Введение в микробиологию

Вирусы и фаги

Вирусы были русским ботаником Д.И. Ивановским в 1892 г. при изучении болезни табака - табачной мозаики. Было показано, что эта болезнь передается организмами, проходящими через биологические фильтры. Эти организмы получили название «фильтрующие вирусы», а затем просто «вирусы».

Вирусы обладают следующими характерными особенностями, отличающими их от других организмов:

1. Имеют малые размеры, не задерживаются биологическими фильтрами.

2. Не имеют клеточного строения.

3. Не способны к росту и бинарному делению.

4. Не имеют собственных метаболических систем.

5. Содержат одну нуклеиновую кислоту: РНК или ДНК.

6. Репродукция (воспроизводство) вирусов осуществляется только в клетках хозяина.

Одним из основных свойств вирусов является их специфичность по отношению к клетке хозяина. Вне живой клетки вирусы ведут себя как объекты неживой природы, например, способны кристаллизоваться.

Вирусная частица (вирион) состоит из спирально закрученной нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК, покрытой снаружи белковой оболочкой (капсидом). Капсид состоит из отдельных субединиц - капсомеров, которые идентичны друг другу.

Содержание нуклеиновой кислоты и белка у разных вирусов неодинаковое. Так, у вируса гриппа на долю нуклеиновой кислоты приходится 1 % (по массе), у вируса полиомиелита -25%, у бактериофагов - 50-60%. При исследовании вирусов под электронным микроскопом обнаружены следующие формы вирусов:

* палочковидная (вид прямого цилиндра). Такую форму имеет вирус табачной мозаики;

* нитевидная (изгибающиеся эластичные нити). Эту форму имеют вирусы некоторых растений;

* сферическая. Такую форму имеет вирус гриппа, герпеса;

* октаэндрическая (форма многогранника). Это вирус полиомиелита, вирус полиомы, аденовирусы.

* булавовидная (головастикообразная, сперматозоидная). Такую форму имеют вирусы бактерий - бактериофаги (рис. 5.1).

Рис. 5.1. Строение бактериофага

Классификация вирусов

Вирусы относятся к царству Viro (ацитов).

Исходя из общепринятого представления о природе вирусов как живых существах, возникает необходимость их систематики. Однако до настоящего времени эта задача не решена, хотя предложено много различных принципов классификации вирусов: по форме; по химическому составу (РНК и ДНК вирусы); В зависимости от того, на какие клетки вирусы действуют (вирусы растений, вирусы животных, вирусы человека, вирусы микроорганизмов). Однако все эти признаки не являются стойкими и надежными критериями для разработки классификации вирусов по принципу бинарной номенклатуры.

Репродукция вирусов. Развитие вирулентного и умеренного фагов. Понятие о лизогенной культуре

Взаимодействие вируса с клеткой хозяина рассмотрим на примере взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой (рис. 5.2).

Процесс взаимодействия состоит из нескольких стадий:

1. Адсорбция. На этой стадии происходит прикрепление вируса к поверхности клетки. Каждый вирус строго специфичен в отношении хозяина. На одной клетке может адсорбироваться несколько сотен вирусов.

2. Инъекция (проникновение вируса в клетку). Внутрь клетки проникает лишь нуклеиновая кислота. Белковая оболочка остается снаружи (вирус «раздевается»). У бактерий происходит механический ввод нуклеиновой кислоты после прокалывания фагом клеточной стенки.

3. Внутриклеточное развитие вируса. Инъецированная нуклеиновая кислота фага прежде всего вызывает полную перестройку метаболизма зараженной клетки. Прекращается синтез бактериальной ДНК, а также РНК и бактериальных белков. Начинается синтез нуклеиновой кислоты фага, а в рибосомах - синтез белковых оболочек фагов.

4. Сборка вирусных частиц. Клеточная стенка при этом растворяется и из нее выходят зрелые или вирулентные фаги.

Иногда клетка инфицируется недостаточно активным фагом, который в клетке не размножается и не вызывает лизиса. Клетка способна размножаться, причем «инфекционное начало» переходит в дочерние клетки. Такие бактериофаги называются умеренными, а бактериальные клетки - передатчики этих фагов - лизогенными культурами.

Рис. 5.2 Развитие бактериофага

А- развитие вирулентного фага;

Б- лизогенный бактериальный цикл развития.

1 - бактериальная клетка; 2 - адсорбция фага;

3 - инъекция ДНК фаза в клетку;

4 - образование вегетативных фагов;

5 - сборка вирусных частиц в клетке;

6 - лизис клетки, выход бактериофага;

7- свободные фаги; 8 - превращение в профаг;

9 - одновременное деление фага и клетки;

10 - возможность образования вирулентного фага.

Цикл развития профага называется лизогенным циклом. Существенных различий в морфологии умеренных и вирулентных фагов не установлено. При определенных условиях (например, при облучении лизогенной культуры) умеренные фаги могут превратиться в вирулентные и вызвать лизис клетки.

Распространение и роль вирусов и фагов в природе, в пищевой промышленности

Вирусы и фаги широко распространены в природе. Это возбудители инфекционных заболеваний человека, животных, растений. Бактериофаги встречаются везде, где есть микроорганизмы, в которых они паразитируют: в молоке и молочных продуктах, овощах и фруктах, в почве, водоемах, сточных водах, выделениях людей и животных и т.д.

Бактериофаги нередко приносят вред: в производстве антибиотиков фаги могут вызвать лизис микроорганизмов-продуцентов; в производстве кисломолочных продуктов - лизис полезной микрофлоры (молочнокислых стрептококков).

Использование бактериофагов:

1. Применяются в медицине для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых патогенными микроорганизмами.

2. С помощью специфических фагов можно идентифицировать микроорганизмы, что используется при диагностике инфекционных заболеваний.

3. Лизогенные культуры бактерий используются в качестве детекторов радиации, под влиянием которой умеренный фаг переходит в вирулентную форму.

Питание микроорганизмов

Микроорганизмы, как и все живые существа, нуждаются в пище, которая поступает в клетки из внешней среды. Пищей обычно называют вещества, которые попав в живой организм служат либо источником энергии, необходимой для процессов жизнедеятельности, либо материалом для построения составных частей клетки.

Известны два способа питания живых существ:

* Голозойный способ - живой организм захватывает или заглатывает плотные частицы пищи, которые затем перевариваются в пищеварительном тракте. Этот способ питания характерен для животных.

* Голофитный способ - живые существа используют питательные вещества всасывая их в виде относительно небольших молекул из водного раствора. Этот способ питания характерен для микроорганизмов и растений.

Чтобы проникнуть в клетку питательные вещества должны находиться в растворенном состоянии и иметь соответствующий размер молекул. Для многих высокомолекулярных соединений цитоплазматическая мембрана непроницаема, а некоторые из них не могут проникнуть даже через клеточную оболочку. Однако это не означает, что микроорганизмы не используют высокомолекулярные соединения как питательные вещества, так как микроорганизмы могут синтезировать внеклеточные ферменты, которые выделяются в окружающую среду и гидролизуют сложные органические соединения (внеклеточное пищеварение).

Кроме того, эукариотные микроорганизмы могут захватывать высокомолекулярные соединения (явления пиноцитоза и фагоцитоза), которые в клетках расщепляются с помощью гидролитических ферментов или используются как строительные блоки в конструктивном обмене (синтез клеточных компонентов).

Химический состав микробной клетки

Основную часть микробной клетки составляет вода (80-90% общей массы клетки). Вода в клетке содержится в свободном и связанном состоянии.

Связанная вода входит в состав коллоидов клетки и с трудом высвобождается из них. С потерей связанной воды нарушаются клеточные структуры и наступает гибель клетки. Свободная вода участвует в биохимических реакциях, служит растворителем для различных соединений, образующихся в клетке в процессе обмена веществ. При удалении свободной воды гибели клетки не происходит.

Важнейшими химическими элементами, преобладающими в клетках микроорганизмов являются органогенные элементы - кислород, углерод, азот и водород. Из этих элементов состоят органические вещества (составляют до 85-95% сухих веществ клетки).

В состав клетки также входят макроэлементы: сера, фосфор, калий, магний, кальций, железо, натрий, хлор. Эти химические элементы образуют минеральные или зольные вещества, которые составляют 3-10% от массы сухих веществ клетки.

В малых количествах в клетках микроорганизмов содержатся микроэлементы, которые входят в состав активных центров некоторых ферментов (медь, цинк, марганец, молибден, никель и многие другие элементы периодической системы Менделеева).

Органические вещества клетки представлены:

* белковыми веществами. Они состоят из тех же аминокислот, что и белки животных и растений. Наибольшее значение из них имеют нуклеопротеиды - белки, связанные с нуклеиновыми кислотами, которые являются обязательными компонентами ядра и рибосом. Некоторые белки являются ферментами - катализаторами биохимических реакций.

* нуклеиновыми кислотами. ДНК содержится в ядре или нуклеоиде, РНК - в ядре, цитоплазме и рибосомах.

* углеводами. Они входят в состав различных мембран клетки. Используются для синтеза различных веществ в клетке и в качестве энергетического материала. В клетках микроорганизмов углеводы встречаются преимущественно в виде полисахаридов - гликогена, гранулезы, декстринов, клетчатки. Имеются полисахариды, связанные с белками, липидами.

* липидами. Входят в состав цитоплазматической мембраны, а также откладываются в виде запасных питательных веществ. Кроме того, в клетках микроорганизмов содержатся витамины, пигменты и другие органические вещества.

Минеральные вещества клетки представлены сульфатами, фосфатами, карбонатами, хлоридами и др.

Механизмы поступления питательных веществ в клетку

Основным препятствием для транспорта веществ в клетку является цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), которая обладает избирательной проницаемостью. ЦПМ регулирует не только поступление веществ в клетку, но и выход из нее воды, разнообразных продуктов обмена и ионов, что обеспечивает нормальную жизнедеятельность клетки.

Существует несколько механизмов транспорта питательных веществ в клетку: простая диффузия, облегченная диффузия и активный транспорт.

Простая диффузия - проникновение молекул вещества в клетку без помощи каких либо переносчиков. Движущей силой этого процесса служит градиент концентрации вещества, т. е. различия в его концентрации по обе стороны ЦПМ - во внешней среде и в клетке. Молекулы воды, некоторых газов (молекулярного кислорода, азота, водорода), некоторые ионы, концентрация которых во внешней среде выше, чем в клетке, перемещаются через ЦПМ путем пассивной диффузии. Пассивный перенос протекает до тех пор, пока концентрация веществ по обе стороны цитоплазматической мембраны не выравняется. Поступающая вода прижимает цитоплазму и ЦПМ к клеточной стенке и в клетке создается внутреннее давление на клеточную стенку, называемое тургором. Простая диффузия происходит без затраты энергии. Скорость такого процесса незначительна.

Подавляющее большинство веществ может проникнуть внутрь клетки только при участии переносчиков - специфических белков, называемых пермеазами и локализованных на цитоплазматической мембране. Пермеазы захватывают молекулы растворенных веществ и переносят их к внутренней поверхность клетки. С помощью белков-переносчиков осуществляется перенос растворенных веществ путем облегченной диффузии и активного транспорта.

Облегченная диффузия происходит по градиенту концентрации с помощью белков-переносчиков. Как и пассивная диффузия она протекает без затраты энергии. Скорость ее зависит концентрации веществ в растворе. Предполагают, что путем облегченной диффузии осуществляется также выход продуктов обмена из клетки. Путем облегченной диффузии в клетку проникают моносахара, аминокислоты.

Активный транспорт - растворенные вещества переносятся независимо от градиента концентраций. Этот вид транспорта веществ нуждается в затратах энергии (АТФ). При активном транспорте скорость поступления веществ в клетку достигает максимума даже при малой концентрации его в питательной среде. Большинство веществ проникает в клетку микроорганизмов в результате активного транспорта.

Прокариоты и эукариоты различаются по механизмам транспорта. У прокариот избирательное поступление питательных веществ осуществляется главным образом путем активного транспорта, а у эукариот - путем облегченной диффузии, а реже путем активного транспорта. Выход продуктов из клетки чаще всего осуществляется путем облегченной диффузии.

Пищевые потребности и типы питания микроорганизмов

Разнообразные вещества, в которых нуждаются микроорганизмы и которые потребляются для синтеза основных органических веществ клетки, роста, размножения и для получения энергии называются питательными веществами, а среда, содержащая питательные вещества называется питательной средой.

Потребности микроорганизмов в питательных веществах разнообразны, но независимо от потребностей в питательной среде должны содержаться все необходимые элементы, которые имеются в клетках микроорганизмов, причем соотношение органогенных элементов должно примерно соответствовать этому соотношению в клетке.

Источниками водорода и кислорода является вода, молекулярный водород и кислород, а также химические вещества, содержащие эти элементы. Источниками макроэлементов являются минеральные соли (калий фосфорнокислый, магний сернокислый, железо хлорное и др.).

Источниками углерода и азота могут быть как органические, так и неорганические соединения.

В соответствии с принятой классификацией микроорганизмов по типу питания их разделяют на группы в зависимости источника углерода, источника энергии и источника электронов (природы окисляемого субстрата).

В зависимости от источника углерода микроорганизмы делятся на:

* автотрофы (сами себя питающие), которые используют углерод из неорганических соединений (углекислого газа и карбонатов);

* гетеротрофы (питаются за счет других) - используют углерод из органических соединений.

В зависимости от источника энергии различают:

* фототрофы - микроорганизмы, которые в качестве источника энергии используют энергию солнечного света;

* хемотрофы - энергетическим материалом для этих микроорганизмов являются разнообразные органические и неорганические вещества.

В зависимости от источника электронов (природы окисляемого субстрата микроорганизмы делятся на:

* литотрофы - окисляют неорганические вещества и за счет этого получают энергию;

* ораганотрофы - получают энергию путем окисления органических веществ.

Среди микроорганизмов чаще всего встречаются микроорганизмы, имеющие следующие типы питания:

Фотолитоавтротрофия - тип питания, характерный для микробов, использующих энергию света и энергию окисления неорганических соединений для синтеза веществ клетки из диоксида углерода.

Фотоорганогетеротрофия - такой тип питания микроорганизмов, когда для получения энергии, необходимой для синтеза веществ клетки из диоксида углерода, помимо световой энергии используется энергия окисления органических соединений.

Хемолитоавтотрофия - тип питания, при котором микроорганизмы получают энергию за счет окисления неорганических соединений, а источником углерода являются неорганические соединения.

Хемоорганогетеротрофия - тип питания микроорганизмов, получающих энергию и углерод из органических соединений. Микроорганизмы, встречающиеся в пищевых продуктах, имеют именно такой тип питания.

Среди хемоорганогетеротрофов различают сапрофиты - такие микроорганизмы, которые питаются за счет органических веществ из различных субстратов растительного и животного происхождения (из отмерших клеток и тканей) и паразиты - используют органические вещества из живых клеток.

Кроме углерода важнейшим элементом питательной среды является азот. Автотрофы обычно используют азот из минеральных соединений, а гетеротрофы кроме неорганических соединений азота используют аммонийные соли органических кислот, аминокислоты, пептоны и другие соединения. Некоторые гетеротрофы усваивают атмосферный азот (азотфиксаторы).

Существуют микроорганизмы, которые сами не способны синтезировать то или иное органическое вещество (например, аминокислоты, витамины). Такие микроорганизмы называют ауксотрофными по данному веществу. Вещества, которые добавляют для ускорения роста и обменных процессов называют ростовыми веществами.

Конструктивный и энергетический обмен

Метаболизмом или обменом веществ называется сумма целенаправленных реакций, протекающих под действием ферментных систем клетки, которые регулируются различными внешними и внутренними факторами и обеспечивающих обмен веществами и энергией между средой обитания и клеткой.

Несмотря на физиологические и морфологические различия между микроорганизмами, обмен веществ в клетке идет тремя основными метаболическими путями:

1. Из внешней среды в клетку поступает энергия либо в виде химической энергии органических веществ, либо энергии солнечного света.

2. Из веществ среды, перенесенных в клетку, собираются «строительные блоки», из которых формируются биополимеры клетки и синтезируются белки, жиры, углеводы, нуклеиновые кислоты и другие клеточные компоненты.

3. В клетке постоянно происходят синтез и разрушение биомолекул, выполняющих различные специфические функции. Обмен веществ можно рассматривать как сумму двух явлений:

* катаболизма (энергетического обмена), представляющего собой ферментативное расщепление крупных органических молекул с выделением свободной энергии, которая запасается в виде макроэргических связей в молекулах АТФ;

* анаболизма (конструктивного обмена), представляющего собой синтез биополимеров клетки, которая запасается в виде макроэргических связей АТФ.

Катаболизм и анаболизм - два самостоятельных пути в обмене веществ, хотя отдельные участки их могут быть общими. Такие общие участки, свойственные катаболизму и анаболизму называются амфиболитическими.

Катаболитические и анаболитические превращения осуществляются последовательно, так как продукт реакции предыдущей стадии является субстратом для последующей.

Энергетический обмен тесно связан с конструктивным (рис. 7.1). В ходе биологического окисления образуются разнообразные промежуточные продукты (фосфорные эфиры сахаров, пировиноградная, уксусная, щавелевоуксусная, янтарная, -кетоглутаровая кислоты), из которых вначале синтезируются монополимеры (аминокислоты, азотистые основания, моносахариды), а затем основные макромолекулы клетки. Синтез компонентов клетки идет с затратой энергии, которая образуется при энергетическом обмене. Эта энергия затрачивается также на осуществление активного транспорта веществ, необходимых для анаболизма.

Взаимосвязь конструктивного и энергетического обмена заключается и в том, что процессы биосинтеза кроме энергии требуют поступления извне восстановителя в виде водорода, источником которого также служат реакции энергетического обмена.

Энергетический метаболизм, его сущность. Макроэргические соединения. Типы фосфорилирования

Способы получения энергии у микроорганизмов различны. Некоторые микроорганизмы (фототрофы) способны перерабатывать химическую энергию солнечного света, другие (хемотрофы) получают энергию путем окисления химических веществ.

Окислением принято считать процесс отнятия двух атомов водорода. Этот процесс носит название дегидрирование. Восстановление того или иного соединения представляет собой присоединение двух атомов водорода (гидрирование).

Окисление может быть представлено следующим образом:

АН₂ А + 2Н⁺

В + 2Н⁺ ВН₂ + А

Суммарное уравнение: АН₂ + В BH₂ + А

В этой реакции АН₂ - восстановитель или донор ионов водорода, а В - окислитель (акцептор), так как присоединяет ионы водорода.

Водород и электроны, отнятые от окисляемого субстрата (донора) переносятся к конечному акцептору не непосредственно, а ступенчато, поэтапно с помощью окислительно-восстановительных ферментов. К таким ферментам относятся дегидрогеназы, которые переносят водород и ферменты цитохромной системы - цитохромы и цитохромоксидаза - переносят электроны. Дегидрогеназы и цитохромная система образуют дыхательную цепь.

Набором окислительно-восстановительных ферментов объясняется отношение микроорганизмов к молекулярному кислороду. В зависимости от способа получения энергии и от конечного акцептора водорода микроорганизмы можно разделить на три физиологические группы:

* облигатные аэробы - микроорганизмы, которые не могут существовать без кислорода. Энергию эти микроорганизмы получают в результате окисления веществ в присутствии кислорода воздуха (дыхания);

* облигатные анаэробы - микроорганизмы, для которых кислород является клеточным ядом. Такие микроорганизмы получают энергию в процессе брожения

* факультативные анаэробы - микроорганизмы, способные жить как в присутствии кислорода, так и без него (осуществляют как дыхание, так и брожение).

Начало окислительного процесса независимо от того, участвует ли в нем молекулярный кислород или нет, связано с воздействием дегидрогеназ. Поэтому дегидрогеназы имеются у всех микроорганизмов, в то время как цитохромы и цитохромоксидаза присутствует только у аэробов и факультативных анаэробов.

Энергия, образуемая при энергетическом обмене, трансформируется в энергию макроэргических связей молекул АТФ. Процесс образования АТФ называется фосфорилированием.

Механизм образования АТФ у разных групп микроорганизмов неодинаков. Поэтому различают субстратное, окислительное и фотофосфорилирование.

Фотофосфорилирование - образование АТФ при поглощении квантов света молекулами хлорофилла. В результате от молекулы хлорофилла отрываются электроны, которые проходя по цепи переноса электронов, отдают свою энергию системе АДФ-АТФ, в результате чего энергия света трансформируется в энергию макроэргических связей АТФ.

Субстратное фосфорилирование - образование АТФ непосредственно на молекуле субстрата. Протекает в анаэробных условиях на стадиях превращения 1,3 дифосфоглицериновой кислоты в 3 фосфоглицериновую кислоту и фосфоэнолпировиноградной кислоты в пировиноградную кислоту (в процессе гликолиза). Окислительное фосфорилирование - образование АТФ одновременно с процессом переноса протонов и электронов по дыхательной цепи ферментов. На каждые 2 атома водорода, поступившие в дыхательную цепь, синтезируется 3 молекулы АТФ. Окислительное фосфорилирование осуществляется аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами.

Энергетический метаболизм хемоорганогетеротрофов, использующих процессы брожения

Брожение - окислительно-восстановительный процесс, проходящий в анаэробных условиях и приводящий к образованию АТФ, в котором роль донора и акцептора атомов водорода (или соответствующих электронов) играют органические соединения. Образование молекул АТФ при брожении происходит путем субстратного фосфорилирования.

Чаще всего в процессах брожения микроорганизмы используют углеводы.

Существует несколько типов брожения, названия которых даются по конечному продукту: спиртовое, пропионовокислое, молочнокислое, ацетонобутиловое, маслянокислое и т.д. Первый этап окисления углеводов в процессе брожения включает гидролиз углеводов до простых сахаров и изомеризацию их до глюкозы. На втором этапе глюкоза через ряд последовательных реакций окисляется в пировиноградную кислоту. Этот процесс называется гликолизом. Основными стадиями гликолиза является присоединение фосфатных групп от молекулы АТФ и превращение во фруктозо-1,6-дифосфат. Далее фруктозо-1,6-дифосфат превращается в фосфоглицериновый альдегид, который через ряд последовательных реакций превращается в пировиноградную кислоту. При этом образуется свободная энергия, достаточная для образования 4 молекул АТФ. Но так как 2 АТФ затрачиваются на активацию глюкозы, то энергетическая ценность любого брожения - образование из одной молекулы глюкозы двух молекул АТФ (энергетическая ценность брожения). Следует отметить также, что при гликолизе восстанавливается дегидрогеназа (2 НАДН₂).

Третий этап. Пировиноградная кислота при серии последовательных реакций претерпевает превращения, характер которых зависит от ферментативных особенностей того или иного возбудителя.

Энергетический метаболизм хемоорганогетеротрофов, использующих процесс дыхания

Аэробное дыхание - окислительно-восстановительный процесс, идущий с образованием АТФ, при котором роль доноров водорода (электронов) играют органические соединения, а роль акцептора выполняет молекулярный кислород. Процесс протекает в аэробных условиях, а конечными продуктами дыхания являются СО₂ и Н₂О.

Суммарно процесс дыхания при окислении углеводов выражается уравнением:

С₆Н₁₂О₆ + 6 О₂ 6 СО₂ + 6 Н₂О + 2820 кДж

Начальная стадия превращения углеводов вплоть до образования пировиноградной кислоты полностью идентична ферментативным реакциям окисления в процессе брожения.

В клетках аэробов ПВК может быть окислена полностью в цикле Кребса через промежуточное соединение - ацетил КоА (рис. 7.3). При

этом водород, отнятый дегидрогеназами в цикле передается в дыхательную цепь ферментов, которая у аэробов кроме НАД включает ФАД, систему цитохромов и конечный акцептор водорода - кислород. При этом на каждые 2 атома водорода, поступающих в дыхательную цепь, синтезируется 3 молекулы АТФ.

Таким образом, суммарный энергетический эффект процесса окисления одной молекулы глюкозы составляет 38 молекулы АТФ, причем 2 молекулы АТФ образуются в результате субстратного фосфорилирования, а 36 АТФ - при окислительном фосфорилировании.

Окисление питательных веществ не всегда идет до конца. Некоторые аэробы окисляют органические соединения частично, при этом в среде накапливаются промежуточные продукты окисления. Такие окислительно-восстановительные процессы, протекающие в аэробных условиях, называются неполным окислением или окислительным брожением.

Энергетический метаболизм хемолитоавтотрофов. Понятие об анаэробном дыхании

Небольшое число бактерий (денитрифицирующие, дисульфатирующие бактерии) в анаэробных условиях окисляют органические вещества не с помощью молекулярного кислорода, а с использованием связанного кислорода, находящегося в молекуле нитратов, сульфатов. Эти неорганические вещества богаты кислородом и являются акцепторами водорода.

Анаэробное дыхание - окислительно-восстановительный процесс, идущий с образованием АТФ, в котором донором ионов водорода являются органические вещества, а акцептором - неорганические соединения.

Анаэробное дыхание бывает двух типов:

* нитратное. Это окисление органических соединений кислородом нитратов. Нитратное дыхание осуществляют денитрифицирующие бактерии:

5С₆Н₁₂ 0₆ + 24 КNОз 24 КНСОз + 18Н₂О + 12 N₂ +6 СО₂ + Энергия;

* сульфатное. Это окисление органических веществ кислородом сульфатов. Такой тип анаэробного дыхания осуществляют дисульфатирующие бактерии.

С₆Н₁₂О₆ + 3 K₂ SО₄ 3 К₂СОз + 3 CO₂ + 3 H₂S + Энергия

Процессы анаэробного дыхания сопровождаются значительным выделением энергии.

Культивирование и рост микроорганизмов

Выращивание микроорганизмов на питательных средах называется культивированием, а развившиеся в таких средах микроорганизмы - культурой. При культивировании происходит рост культуры - физиологический процесс, в результате которого увеличивается биомасса - масса клеточного вещества данного микроорганизма.

Чистой культурой микроорганизма называют культуру, которая представлена потомством одной клетки. Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее получают искусственно. Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии - популяции микроорганизмов одного вида.

Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или природного субстрата (например: почвы, воды), в котором данный микроорганизм находится в небольших количествах, вначале получают накопительные культуры, проводя культивирование в элективных условиях.

Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов одного вида. Элективные (накопительные) условия - условия, способствующие развитию одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов. Создать накопительные условия можно путем использования накопительных сред. Примером элективных условий может быть повышенная температура (для выделения термоустойчивых форм бактерий), повышенная кислотность, повышенная концентрация соли и т.д.

Инкубация - культивирование микроорганизмов при определенной температуре.

Хранят чистые культуры обычно на плотных питательных средах в пробирках. При этом постоянно необходимо делать пересевы на свежую питательную среду.

К другим способам хранения чистых культур относятся сохранение их на накопительной среде под слоем вазелинового масла и хранение в лиофилизованном состоянии (сушка под вакуумом замороженных клеток микроорганизмов).

В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей, молочнокислых, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий, обладающих ценными свойствами для производства. В последнее время находят успешное применение многокомпонентные чистые культуры, состоящие из двух и более видов микроорганизмов.

Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они выделяются из различных субстратов, изучаются и наиболее продуктивные, пригодные для производства, хранятся в коллекции музея чистых культур, откуда рассылаются отраслевыми научно-исследовательскими институтами на предприятия. В заводской лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла, проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Способы культивирования микроорганизмов

Способ культивирования зависит от конечной цели культивирования (целью является либо накопление биомассы, либо получения определенного продукта жизнедеятельности - метаболита).

Поверхностное культивирование заключается в выращивании аэробных микроорганизмов на поверхности жидких и сыпучих питательных сред. При этом микроорганизмы получают кислород непосредственно из воздуха. При поверхностном культивировании на жидких средах микроорганизмы растут в виде пленок. Осуществляется поверхностное культивирование в специальных ваннах - кюветах.

Глубинное культивирование проводится на жидких питательных средах, в которых микроорганизмы развиваются во всем объеме питательной среды. Сочетание питательной среды и растущих в ней микроорганизмов называют культуральной жидкостью. Осуществляется глубинное культивирование в специальных аппаратах - ферментаторах, снабженных мешалками и системой подвода стерильного воздуха для обеспечения роста аэробных микроорганизмов. Аэрирование - продувание стерильного воздуха через культуральную жидкость.

При периодическом культивировании весь объем питательной среды засевают чистой культурой, которую выращивают в оптимальных условиях определенный период времени до накопления нужного количества целевого продукта. Следует отметить, что так как культивирование ведется на не возобновляемой питательной среде (в стационарных условиях), то клетки все время находятся в меняющихся условиях. Таким образом, периодическую систему можно рассматривать как замкнутую систему.

При непрерывном культивировании культура находится в специальном аппарате, куда постоянно притекает питательная среда и с такой же скоростью отводится культуральная жидкость. Для микроорганизма создаются неизменные условия среды, поэтому непрерывную систему можно рассматривать как открытую систему.

Поверхностное культивирование может быть только периодическим, в то время как глубинное культивирование может осуществляться и периодическим, и непрерывным способом.

Закономерности роста статической и непрерывной культуры

При периодическом способе культивирования популяция микроорганизмов проходит 7 стадий (фаз) роста (рис. 8.1).



V

Рис. 8.1 Кривая роста статической культуры

N - концентрация жизнеспособных клеток; ф - продолжительность культивирования

1. Лагфаза. В этот период культура адаптируется к новой среде обитания. Активизируются ферментные системы, возрастает количество нуклеиновых кислот, клетка готовится к интенсивному синтезу белков и других соединений. Клетки не размножаются (скорость размножения равна нулю). Концентрация живых клеток постоянна и равна количеству внесенных клеток. Продолжительность этой фазы зависит от физиологических особенностей микроорганизма и от состава питательной среды.

2. Фаза ускорения роста. Эта фаза характеризуется началом деления клеток, увеличением общей массы и постоянным увеличением скорости роста культуры. Эта фаза обычно непродолжительна.

3. Экспоненциальная (логарифмическая) фаза роста. В этот период микроорганизмы размножаются с постоянной максимальной скоростью. При этом логарифм числа клеток линейно зависит от времени. К концу этой фазы среда истощается вследствие катаболических и анаболических процессов, в среде накапливаются продукты жизнедеятельности микроорганизмов. Возникает и пространственная ограниченность, так как клетки мешают друг другу.

4. Фаза замедления роста. В этот период снижается скорость роста, небольшая часть клеток гибнет. Скорость роста выше скорости отмирания.

5. Стационарная фаза. Количество живых клеток достигает максимума. Скорость роста равна скорости отмирания клеток, поэтому концентрация жизнеспособных клеток остается постоянной.

6. Фаза ускорения отмирания. Количество отмерших клеток (скорость отмирания) становится больше количества образовавшихся клеток.

7. Фаза отмирания. Масса живых клеток значительно уменьшается, так как в среде нет питательных веществ, а запасные вещества клетки исчерпываются.

В основу способа непрерывного культивирования положено культивирование микробной популяции в условиях хемостата и турбидостата.

Рост в хемостате. Хемостат состоит из сосуда, в который вводят с постоянной скоростью питательный раствор. По мере поступления питательного раствора из него вытекает суспензия микроорганизмов с той же скоростью. При культивировании в условиях хемостата поддерживается постоянная концентрация одного из компонентов среды (например: углерода). Благодаря этому в условиях хемостата поддерживается постоянная скорость роста культуры. Культура микроорганизма находится в условиях динамического равновесия.

Рост в турбидостате. Работа турбидостата основана на поддержании постоянной концентрации живых клеток. В сосуде для культивирования все питательные вещества содержатся в избытке, а скорость роста бактерий приближается к максимальной.

Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы

Жизнедеятельность микроорганизмов тесно связана с окружающей средой.

С одной стороны, деятельность микроорганизмов значительно изменяет окружающую среду в результате удаления из нее питательных веществ и выделения продуктов обмена. С другой стороны, интенсивность обменных процессов зависит от условий окружающей среды.

Наука о взаимоотношениях живых организмов с окружающей средой называется экологией, а отдельные свойства среды обитания, воздействующие на организмы, называют экологическими факторами. Некоторые из этих факторов необходимы клетке, а некоторые, наоборот, вредны, так как могут вызывать приостановление роста и развития микроорганизмов, а при интенсивном воздействии неблагоприятных факторов может наступить гибель микроорганизмов.

Гибель микроорганизмов - необратимая утрата способности к росту и размножению. Воздействие фактора внешней среды, вызывающее гибель микроорганизма называют бактерицидным действием. Восстановление способности к росту и размножению после воздействия неблагоприятного фактора носит название реактивация. Действие неблагоприятного фактора в этом случае называется бактериостатическим.

Под действием экологических факторов возможен также мутагенез - изменение наследственных свойств клетки.

Воздействие каждого фактора внешней среды определяется степенью воздействия или его интенсивностью.

Кроме того, при оценке воздействия некоторых внешних факторов различают три кардинальные точки: минимум, оптимум и максимум. Развитие микроорганизмов возможно между минимальной и максимальной границами. При оптимальных условиях жизнедеятельность микроорганизма проявляется наиболее интенсивно.

Закон минимума: Если хотя бы один фактор воздействия будет находиться ниже минимума или выше максимума, микроорганизм не сможет развиваться даже при оптимальных значениях всех остальных факторов.

В технической микробиологии закон минимума применим в двух случаях: когда нужно создать наилучшие условия для развития микроорганизмов и тем самым интенсифицировать технологический процесс и когда необходимо подавить развитие посторонней микрофлоры или полностью уничтожить микроорганизмы.

Экологические факторы весьма многообразны и изменчивы, поэтому микроорганизмы постоянно приспосабливаются к ним и регулируют свою жизнедеятельность в соответствии с их изменениями.

Экологические факторы имеют разную специфику действия. В зависимости от этого их можно разделить на: абиотические - факторы неживой природы; биотические - факторы живой природы; антропогенные - все формы деятельности человеческого общества, которые приводят к изменению природы как среды обитания.

Внешние факторы можно также разделить на: физические - воздействие температуры, лучистой энергии, электромагнитных колебаний; физико-химические - влияние влажности, осмотического давления; химические - влияние рН, окислительно-восстановительных условий среды, химических факторов; биологические - взаимоотношения между микроорганизмами, влияние антибиотиков и фитонцидов.

Влияние физических факторов на микроорганизмы

Температура - один из основных факторов, определяющих возможность и интенсивность размножения микроорганизмов.

Микроорганизмы могут расти и проявлять свою жизнедеятельность в определенном температурном диапазоне, и в зависимости от отношения к температуре делятся на психрофилы, мезофилы и термофилы. Температурные диапазоны роста и развития микроорганизмов этих групп приведены в таблице 9.1.

Разделение микроорганизмов на 3 группы весьма условно, так как микроорганизмы могут приспосабливаться к несвойственной им температуре.

Таблица 9.1

Группа микроорганизмов	T (°С) миним.	Т (°С) максим.	Т (°С) оптим.	Отдельные представители
1. Психрофилы (холодолюбивые)	(+5)-(-2)	около +30	+10-15	Бактерии, обитающие в холодильниках, морские бактерии
2. Мезофилы	+5-10	+45-50	+25-40	Большинство грибов, дрожжей, бактерий
3. Термофилы (теплолюбвые)	около +30	+70-80	+50-60	Бактерии, обитающие в горячих источниках. Большинство образуют устойчивые споры

Температурные пределы роста определяются терморезистентностью ферментов и клеточных структур, содержащих белки.

Среди мезофилов встречаются формы с высоким температурным максимумом и низким минимумом. Такие микроорганизмы называют термотолерантными.

Действие высоких температур на микроорганизмы. Повышение температуры выше максимальной может привести к гибели клеток. Гибель микроорганизмов наступает не мгновенно, а во времени. При незначительном повышении температуры выше максимальной микроорганизмы могут испытывать «тепловой шок» и после недлительного пребывания в таком состоянии они могут реактивироваться.

Механизм губительного действия высоких температур связан с денатурацией клеточных белков. На температуру денатурации белков влияет содержание в них воды (чем меньше воды в белке, тем выше температура денатурации). Молодые вегетативные клетки, богатые свободной водой погибают при нагревании быстрее, чем старые, обезвоженные.

Термоустойчивость - способность микроорганизмов выдерживать длительное нагревание при температурах, превышающих температурный максимум их развития.

Гибель микроорганизмов наступает при разных значениях температур и зависит от вида микроорганизма. Так, при нагревании во влажной среде в течение 15 мин при температуре 50-60 °С погибает большинство грибов и дрожжей; при 60-70 °С - вегетативные клетки большинства бактерий, споры грибов и дрожжей уничтожаются при 65-80° С. Наибольшей термоустойчивостью обладают вегетативные клетки термофилов (90-100 °С) и споры бактерий (120 °С).

Высокая термоустойчивость термофилов связана с тем, что, во первых, белки и ферменты их клеток более устойчивы к температуре, во вторых, в них содержится меньше влаги. Кроме того, скорость синтеза различных клеточных структур у термофилов выше скорости их разрушения.

Термоустойчивость спор бактерий связана с малым содержанием в них свободной влаги, многослойной оболочкой, в состав которой входит кальциевая соль дипиколиновой кислоты.

На губительном действии высоких температур основаны различные методы уничтожения микроорганизмов в пищевых продуктах. Это кипячение, варка, бланширование, обжарка, а также стерилизация и пастеризация. Пастеризация - процесс нагревания до 100?С при котором происходит уничтожение вегетативных клеток микроорганизмов. Стерилизация - полное уничтожение вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Процесс стерилизации ведут при температуре выше 100 °С.

Влияние низких температур на микроорганизмы. К низким температурам микроорганизмы более устойчивы, чем к высоким. Несмотря на то, что размножение и биохимическая активность микроорганизмов при температуре ниже минимальной прекращается, гибели клеток не происходит, т. к. микроорганизмы переходят в состояние анабиоза (скрытой жизни) и остаются жизнеспособными длительное время. При повышении температуры клетки начинают интенсивно размножаться.

Причинами гибели микроорганизмов при действии низких температур являются:

* нарушение обмена веществ;

* повышение осмотического давления среды вследствие вымораживания воды;

* в клетках могут образоваться кристаллики льда, разрушающие клеточную стенку.

Низкая температура используется при хранении продуктов в охлажденном состоянии (при температуре от 10 до -2 °С) или в замороженном виде (от -12 до -30 °С).

Лучистая энергия. В природе микроорганизмы постоянно подвергаются воздействию солнечной радиации. Свет необходим для жизнедеятельности фототрофов. Хемотрофы могут расти и в темноте, а при длительном воздействии солнечной радиации эти микроорганизмы могут погибнуть.

Воздействие лучистой энергии подчиняется законам фотохимии: изменения в клетках могут быть вызваны только поглощенными лучами. Следовательно, для эффективности облучения имеет значение проникающая способность лучей, которая зависит от длины волны и дозы.

Доза облучения свою очередь определяется интенсивностью и временем воздействия. Кроме того, эффект воздействия лучистой энергии зависит от вида микроорганизма, характера облучаемого субстрата, степени обсемененности его микроорганизмами, а также от температуры.

Низкие интенсивности видимого света (350-750 нм) и ультрафиолетовых лучей (150-300 нм), а также низкие дозы ионизирующих излучений либо не влияют на жизнедеятельность микроорганизмов, либо приводят к ускорению их роста и стимуляции метаболических процессов, что связано с поглощением квантов света определенными компонентами или веществами клеток и переходом их в электронно-возбужденное состояние.

Более высокие дозы излучений вызывают торможение отдельных процессов обмена, а действие ультрафиолетовых и рентгеновских лучей может привести к изменению наследственных свойств микроорганизмов мутациям, что широко используется для получения высокопродуктивных штаммов.

Гибель микроорганизмов под действием ультрафиолетовых лучей связана:

* с инактивацией клеточных ферментов;

* с разрушением нуклеиновых кислот;

* с образованием в облучаемой среде перекиси водорода, озона и т.д.

Следует отметить, что наиболее устойчивыми к действию ультрафиолетовых лучей являются споры бактерий, затем споры грибов и дрожжей, далее окрашенные (пигментированные) клетки бактерий. Наименее устойчивы вегетативные клетки бактерий.

Гибель микроорганизмов под действием ионизирующих излучений вызвана:

* радиолизом воды в клетках и субстрате. При этом образуются свободные радикалы, атомарный водород, перекиси, которые, вступая во взаимодействие с другими веществами клетки, вызывают большое количество реакций, не свойственных нормально живущей клетке;

* инактивацией ферментов, разрушением мембранных структур, ядерного аппарата.

Радиоустойчивость различных микроорганизмов колеблется в широких пределах, причем микроорганизмы значительно радиоустойчивей высших организмов (в сотни и тысячи раз). Наиболее устойчивы к действию ионизирующих излучений споры бактерий, затем грибы и дрожжи и далее бактерии.

Губительное действие ультрафиолетовых и рентгеновских г-лучей используется на практике.

Ультрафиолетовыми лучами дезинфицируют воздух холодильных камер, лечебных и производственных помещений, используют бактерицидные свойства ультрафиолетовых лучей для дезинфекции воды.

Обработка пищевых продуктов низкими дозами гамма-излучений называется радуризацией.

Электромагнитные колебания и ультразвук. Радиоволны. Это электромагнитные волны, характеризующиеся относительно большой длиной - от миллиметров до километров и частотами от 3·10⁴ до 3·10¹¹ герц.

Прохождение коротких и ультрарадиоволн через среду вызывает возникновение в ней переменных токов высокой (ВЧ) и сверхвысокой частоты (СВЧ). В электромагнитном поле электрическая энергия преобразуется в тепловую.

Гибель микроорганизмов в электромагнитном поле высокой интенсивности наступает в результате теплового эффекта, но полностью механизм действия СВЧ-энергии на микроорганизмы не раскрыт.

В последние годы сверхвысокочастотная электромагнитная обработка пищевых продуктов все более широко применяется в пищевой промышленности (для варки, сушки, выпечки, разогревания, размораживания, пастеризации и стерилизации пищевых продуктов). По сравнению с традиционным способом тепловой обработки время нагревания СВЧ-энергией до одной и той же температуры сокращается во много раз, в связи с чем полнее сохраняются вкусовые и питательные свойства продукта.

Ультразвук. Ультразвуком называют механические колебания с частотами более 20000 колебаний в секунду (20 кГц).

Природа губительного действия ультразвука на микроорганизмы связана:

* с кавитационным эффектом. При распространении в жидкости УЗ-волн происходит быстро чередующееся разряжение и сжатие частиц жидкости. При разряжении в среде образуются мельчайшие полые пространства - «пузырьки», заполняющиеся парами окружающей среды и газами. При сжатии, в момент захлопывания кавитационных «пузырьков», возникает мощная гидравлическая ударная волна, вызывающая разрушительное действие;

* с электрохимическим действием УЗ-энергии. В водной среде происходит ионизация молекул воды и активация растворенного в ней кислорода. При этом образуются вещества, обладающие большой реакционной способностью, которые обуславливают ряд химических процессов, неблагоприятно действующих на живые организмы.

Благодаря специфическим свойствам ультразвук все более широко применяют в различных областях техники и технологии многих отраслей народного хозяйства. Ведутся исследования по применению УЗ-энергии для стерилизации питьевой воды, пищевых продуктов (молока, фруктовых соков, вин), мойки и стерилизации стеклянной тары.

Влияние физико-химических факторов на микроорганизмы

Влажность. Влажность среды оказывает большое воздействие на жизнедеятельность микроорганизмов. Вода входит в состав клеток и поддерживает тургорное давление в них. Кроме того, питательные вещества проникают внутрь клетки лишь в растворенном состоянии. Обезвоживание субстрата приводит к задержке развития микроорганизмов (состояние анабиоза). При повышении влажности жизнедеятельность микроорганизмов восстанавливается.

Микроорганизмы в зависимости от отношения к влажности делятся на гидрофиты (влаголюбивые), ксерофиты (сухолюбивые) и мезофиты (средневлаголюбивые). Для большинства бактерий минимальная влажность субстрата 20-30%, а для грибов - 11-13%.

Для развития микроорганизмов важна не абсолютная величина влажности, а ее доступность. Доступность содержащейся в субстрате влаги носит название активность воды (а_w). Этот показатель выражает отношение давления паров над субстратом (Рс) к давлению паров над чистой водой (Р) при одной и той же температуре:

аw =Рс/Р

Активность воды лежит в интервале от 0 до 1 и характеризует относительную влажность.