все изменения в первичной структуре ДНК ведут к изменениям в длине фрагментов, образующихся под воздействием рестриктаз. Основанный на этом метод анализа получил рабочее название полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ( ПДРФ; англ. RFLP - restriction fragment length polymorphism ).

Впервые ПДРФ был использован как генетический маркёр в 1974 г. при идентификации термочувствительной мутации в геноме аденовируса. Однако широкое применение вариантов полиморфизма ДНК в качестве генетических маркёров началось с 1980 г. после выхода основополагающей работы Ботштейна, в которой были изучены свойства ПДРФ как генетического маркёра, дано теоретическое обоснование его использования и предложен метод оценки уровня информативности. Самим автором метод был успешно применён для картирования генома человека.

Сущность метода ПДРФ заключается в том, что смесь фрагментов ДНК разделяют электрофорезом в агарозном или полиакриламидном гелях и визуализируют через концевое мечение радионуклидами с последующей авторадиографией либо путём окрашивания бромистым этидием.

Данный метод малоэффективен для разделения смеси, представленной множеством фрагментов. Для избирательного выявления в геле каких-то определённых фрагментов ДНК используется гибридизация со специфической пробой (или зондом) обычно методом Саузерна, так называемый Саузерн-блоттинг. Такая проба представляет собой клонированную нуклеотидную последовательность ДНК, комплементарную к специфической последовательности фрагмента и снабжённую радиоактивной или флуоресцентной меткой. Благодаря метке последующие процедуры позволяют визуализировать нужный фрагмент.

Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. При наличии мутации в одном из сайтов рестрикции этот сайт остаётся нерасщеплённым после завершения рестрикции, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделяемых мутантным сайтом и образованию фрагмента ДНК большего размера. В результате длина рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих мутантные сайты, становится полиморфной, что выявляется при сравнении ДНК из разных источников методом ПДРФ.

При отсутствии рестрикции в полиморфнолм сайте на электрофореграммах или в радиоавтографах будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация, зависит от локализации используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможно гибридизация одновременно с двумя соседними рестрикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплементарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рестрикции. Однако, такие зонды очень редко используются на практике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда удаётся выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий полиморфный сайт рестрикции. Чаще всего при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при наличии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую длину.

Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фрагменту ДНК. У особей, гомозиготных по мутаций, будет наблюдаться один бэнд в верхней Части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда, как у гетерозигот появятся оба этих бэнда.

Первичная идентификация полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определёнными генами возможно только при наличии соответствующих ДНК-зондов. Дальнейшая практика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С той целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выделенной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят анализ по методу ПДРФ отдельно для каждой из рестриктаз с набором имеющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной популяции аналогичные исследования проводят в других популяциях.

Полиморфные сайты рестркции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому даже при самой высокой вариабельностью такого сайта число гетерозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50%. Между тем, только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, т. е. осуществить его молекулярную маркировку.

В настоящее время выделены высокоспецифические зонды из многих организмов. При использовании таких проб в геле одновременно выявляются множество сходных локусов, находящихся обычно в гетерозиготном состоянии из-за свойственного им большого числа аллелей. Эти весьма сложные картины фрагментов ДНК, практически абсолютно специфические для отдельных особей, получили название ДНК-фингерпринтов. Была выявлена огромная изменчивость получаемых таким образом картин как внутри, так и среди различных биологических видов. Фингерпринты ДНК очень удобны для определения родства или происхождения, но менее пригодны для изучения межпопуляционных различий из-за того, что почти невозможно установить принадлежность многочисленных аллелей к конкретному локусу и определить частоты аллелей.

ПДРФ- анализ применяется в популяционной генетике, систематике и филогении, при генетическом картировании и в некоторых других областях биологии.

2.3 Секвенирование ДНК

Наиболее широко распространённым методом секвенирования ДНК является дидезоксинуклеотидный метод. Дидезоксинуклеотид -- это полученный искусственным путем нуклеотид, лишенный 2'- и 3'гидроксильных групп при углеродных атомах сахарного кольца (рис.1, А). У дезоксинуклеотида, входящего в норме в состав ДНК, отсутствует только 2'-гидроксильная группа (Приложения, рис.3, Б). Удлинение цепи во время репликации ДНК происходит в результате присоединения очередного нуклеозидтрифосфата к 3'-гидроксильной группе последнего нуклеотида растущей цепи (Приложения, рис.4). И если таким очередным присоединяемым звеном является дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК останавливается, поскольку следующий нуклеотид не может образовать фосфодиэфирную связь (Приложения, рис.5). Остановка синтеза ДНК -- это ключевой этап дидезокси-метода, но чтобы осуществить секвенирование в полном объеме, необходимо выполнить целый ряд условий.

Первый шаг стандартной процедуры дидезокси-секвенирования состоит в гибридизации синтетического олигонуклеотида длиной 17--20 звеньев со специфическим участком одной из цепей клонирующего вектора, соседствующим со вставкой. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза. Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезокси-нуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них -- изотопно меченный), и один из четырех дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP). Концентрацию каждого дидезоксинуклеотида подбирают таким образом, чтобы он оказался включенным по всем позициям в смеси растущих цепей, а не только в первой встретившейся ему позиции. (Напомним, что после присоединения дидезоксинуклеотида рост цепи сразу останавливается, поэтому каждая цепь оканчивается 3'-дидезоксинуклеотидом.)

По окончании ферментативного синтеза при участии ДНК-полимеразы в каждой пробирке оказывается уникальный набор олигонуклеотидов, каждый из которых содержит праймерную последовательность (Приложения, рис. 6).

Далее в пробирки добавляют формамид, чтобы обеспечить расхождение цепей, и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу пробирок). Это позволяет разделить одноцепочечные фрагменты ДНК, даже если они различаются по длине всего на один нуклеотид. На радиоавтографе обнаруживается набор полос, отвечающих меченым фрагментам ДНК, сопоставление которых позволяет прямо «прочитать» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК. В примере, приведенном на рис. 7(Приложения), первые шесть нуклеотидов этого сегмента, начиная с 5'-конца, -- это AGCTGC. Самая «быстрая» полоса (радиоактивно меченный фрагмент в самом низу геля) соответствует самому короткому фрагменту и находится в дорожке ddATP; следующие полосы располагаются соответственно в дорожках ddGTP, ddCTP, ddTTP и т. д. На большинстве радиоавтографов четко различаются от 250 до 350 полос. Праймерная последовательность находится на фиксированном расстоянии (10--20 нуклеотидов) от того сайта, по которому встроена клонированная ДНК, что позволяет легко распознать начало клонированного фрагмента.

2.4 Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг (Southernblot) Ї метод, применяемый в молекулярной биологии для выявления определённой последовательности ДНК в образце. Метод называется по имени изобретателя, английского биолога, Эдвина Саузерна.

Сущность метода заключается в следующем: осуществляют рестрикцию высокомолекулярной ДНК рестриктирующими эндонуклеазами и получают фрагменты ДНК разной длины. Фрагменты ДНК подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения по длине. В случае, когда используют щелочной метод переноса, агарозный гель помещают в щелочной раствор, при этом двойная спираль ДНК денатурирунт и облегчает связывание отрицательно заряженной ДНК с положительно заряженной мембраной для дальнейшей гибридизации. При этом разрушаются и остатки РНК.

Листок нитроцеллюлозной (или нейлоновой) мембраны помещают сверху или снизу от агарозного геля. Давление осуществляют на гель непосредственно или через несколько слоёв бумаги. Для успешного переноса необходим плотный контакт геля и мембраны. Буфер переносится капиллярными силами из участка с высоким содержанием воды в зону с низким содержанием воды (мембрана). При этом осуществляется перенос ДНК из геля на мембрану. Полианионная ДНК связывается с положительно заряженной мембраной силами ионообменных взаимодействий. Для окончательного закрепления ДНК на мембране, последняя нагревается в вакууме до температуры 80°С в течение двух часов или освещается ультрафиолетовым излучением (в случае нейлоновых мембран). Далее осуществляют гибридизацию радиоактивно (флюоресцентно) меченой пробы с известной последовательностью ДНК с мембраной (Приложения, Рис.8).

После гибридизации избыток пробы (ДНК-зонда) отмывают с мембраны и визуализируют продукты гибридизации путём авторадиографии (в случае радиоактивной пробы) или оценивают окраску мембраны (в случае использования хромогенного окрашивания).

Гибридизация пробы со специфическим участком ДНК, закреплённым на мембране, указывает на наличие анализируемой последовательности нуклеотидов в пробе.

Саузерн-блоттинг может быть использован для определения числа копий специфических фрагментов ДНК в геноме. Проба, которая гибридизируется только с единственным фрагментом ДНК, который не был разрезан рестриктазами, даёт одну полосу на Саузерн-блоте, в то время как множественные полосы на блоте указывают на то, что проба гибридизовалась с несколькими идентичными последовательностями.

Изменения условий гибридизации (повышение температуры, при которой проводят гибридизацию, изменение концентрации соли) приводи к повышению специфичности и снижению гибридизации с близкими, но не идентичными последовательностями.

2.5 Маркёры полиморфизма ДНК

Успехи в развитии генетических исследований обусловлены наличием информативных генетических маркёров. Первоначально в качестве генетических маркёров использовались морфологические (фенотипические) признаки, однако, количество информативных маркёров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий внешней среды. Развитие молекулярных методов исследований позволило создать новые тест-системы, позволившие анализировать генетический полиморфизм на уровне продуктов экспрессии генов (белковый, или биохимический полиморфизм) и на уровне генетического материала клетки (полиморфизм ДНК).

Впервые полиморфизм ДНК был описан в 1978 г. при исследовании участка ДНК, тесно сцепленного с в-глобулиновым геном человека, что давало возможность пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии. Позднее было показано, что несколько сотен таких полиморфизмов распределены по всему геному, что позволяет локализовать гены на хромосомах, если имеется достаточно информативный семейный материал.

В настоящее время полиморфизм найден в митохондриальной и ядерной ДНК, в кодирующей и некодирующей частях последней, в её уникальных и повторяющихся последовательностях. Кодирующая часть ДНК является более консервативной, тогда как некодирующая часть более изменчива, так как в меньшей степени подвержена селективным ограничениям.

2.5.1 Минисателлиты и микросателлиты

Значительная часть повторяющейся (сателлитной) ядерной ДНК состоит из тандемно повторенных копий так называемых коровых (от англ. сore Ї ядро) последовательностей длиной от двух до нескольких пар тысяч оснований. Мутации типа инсерций/ делеций, возникающие из-за сдвига и неточного спаривания цепей ДНК при репликации и из-за неравного кроссинговера, изменяют число повторов, т. е. общую длину такой многокопийной последовательности. Подобная изменчивость, наблюдаемая в разных частях генома (хромосомах) и у разных индивидуумов, получила рабочее название «варьирующего числа тандемных повторов» (англ. VNTR Ї variable number of tandem repeats).

В семействах таких тандемных повторов особое внимание исследователей в качестве генетических маркёров получили минисателлиты, состоящие из повторяющихся копий («мотива») длиной от 9-10 до сотни нуклеотидов каждая, и микросателлиты, повторяющиеся копии которых обычно имеют длину от 1 до 4, иногда 6 нуклеотидов. Микросателлиты обозначаются также как SSR (simple sequence repeat) или STR (short tandem repeat). Минисателлитный локус может насчитывать от двух до нескольких сотен повторов, микросателлитный локус Ї от 10 до 100 повторов. Предложена гипотеза об эволюционном происхождении минисателлитов из микросателлитов (Wright. 1994). Индивидуальные аллели этих локусов отличаются друг от друга числом тандемно повторяющихся копий.

Минисателлитные локусы анализируют, проводя гибридизацию рестрикционных фрагментов с мульти- или монолокусной пробой, представляющей собой нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности повторяющегося «мотива» (Armouretal.,1999). кумжа генофонд воспроизводство генетический

Анализ индивидуальных микросателлитных локусов осуществляют с помощью ПЦР-амплификации, используя праймеры, комплементарные к уникальным последовательностям (доменам), которыми фланкирован каждый микросателлитный локус. Далее электрофорезом в полиакриламидном геле определяют «размер» его аллелей, сравнивая с набором стандартных фрагментов ДНК известной длины.

Ряд перечисленных ниже свойств делает эти локусы весьма удобными генетическими маркёрами, обладающими большими возможностями (Wright, 1993).

1. Оба типа локусов в очень большом количестве рассеяны по геному; например, грубая оценка числа микросателлитов (GT)n и (CT)n в геноме кумжи Salmo truttaL. составляет 109000 и 33000 соответственно. 2.Эти локусы в основном локализованы в некодирующих регионах генома и, следовательно, должны быть селективно нейтральны. Это общее правило, видимо, имеет и исключения в случае тесного сцепления с адаптивно значимыми генами. Хотя точные функции мини- и микросателлитов неизвестны, ряд фактов говорит о том, что они могут служить кодирующими или регуляторными элементами.

3. Для этих локусов характерна быстрая эволюция. Скорость спонтанного мутирования мини- и микросателлитных локусов составляет около 10Ї2 Ї 10Ї4 на локус за поколение, что гораздо больше, чем у аллозимных генов Ї около 10Ї5Ї 10Ї6. Поэтому, если дивергенция по аллозимным генам обусловлена только дрейфом, то по мини- и микросателлитным локусам Ї и дрейфом и мутациями. Гетерозиготность по минисателлитам может более чем на порядок превышать аллозимную, достигая почти 100%, тогда как по микросателлитам встречается разный уровень полиморфизма, хотя, как правило также выше аллозимного.

4. Микро- и «однолокусные» минисателлиты обладают менделевским кодоминантным наследованием.

5. Микросателлиты одинаковы у близких видов, что позволяет использовать одни и те же праймеры и сходные протоколы анализа.

6. Для анализа микросателлитов требуется очень малое количество крови или какой-либо ткани организма, поэтому возможно прижизненное взятие образцов (у рыб, например, пригодны также высохшая чешуя, отолиты).

7. Возможен автоматизированный анализ микросателлитов.

Используются мини- и микросателлитные локусы в самых различных генетических исследованиях в связи с их высокой скоростью мутирования, большим аллельным разнообразием и гетерозиготностью.

Микросателлитные маркёры нередко выявляют генетическую дифференциацию в тех случаях, когда она не обнаруживается по аллозимным маркёрам, например, у организмов с низкой изменчивостью ферментных локусов, у подвижных морских рыб, на микрогеографической шкале, среди близкородственных популяций или экологических групп одного вида. Высокое аллельное разнообразие микросателлитных локусов, которое позволяет идентифицировать с их помощью потомство конкретных родителей не только в первом, но и в последующих поколениях, открывает возможность для исследования репродуктивного успеха и приспособленности среди особей, отличающихся биологическими и экологическими характеристиками.

В то же время следует указать, что микросателлитные локусы непригодны для эволюционных построений (филогении) на межвидовом и более высоких уровнях, так как наблюдаемое при этом сходство в величине аллелей может отражать не идентичность их происхождения, а так называемую гомоплазмию. Это явление возникает из-за высокой скорости мутирования, когда микросателлитные аллели одинакового размера образуются в результате конвергенции от разного числа прямых или обратных мутационных событий. Ещё одна проблема, с которой сталкиваются при анализе микросателлитов, Ї наличие нулевых аллелей, появляющихся вследствие мутаций в сайте связывания с праймером, что не позволяет точно идентифицировать генотипы.

2.5.2 Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов (AFLR) и RAPD-маркёры

В отличие от микросателлитов и однолокусных минисателлитов, с помощью которых исследуются отдельные локусы генома, маркёры, обозначаемые RAPD и AFLR, как и мультилокусные минисателлиты, позволяют исследовать геном в целом, получая соответствующие «фингерпринты».

ДляанализаRAPD (random amplified polymorphic DNA) используют обычно короткие (10-20 пар нуклеотидов) праймеры с произвольно выбранными последовательностями и с помощью ПЦР амплифицируют анонимные участки ДНК; продукты амплификации затем анализируют с помощью электрофореза. Число и размер амплифицированных фрагментов зависит от длины и последовательности произвольно выбранного праймера. Сайты связывания праймеров случайно распределены по геному, а полиморфизм в таких сайтах выражается в присутствии или отсутствии соответствующих фрагментов в геле.

Метод анализа AFLR (amplified fragment length polymorphism) основан на избирательной амплификации фрагментов, получаемых при рестрикции геномной ДНК. Он включает три этапа:

1) разрезание ДНК обычно двумя рестриктазами и связывание «липких» концов фрагментов с олигонуклеотидными адаптерами с помощью лигазы;

2) селективную ПЦР-амплификацию набора рестрикционных фрагментов;

3) электрофоретический анализ амплифицированных фрагментов.

В качестве мишени для связывания (отжига) праймера служит нуклеотидная последовательность адаптера и примыкающего к нему рестрикционного сайта, причём комплементарная к мишени последовательность праймера специально удлиняется ещё несколькими произвольными нуклеотидами с 3/- конца. Тем самым достигается избирательная амплификация только тех фрагментов, рестрикционные сайты которых фланкируются соответствующими комплементарными. Этим методом, как и методом RAPD, те или иные набора фрагментов Ї фингерпринты Ї можно получить с помощью ПЦР без предварительного знания их нуклеотидной последовательности. Полиморфизм фингерпринта определяется полиморфизмом рестрикционных сайтов и фланкирующих их нуклеотидов и проявляется в наличии или отсутствии конкретных полос в геле.

Как RAPD, так и AFLR- маркёры обладают менделевским наследованием как правило доминантного типа. Однако при наличии данных о потомстве можно выявить и некоторые кодоминантные маркёры. В новых модификациях методы RAPD и AFLRкомбинируют с ПЦР- анализом микросателлитов; соответствующие модификации названы RAMP (randomly amplified microsatellite polymorphism) и микросателлитным AFLR, или SAMPL (selective amplification of microsatellite polymorphic DNA). Такие комбинации дают возможность работать с большим количеством кодоминантных микросателлитных маркёров.

Предполагается, что RAPD и AFLR- маркёры локализованы в основном в некодирующей области ДНК, поскольку она составляет подавляющую часть генома эукариот. Скорость же мутирования в некодирующей ДНК примерно вдвое выше, чем в кодирующей.

Методы RAPDиAFLR позволяют получать большое число Ї до нескольких сотен маркёров, рассеянных по всему геному, поэтому именно такие маркёры особенно удобны для построения генетических карт или карт сцепления с локусами количественных признаков (QTL), например, с локусами хозяйственно важных свойств. AFLR- маркёры используются и в исследованиях по систематике и биоразнообразию, популяционной и природоохранной генетике, для индивидуальной идентификации и анализа родства. Эти маркёры, в частности, оказываются весьма полезными для выявления скрытой генетической изменчивости в линиях и близкородственных видах, которые не удавалось разделить ни по морфологии, ни с помощью других молекулярных методов. Считается, что для категорий более высокого таксономического ранга выявление филогенетических отношений становится проблематичным из-за очень высокой изменчивости этих маркёров.

2.5.3 Однонуклеотидный полиморфизм (SNP)

SNP (single nucleotide polymorphism) Ї полиморфизм единичного нуклеотидного сайта, или однонуклеотидный полиморфизм, чаще всего представлен двумя аллельными вариантами (заменами) однонуклеотидного сайта какой-либо ДНК- последовательности (Приложения, Рис. 9). Причина однонуклеотидного полиморфизма заключается в замене отдельных нуклеотидов в последовательности ДНК (точечные мутации, ошибки репликации и др.).

В настоящее время, с усовершенствованием и автоматизацией методов секвенирования, разработкой методов ДНК- микропанелей, или микрочипов и других аналитических методов, эти маркёры интенсивно изучаются в геноме человека для выявления их ассоциаций с различными комплексными заболеваниями, для понимания различных аспектов генетической дифференциации популяций, для изучения эволюции организмов и т. д. Для выявления SNP- маркёров используют следующие методы: секвенирование ПЦР- амплифицированных сегментов ДНК; гибридизация меченых ПЦР- продуктов с микропанелями ДНК- проб для выявления вариантов; денатурация ПЦР- продуктов при критических температурах и гетеродуплексный анализ; денатурирующая жидкостная хроматография и др.

В связи с низким уровнем мутации на поколение (? 10-8 ) SNP- маркёры широко используются для изучения крупномасштабных эволюционных событий.

Заключение

Генетические методы для изучения популяций кумжи сводятся к различным способам выявления изменчивости (полиморфизма) ДНК с помощью различных молекулярных маркёров. Развитие этих методов стало возможным благодаря разработке приёмов выделения, клонирования и рестрикции генов; ключевую роль сыграла разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего относительно легко и быстро амплифицировать нужные нуклеотидные последовательности из ничтожных количеств ДНК. Для избирательного выявления каких-то определённых фрагментов ДНК используется гибридизация со специфической пробой методом Саузерна.

Важным методом изучения изменчивости ДНК является анализ полиморфизма длин рестрикционных фпагментов (ПДРФ), который позволяет исследовать как геномную ДНК, так и мтДНК или отдельные их сегменты. Особый интерес представляют методы выявления полиморфизма сателлитной ДНК при помощи микро- и минисателлитных локусов. Такие свойства, как высокая степень рассеянности в геноме, селективая нейтральность, менделевское кодоминантное наследование, высокая скорость эволюции и др., делают эти локусы весьма удобными генетическими маркёрами.

В отличие от микросателлитов и однолокусных минисателлитов, с помощью которых исследуются отдельные локусы генома, маркёры, обозначаемые RAPD и AFLP, позволяют исследовать геном в целом, получая соответствующие ДНК-фингерпринты. Эти маркёры особенно удобны для построения генетических карт, используются в популяционной генетике, филогении и т. д.

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP), связанный с заменой отдельных нуклеотидов в последовательности ДНК, выявляют, используя метод секвенирования ДНК обычно с помощью терминирующих дидезоксинуклеотидов. Эти маркёры используются в популяционной и эволюционной генетике, генетическом картировании и т. д.

Необходимо отметить, что рассмотренные маркёры отражают основные типы полиморфизма ДНК и не исчерпывают их постоянно расширяющегося списка.

Приложение

Рис. 1. Схема ПЦР



Рис. 3. А. Дидезоксинуклеотид (отсутствуют 2'- и 3'-гидроксильные группы в кольце). Б. Дезоксинуклеотид (отсутствует только 2'-гидроксильная группа).

Рис. 4. Синтез ДНК в обычных условиях.

Очередной дезоксирибонуклеотид (дезоксирибонуклеозид-трифосфат; dNTP) спаривается с комплементарным нуклеотидом матричной цепи. Между 3'-гидроксильной группой последнего нуклеотида в растущей цепи и а-фосфатной группой присоединяемого нуклеотида образуется фосфодиэфирная связь.

Рис. 5. Остановка синтеза ДНК после присоединения дидезоксинуклеотида к концу растущей цепи. Фосфодиэфирная связь между концевым дидезоксинуклеотидом и следующим нуклеотидом не может образоваться из-за отсутствия 3'-гидроксильной группы.

Рис. 6. Удлинение праймера при синтезе цепи в присутствии дидезок-синуклеотидов.

В каждой из четырех пробирок образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. При этом образуется и какое-то число полноразмерных молекул ДНК. dNTP -- дезоксинуклеозидтрифосфат.

Рис. 7. Схематическое изображение радиоавтографа, получающегося при секвенировании ДНК с помощью дидезокси-метода

В каждую из лунок вносили содержимое одной из четырех пробирок, в которых находился один из дидезоксинуклеотидов: ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. Нуклеотидная последовательность считывается с радиоавтографа снизу вверх. На рисунке она приведена справа.



Рис. 8. Схема Саузерн-блоттинга.

Рис. 9. Однонуклеотидный полиморфизм.

Размещено на Allbest.ru