Изменения морфо-функциональных характеристик эритроцитов при повторявшемся стрессе

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изменения морфо-функциональных характеристик эритроцитов при повторявшемся стрессе

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Стресс - реакции организма

1.2 Характеристика различных видов стресс-факторов

1.3 Эритроциты

1.4 Пчелиный яд

2. Материалы и методы

3. Результаты исследования и их обсуждение

Выводы

Цитированная литература

Введение

стресс организм эксперимент пчелиный яд

Изучение адаптационных возможностей организма является актуальной задачей, как с точки зрения раскрытия общебиологических закономерностей развития стресс - реакции в организме, так и с практических позиций клинической медицины для раскрытия механизмов коррекции патогенных состояний.

По определению Г. Селье (1972), стресс представляет собой совокупность всех неспецифических изменений, возникающих под влиянием любых сильных воздействий и сопровождающихся перестройкой защитных систем организма. При стрессе на ряду с элементами защиты имеются и элементы повреждения. Ключевая роль в их энергетическом и метаболическом обеспечении принадлежит крови и, прежде всего, эритроцитам.

Клетки крови являются удобным объектом для изучения биологических эффектов различных воздействий, поскольку в большей степени сохраняют физиологические функции легко доступные для анализа. Мембране эритроцита присущи общие принципы организации плазматических мембран. Поэтому закономерности изменения структуры и функций мембраны эритроцитов при патологиях разного генеза могут быть экстраполированы на другие мембранные структуры (Новицкий и др., 2004).

Стресс - не только патологический фактор, но также и фактор способный вызывать адаптационные реакции в организме.

Цель работы: исследование влияния многократно повторяющегося стресса различной природы на морфо-функциональные характеристики эритроцитов.

Задачи:

1. Изучить влияние многократно повторяющегося физического стресса на морфо-функциональные характеристики эритроцитов;

2. Изучить влияние многократно повторяющегося токсического стресса на морфо-функциональные характеристики эритроцитов.

1. Обзор литературы

1.1 Стресс - реакции организма

Стресс (в описании Г. Селье) - всего лишь одна из реакций, составляющих общую периодическую систему неспецифических адаптационных реакций организма, возникающая в ответ на сильное воздействие.

На уровне организма выделяют три типа неспецифических реакций (Гаркави, Квакина, 1990):

1. реакция тренировки в ответ на пороговую, относительно малую величину действующего фактора;

2. реакция активации в ответ на разные по качеству факторы средней величины;

3. реакция переактивации, являющаяся, как и стресс, неспецифической основой многих патологических процессов.

Реакция тренировки - возникает в ответ на действие факторов «пороговой» величины, характеризуется сигнальным показателем -- содержанием в крови лимфоцитов в пределах нижней половины зоны нормы, сегментоядерных нейтрофилов - в пределах верхней половины зоны нормы, остальных форменных элементов - в пределах нормы.

Продукция гормонов железами: щитовидной, гипофизом, половыми - находится в пределах нижней половины зоны нормы. Секреция адренокортикотропного гормона и глюкокортикоидов - в пределах верхней половины зоны нормы. С последним обстоятельством связано мягкое (в отличие от стресса - без признаков иммунодепрессии) противовоспалительное действие реакции тренировки.

Биологический смысл реакции тренировки - сохранение гомеостаза в пределах нижней половины зоны нормы в условиях действия слабых, незначительных раздражителей. Реакция формируется через 6 часов после воздействия и длится 24-48 часов (Гаркави, 2006).

Реакция активации возникает в ответ на действие факторов «средней» интенсивности. Развивается через 6 часов и держится 24 - 48 часов. Бывает двух видов:

а) спокойной активации - содержание лимфоцитов в пределах верхней половины зоны нормы, сегментоядерных нейтрофилов - в пределах нижней половины зоны нормы, остальных форменных элементов - в пределах нормы.

б) повышенной активации - число лимфоцитов выше нормы, сегментоядерных нейтрофилов - ниже нормы, остальных форменных элементов - либо выше, либо ниже нормы. При реакции повышенной активации более выражено увеличение активности органов тимико-лимфатической системы, клеточного иммунитета, секреции гормонов щитовидной железы, половых желез, тропных гормонов гипофиза.

При реакции повышенной активации более выражено противовоспалительное действие и умеренно преобладает активность противосвертывающей системы. При реакциях спокойной и повышенной активации преобладают процессы анаболизма, особенно при повышенной активации. Пластический и энергетический обмены хорошо сбалансированы.

Биологический смысл обеих реакций активации -- в адекватном повышении активности защитных систем в ответ на раздражитель средней силы, что соответствует оптимальному уровню защитного ответа организма. При этих реакциях происходит самая быстрая и адекватная перестройка защитных сил в ответ на повреждающие воздействия, самое быстрое заживление ран или восстановление сил после болезни (Татков и др., 2004).

Реакция переактивации - возникает при воздействии на организм сильнодействующих факторов. При этом развиваются либо реакция стресса (характеризующаяся выраженной лимфопенией), либо реакция переактивации, которая характеризуется избыточным (выше верхней границы нормы) повышением процентного содержания лимфоцитов в лейкоформуле более нормы, сегментоядерных нейтрофилов ниже нормы, другие форменные элементы - в пределах нормы.

Биологический смысл переактивации - в попытке сохранить активацию в ответ на непосильную нагрузку без «сброса» в стресс. Переактивация, действительно, лучше стресса, но опасна «срывом» в него (Гаркави, 2006).

По мере повышения интенсивности действующего фактора происходит повторение пяти основных известных ОНАР - тренировки, спокойной активации, повышенной активации, стресса или переактивации на разных уровнях реактивности организма.

Если тип реакции определяется процентным содержанием лимфоцитов, то другие элементы лейкоцитарной формулы определяют уровень напряженности. По мере снижения уровня реактивности (увеличении силы управляющего действующего фактора, вызывающего реакцию) процентное содержание форменных элементов крови (эозинофилов, палочкоядерных нейтрофилов, моноцитов, базофилов) все больше отклоняется от нормы. (Гаркави, Квакина, 1990).

В формировании стрессовых состояний наибольшую роль играют следующие нейрогуморальные подсистемы: тиреоидная, дренокортикальная, ваго - инсулиновая, соматотропная (Кокс, 1981).

Существует целый ряд возможных вариантов ответов гипофиз - адреналовой и тиреоидной эндокринных осей на стрессоры различной природы, интенсивности и длительности действия, зависящих от степени включения медиаторных систем опиоидных рецепторов (Робу, 1989).

При стрессе наряду с элементами защиты имеются элементы повреждения; стресс - это реакция, при которой сохранение жизни (защита) достигается ценой повреждения (Корягин, Ерофеева, 2004).

1.2 Характеристика различных видов стресс-факторов

Токсический стресс

Среди биологически активных веществ природного происхождения одно из центральных мест занимают животные яды. Зоотоксины нашли широкое применение в качестве высокоселективных «тест»-веществ в фундаментальных исследованиях биологии и медицины (Орлов, Гелашвили, 1985).

С общебиологической точки зрения зоотоксины являются химическими факторами, участвующими в аллелохимических взаимодействиях, являясь орудиями защиты или нападения, зоотоксины выступают по тоношению к организму хищника или жертвы в качестве мощных стресс-факторов. Острое стрессорное воздействие, оказываемое зоотоксинами, обусловлено внезапностью контакта и интенсивностью эффекта (Гелашвили, 1989).

Ведущим звеном в формировании интегральной реакции организма на острое стрессорное действие зоотоксинов является гиперсекреция эндогенных физиологически активных веществ (нейромедиаторов, гормонов).

Активация под влиянием зоотоксинов, наряду с гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и симпато-адреналовой, эндогенной опиоидной системы (ЭОС) является важным физиологическим механизмом формирования стресс-реакции организма. При этом в зависимости от интенсивности действующего стресс-фактора, ЭОС обеспечивает либо компенсацию возмущающего эффекта, либо выступает в роли триггерного звена «круга» патологических реакций (Парин, 1986).

На внутриклеточном уровне стрессорное действие зоотоксинов реализуется с участием системы циклических нуклеотидов, выступающих в качестве звена быстрой адаптации к воздействию стресс-факторов.

В зависимости от специфичности стрессорного действия зоотоксинов, обусловленных особенностями их химического строения и физического механизма действия, компенсация нарушений нейрогуморальной регуляции может протекать по механизму стабилизации, многопараметрической компенсации, либо по комбинированному типу (Гелашвили, 1989).

Физический стресс

В процессе эволюционного развития живые организмы адаптировались к определенным условиям внешней среды, сложился некоторый круг относительно устойчивых физиологических параметров, отражающих оптимальное состояние организма. Такие условия воспринимаются как комфорт и характеризуются установленным диапазоном интенсивности и продолжительности воздействия факторов внешней и внутренней среды, достаточно благоприятных для жизнедеятельности организма. Вместе с тем факторы обитания и деятельности, воздействие которых выходит за диапазон оптимальности, вызывают различные защитные реакции организма.

Экстремальность воздействий среды определяется как повышением, так и выраженным понижением ее параметров: физические нагрузки - гиподинамия (резкое ограничение усилий); ограничение движения - гипокинезия; перегрузка-невесомость; шум-сенсорная депривация (ограничение звуковой информации); длительное избыточное потребление кислорода - его недостаток во вдыхаемом воздухе (гипоксия); избыток углекислоты (гиперкапния) -недостаток углекислоты (гипокапния) и др. (Сопов, 2002).

1.3 Эритроциты

Повышенный интерес исследователей к эритроциту обусловлен его участием в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза на уровне целого организма (Рязанцева, Новицкий, 2004).

Физиологические свойства, такие как деформируемость, осмотическая резистентность и способность к агрегации, обеспечивающие продвижение эритроцитов по кровяному руслу, а следовательно, транспорт кислорода к органам и тканям, определяются лабильностью эритроцитарной мембраны (Зинчук, 2001; Иржак, 2001; Johnson, 1994).

Строение эритроцитарной мембраны

Мембраны клеток играют огромную роль как в структурной организации, так и в функционировании клеток, участвуя в большинстве жизненно важных клеточных функций таких, как транспорт ионов, биоэнергетические процессы, а также регуляции межклеточных связей и взаимодействий. Эритоцитарной мембране присущи общие принципы организации плазматических мембран (Кулапина и др., 2005).

Известно, что эритроцитарная мембрана представляет собой композитную структуру, основу которой составляет липидный бислой с ассиметрично встроенными переферическими и интегральными белками. Содержание белков - 50%, липидов - 40% и углеводов - 10%.

Важнейшие компоненты эритроцитарной мембраны - белки, обеспечивают транспорт молекул внутрь клетки и из нее, в качестве ферментов катализируют ассоциированные с мембранами реакции, служат в качестве рецепторов для получения и преобразования химических сигналов, а также определяют механические и морфологические свойства клетки (Конев, 1987).

В зависимости от расположения в мембране их делят на периферические (внутренние) и интегральные. Основная часть мембранных белков располагается на внутренней (цитоплазматической) стороне мембраны и образует сеть филаментов, которая служит для поддержания двояковогнутой формы (Ивенс, Скейтлак, 1982).

По функциональному назначению полипептидные составляющие эритроцитарной мембраны можно разделить на две основные группы:

- белковые компоненты, принимающие участие в формировании мембранного скелета: спектрин, анкирин, актин, белки полос 4.1, 4.2, 4.9;

- полипептиды, обеспечивающие метаболизм и ионный баланс эритроцитов: белки полосы 3, гликофорины, аддуцин, Na+, K+-АТФаза, Ca2+-АТФаза, ряд белков полосы 4.5 (Рязанцева, Новицкий, 2004).

От свойств липидной фазы мембран зависит работа мембранных ферментов и рецепторов (Владимиров, 2000). Липидные молекулы, являясь важным структурным и функциональным компонентом мембраны эритроцита, регулируют подвижность и активность внутремембранных белков, тем самым обеспечивая в клетке селективную проницаемость и нормальное функционирование мембранассоциированных ферментов, а также рецепторного аппарата (Рязанцева, Новицкий, 2004).

Мембранные липиды по своим физико-химическим характеристикам относятся к жидким кристаллам смектического типа (Антонов, 1982).

Выделяют три основных класса липидов в эритроцитарной мембране по их химической природе (Богач и др., 1981):

- фосфолипиды - 60% (к ним относятся нейтральные - фосфотидилхолин (ФТХ), сфингомиелин (СМ), фосфотидилэтаноламин (ФТЭА) и кислые - фосфотидилсерин и фосфотидилинозит);

- холестерин - 25%;

- гликолипиды - 15%.

Углеводная составляющая эритроцитарных мембран представлена в виде олигосахаридных цепей, ковалентно присоединенных к белкам (гликопротеины) и в меньшей степени к липидам (гликолипиды). Гликолипиды располагаются в наружном слое эритроцитарной мембраны, и несут функцию препятствия процессу агглютинации (Моисеева, 1986).

Патологические процессы разворачиваются по единому сценарию, независимо от первичного инициирующего фактора, поскольку существуют общие закономерности реагирования клеток на разнообразные патогенные воздействия. (Новицкий и др., 2006); воздействие на клетки тканей и органов разных повреждающих факторов (токсические соединения, свободные радикалы и тд.) вызывает запуск универсального ответа вследствие действия сходных молекулярных механизмов повреждения таких как интенсификация ПОЛ, окислительная модификация белковых молекул, снижение активности системы антиоксидантной защиты клетки (Kiefer, Snyder, 2000).

Состояние системы ПОЛ в организме регистрируется по концентрации малонового диальдегида (МДА). Защиту организма от оксидативного стресса осуществляет глутатионовая антипероксидазная система, включающая в себя глутатион, глутатионпероксидазу, глутатионтрансферазу, глутатионредуктазу (Владимиров, 1972).

Модификации эритроцитарной мембраны при действии стресс - факторов.

Согласно современным научным исследованиям в системе крови наблюдаются изменения, типичные для стресс - реакции, осуществляемые с помощью существующей в организме сложной, многоуровневой гипоталамо-гипофизарной стресс-реализующей системы (Булгакова, Баранцева, 2009). Гипоталамо-гипофизарно-адреналовая система и ее конечный продукт - глюкокортикоиды являются главным биологическим инструментом адаптации организма к стрессу различной природы (Месхидзе, 2008).

В организме, в ответ на стресс-воздействие происходит увеличение числа эритроцитов, так называемая стресс-полицителия, при этом из кровяных депо в кровяное русло выбрасываются эритроциты. (Маслова, 1994).

Липидные молекулы мембран эритроцитов, регулирующие селективную проницаемость и функционирование мембранассоциированных ферментов, при дезорганизации становятся субстратом для перекисного окисления липидов и ферментативного гидролиза. Закономерно приводящих к утрате способности клеток регулировать ионный и антиоксидантный гомеостаз, нарушению работы мембрансвязанных энзимов, что в конечном итоге способствует изменению метаболизма клетки, а также приводит к необратимым нарушениям ее структурно - функционального статуса (Медведева, Маслова, 1993).

1.4 Пчелиный яд

Яд, вырабатываемый рабочими особями медоносной пчелы (Apis mellifera) - один из первых объектов зоотоксикологических исследований. Несмотря на то, что человечество с древнейших времен использует пчелиный яд с лечебными целями, строго научные сведения о его химическом составе стали появляться лишь в 50-е года XX века. Основные компоненты пчелиного яда были впервые открыты Нойманом и Габерманом (Орлов, Гелашвили, 1985).

Химический состав пчелиного яда

Высушенный пчелиный яд представляет собой многокомпонентную смесь из неорганических и органических веществ. Благодаря современным методам выделения и анализа сегодня идентифицировано 98% компонентов пчелиного яда.

Минеральные вещества яда составляют 2-4% сухой массы яда и представлены кальцием, фосфором, магнием, медью и хлоридами. Установлено наличие в яде 2-6% сахаров (глюкоза, фруктоза), жироподобные вещества имеются в яде в концентрации 1-3%, около 1% яда составляют свободные аминокислоты.

Основная часть сухого вещества яда представлена белками и пептидами - около 80% (Артемов, 1961; Крылов, 2002).

Фосфолипаза А2. Фосфолипаза пчелиного яда является наиболее устойчивым из его ферментов, осуществляет расщепление липидов. Она сохраняет свою активность при длительном хранении высушенного яда (Habermann, Neumann, 1957).

Биологические свойства фосфолипазы яда обусловлены ее биохимической активностью. Фосфолипаза является сильным антигеном и аллергеном, отсюда весьма значительное число случаев анафилактического шока при пчелиных ужалениях (Крылов, 1995).

Кислая фосфатаза - присутствует в яде в количестве около 1%, активно отщипляет фосфаты с первой и второй позиций у глицериновых и с первого места у сахарных фосфатов, способствует разрушению фосфолипидов фосфолипазой А2 (Шкендеров, Иванов, 1985).

Альфа - глюкозидаза - проявляет альфа - гликозидазную активность при температурном оптимуме 46oС, из всех компонентов яда имеет наибольшую молекулярную массу 170 кДа, в ее аминокислотном составе отсутствуют серосодержащие аминокислоты - метионин и цистин (Крылов и др., 2007). Лизофосфолипаза - гликопротеин отщепляющий единственную жирную кислоту, находящуюся на первом месте молекулы токсичного лизолецитина, превращая его в нетоксической соединение (Шкендеров, Иванов, 1985).

Гиалуронидаза пчелиного яда - гликопротеин, биологическое назначение которого заключается в катализации гидролиза гиалуроновой кислоты (компонент основного вещества соединительной ткани), чем способствует распространению других компонентов яда в организме. (Орлов, Гелашвили, 1985).

Мелиттин является основным физиологически активным компонентом пчелиного яда и составляет свыше 50% сухого вещества яда (Крылов, 1995).

Основное биологическое действие мелиттина заключается в его способности нарушать структуру клеточных мембран, путем образования мембранных пор, сквозь которые высвобождается клеточное содержимое; мелиттин является сильным гемолитиком; ингибирует работу различных АТФаз (Крылов, 1995); повышает активность фосфолипазы А2, вызывая тем самым образование арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов (Rao, 1992).

Мелиттин F является фрагментом мелиттина и состоит из 19 аминокислотных остатков, N - кондевым его остатком является Валин (Крылов и др., 2007).

Апамин - один из самых маленьких пептидов, содержание его в яде не велико, и составляет 2%. Апамин обладает ярко выраженным действием на ряд постсинаптических мембран нервных клеток как в периферической, так и в центральной нервной системе, он обладает блокирующим эффектом на альфа - адренореактивные, холинергические и пуринергические рецепторы. Но наиболее ярко свойства пептида проявляются по отношению к кальцийзависимым калиевым каналам в мембране клеток (Байдан, Жолос, 1988; Habermann, 1984).

МСД-пептид (пептид 401). Физиологические свойства МСД - пептида вытекают из механизмов его действия. МСД - пептид способен высвобождать гистамин из гранул тучных клеток посредством слияния гранул с клеточной мембраной, приводящего к экзоцитозу, таким образом содержимое гранул выбрасывается во внеклеточное пространство без лизиса тучных клеток. По своей способности высвобождать биогенные амины из тучных клеток МСД - пептид превосходит меллитин и фосфолипазу А2 в 10 - 100 раз (Крылов, 2002).

Адопалин - компонент пчелиного яда, обладающий болеутоляющим действием, препятствует агрегации (склеиванию) эритроцитов крови и предупреждает тромбообразование (Крылов, 1995). Угнетает активность двух ключевых ферментов процесса воспаления - циклооксигеназу и липооксигеназу, тем самым ингибирует синтез простагландинов и их воспалительные свойства (Шкендеров, Иванов, 1985).

Тертиапин - содержит 20 аминокислотных остатков с N - концевой группой аланином и подобно апамину, имеет два дисульфидных мостика; не обладает биологической активностью по отношению к млекопитающим, однако оказывает блокирующее действие на нейромедиацию нервно - мышечного препарата лягушки (Крылов и др., 2007).

Секапин - содержит предположительно 20-25 аминокислотных остатков, с большим содержанием пролина и тирозина на N - конце, имеет один дисульфидный мостик. Также, как и тертиапин является минорным компонентом яда (Крылов и др., 2007).

Прокамины - содержат 5 аминокислотных остатков, отличительной особенностью этих пептидов является присоединенный к молекуле на С - конце гистамин (Крылов и др., 2007).

Кардиопеп - влияет на препараты сердца животных; предполагается, что этот пептид присутствуеи в яде для поражения беспозвоночных животных, обычных врагов пчел; образуется из неактивных предшественников - протоксинов (Крылов и др., 2007).

Протеазные ингибиторы. Еще одна группа пептидов пчелиного яда принципиально отличаются от вышеназванных пептидов по своему биологическому значению (Шкендеров и др., 1973). Предполагают, что протеазные ингибиторы пчелиного яда предназначены для защиты белковых и пептидных компонентов яда от разрушительного действия тканевых протеаз при попадании яда в организм (Шкенеров, Иванов, 1985).

Кроме белков и пептидов, составляющих основную массу секрета ядовитых желез пчел, в пчелином яде содержится множество низкомолекулярных соединений, таких как биогенные амины (Орлов, Гелашвили, 1985).

Гистамин - продукт декарбоксилирования аминокислоты гистидина, (Вайсфельд, 1981), при попадании в организм млекопитающего вызывает болевой эффект ужаления (Крылов, 1995); повышение уровня гистамина приводит к возростанию количества других физиологических веществ организма - простагландинов, серотонина, адреналина и (Крылов и др., 2007).

Дофамин - гормон, является предшественником норадреналина, участвует в передаче нервного импульса, повышает секрецию простагландинов тканью почек, тормозит перистальтику желудка и кишечника, в ЦНС стимулирует хеморецепторы триггерной зоны и рвотного центра (Крылов, 1995; Орлов, Гелашвили, 1985).

Норадреналин - гормон, является предшественником адреналина, его действие как гормона во многом синергично с действием адреналина, отличается от адреналина гораздо более сильным сосудосуживающим действием, считается одним из важнейших «медиаторов бодрствования», (Орлов, Гелашвили, 1985).

Дофамин и норадреналин, являясь обычными посредниками в межклеточных взаимодействиях насекомых способны производить дезорганизацию функций ЦНС членистоногих (Крылов и др., 2007).

Серотонин - гормон, играющий важную роль в сложных процессах возбуждения, торможения, в центральной нервной системе; является медиатором, способствующим передаче возбуждения от одной нервной клетки к другой, оказывает противосудорожное действие, вызывает сужение просвета мелких артерий и артериол, повышает кровяное давление, усиливает перистальтику кишечника и способствует свертыванию крови.

Содержание их исчисляется долями процента и присутствие выявлено не у всех видов пчел (Орлов, Гелашвили, 1985).

Биологическое действие яда пчелы

После ужаления первыми вступают в действие гистамин и МСД - пептид, разрушающие тучные клетки соединительной ткани, из которых также высвобождается гистамин, серотонин и другие эндогенные амины; они вызывают усиление кровоснабжения пораженного участка, повышают проницаемость стенок кровеносных сосудов, оказывают болевой эффект (Крылов, 1995).

В силу возникшей ситуации основная масса яда попадает в кровоток и по магистралям кровеносных сосудов достигает наиболее уязвимых участков организма - центральной нервной системы (Орлов, Гелашвили, 1985).

Гиалуронидаза яда расщепляет гиалуроновую кислоту, лежащую в основе полимерных волокон соединительной ткани, окружающей клетки т. е. «разжижает» гель межклеточного вещества и тем самым снимает барьер для проникновения токсических компонентов яда к функциональным группам клеток (Крылов, 1995).

Затем под действием апамина происходит дезинтеграция связей между нервными клетками, что способствует понижению сопротивляемости клеток.

Оказавшаяся незащищенной мембрана нейрона подвергается воздействию основным компонентам яда: мелиттину и фосфолипазе. Фосфолипаза размыкает фосфолипидные связи в облочке нейрона и в сумме с мелиттином усиливают разрушение мембран и нарушения работы нейронов.

При отравлении пчелиным ядом отмечается нейротоксическое, геморрагическое и гемолитическое действие на организм. Происходит падение артериального давления, изменение сердечного ритма с возникновением аритмий, затруднение дыхания из-за спазмов гладкой мускулатуры воздухоносных путей и угнетения дыхательного центра (Крылов, 1995).

При введении в организм в малых дозах пчелиный яд повышает общую устойчивость (резистентность) организма к общим патологическим процессам; что может быть объяснено развитием в организме компенсаторных реакций, приводящих к повышению уровня циркулирующих глюкокортикоидов и направленных на элиминацию стресс - фактора (Корягин, Ерофеева, 2004).

2. Материалы и методы

Работа выполнена на 15 белых нелинейных крысах, массой 150-180 г, содержавшихся в стандартных условиях освещения и пищевого режима вивария ННГУ. Животные были разделены на 3 группы (по 5 особей в каждой):

I - интактные крысы, не подвергавшиеся на протяжении эксперимента воздействию стрессирующих факторов;

II - крысы, подвергавшиеся на протяжении эксперимента воздействию стресса посредством плавания в воде (10 °С) в течение 15 мин. с грузом массой 20 г, ежедневно, в течение 7 дней;

III - крысы, подвергавшиеся на протяжении эксперимента воздействию стресса посредством внутрибрюшинного введения пчелиного яда ежедневно, в течении 7 дней (суммарная доза составила 0,5 мг/кг веса).

Забор крови у животных осуществлялся из подъязычной вены через 1 час, 1 сутки и 1 неделю после последнего воздействия плавания и пчелиного яда.

Определяли ЭФПЭ, концентрацию МДА и систему глутатиона.

Определение электрофоретической подвижности эритроцитов (ЭФПЭ) методом микроэлектрофореза (Харамоненко, Ракитянская, 1974).

Пробирку с кровью полностью заполняют физиологическим раствором и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин., надосадочную жидкость сливают а к осадку эритроцитов добавляют физиологический раствор и повторяют центрифугирование. Следующее центрифугирование проводят с буферным раствором, который в дальнейшем служит электрофоретической средой. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают. Из осадка готовят взвесь эритроцитов, помещая в 10 мл трис HCl буфера 0,02-0,05 мл эритроцитов.

Заполняют камеру для электрофореза клеточной взвесью, таким образом, чтобы в камере не было пузырьков воздуха, закрывают каппиляр покровным стеклом и в лунки опускают электроды типа Ag/AgCl.

Наблюдают за перемещением 10 предварительно отмытых эритроцитов в трис HCl буфере (pH 7,4) в одной пробе под микроскопом на расстояние 10 Е, с помощью секундомера, меняя полярным переключателем полярность на электродах. Сила тока проходящего через ячейку составляет 8 мА. Используя формулу, по времени движения клеток, определяют ЭФП клеток.

U=S/tH,

где S-расстояние, на которое переместились исследуемые клетки, в микронах;

t-время, в секундах, в течении которого клетки переместились на указанное расстояние;

H-градиент потенциала, в х*c-f;

U-подвижность клеток, в µ*сек-1*х-1*см.

Определение концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах крови крыс (Владимиров, Арчаков, 1972)

При взаимодействии МДА с двумя молекулами тиобарбитуровой кислоты (ТБК) в кислой среде, при температуре 90-100 °С, образуется окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм (зеленый светофильтр).

В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл взвеси эритроцитов, добавляют 2 мл 30% ТХУ и 2 мл 0,75% ТБК и перемешивают. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем охлаждают и после охлаждения при комнатной температуре центрифугируют 10 мин. при 3000 об./мин. Центрифугат колориметрируют в кювете с рабочей длиной 10 мм, при зеленом светофильтре.

Расчет концентрации МДА (С) проводят по формуле:

С=Д*60/1,56 нМоль/мг эритроцитов,

где Д - оптическая плотность;

60 - разведение;

1,56 - молярный коээфициент экстинкции МДА.

Определение глутатиона в крови крыс по Вудворду-Фрей.

Об уровне свободных SH-групп (G-S-H) судят по количеству пошедшего на титрование раствора йодноватистокислого калия. Окисленный глутатион переводят в восстановленную форму с помощью цинковой пыли и вновь оттитровывают SH-группы; получают общий глутатион (G-SH + G-S-S-G). Окисленный глутатион определяется по разнице (общий глутатион - восстановленный).

В колбу емкостью 50 мл наливают 24 мл воды, вносят 3 мл цельной крови, тщательно перемешивают. Через 5 минут осаждают белки: в колбу внося 3 мл 25% раствора ССК; оставляют на 10 минут, после чего фильтруют через беззольный фильтр в сухую колбу. Прозрачный фильтрат делят на две части и используют для определения глутатиона:

А. Определение восстановленного глутатиона: 10 мл фильтрата переносят в сухую колбу (колба 1);

Б. Определение окисленного глутатиона: для восстановления окисленного глутатиона в оставшийся фильтрат вносят небольшое количество цинковой пыли и оставляют при комнатной температуре на 30 мин., взбалтывая время от времени. Затем жидкость фильтруют через беззольный фильтр в пробирку, из которой переносят в сухую колбу 10 мл (колба 2). В обе колбы приливают по 2,5 мл 4% раствора ССК и 2,5 мл 5% раствора KI, добавляют 2-3 капли 1% раствора крахмала и титруют 0,001Н раствором KIO3 до появления слабо-голубого окрашивания.

Концентрацию глутатиона (А) в колбах №1 и №2 определяют по формуле:

А=I*100/3,26 мг%,

где I - количество мл 0,001Н раствора KIO3, израсходованного на титрование пробы;

3,26 - число, соответствующее объему (мл) KIO3, идущего на титрование 1 мг глутатиона;

100 - для расчета на 100 мл крови.

Глутатион колбы №1 - восстановленный, колбы №2 - общий; окисленный глутатион определяют по разнице между общим и восстановленным. Для перевода мг% в мкМоль/л количество восстановленного глутатиона (в мг%) умножают на 32,5, а окисленного - на 16,3.

Статистическая обработка результатов проводилась по Т-критерию Стьюдента.

3. Результаты исследования и их обсуждение

В качестве первого компонента анализа, позволяющего интегрально описать функциональное состояние эритрона, нами выбрано исследование электрофоретической подвижности данных клеток (рис. 1).

В ходе эксперимента выявлено, что через 1 час наблюдалась тенденция к понижению ЭФПЭ при исследуемых видах воздействия, наиболее выраженная при действии пчелиного яда.

Повторяющаяся физическая нагрузка в виде плавания на 1 сутки после последнего воздействия вызывала повышение ЭФПЭ на 29,8% по отношению к интактным животным (P ? 0,05). При введении пчелиного яда повышение ЭФПЭ было зарегистрировано к 1 неделе эксперимента на 20,3%, тогда как физическая нагрузка определила восстановление ЭФПЭ на данном этапе наблюдения.

Рис. 1. Динамика изменения ЭФП эритроцитов крыс при различных стрессирующих воздействиях «*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05

В соответствии с нашими данными, ЭФПЭ претерпевала сходные изменения при различных видах воздействия. Первоначально (1-я фаза) это находило отражение в форме депрессии уровня ЭФПЭ, что наиболее явно проявилось при действии пчелиного яда, с последующей его элевацией, превышающей исходные значения (2-я фаза). Межгрупповые различия носили только количественный характер.

Полученные результаты совпадают с ранее полученными данными для других видов стресса и свидетельствуют о наличии закономерных изменений электрокинетических свойств эритроцитов в ответ на протекающие в организме стрессогенные реакции (Крылов, Дерюгина, 2005).

Известно, что при развитии общего адаптационного синдрома ведущими гуморально-гормональными системами являются симпато-адреналовая и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая. В связи с этим, потенциальный механизм снижения ЭФПЭ (1-я фаза), по-видимому, связан с модификацией мембраны эритроцита эндогенными катехоламинами, затрагивающим ее интегральные сиалогликопротеины, которые играют основную роль в создании отрицательного заряда на поверхности клеток. В процессе развертывания стресс-реакции катехоламины, активируя выброс АКТГ, стимулируют нарастание в крови уровня гормонов коры надпочечников (Рязанцева и соавт., 2004). Экскреция кортикостероидов, направленная на лимитирование 1-й фазы стресс-реакции, вероятно, определяет повышение ЭФПЭ (2-я фаза) за счет их взаимодействия с кортизоловыми рецепторами (Крылов и соавт., 2007).

В соответствии с выдвинутыми предположениями, можно объяснить количественные различия фазности изменения показателя ЭФПЭ при изученных типах стрессового воздействия. Так, для пчелиного яда характерна более продолжительная фаза активации коры надпочечников, а плавание, вызывая стресс меньшей выраженности, приводило к менее значительным изменениям ЭФПЭ.

Учитывая, что ЭФПЭ является функцией клеточных мембран и зависит от их реорганизации, нами было проведено исследование концентарции МДА в эритроцитах, интегрального показателя, характеризующего функциональное состояние мембран эритроцитов, в том числе активность ПОЛ (Matteucci et. al, 1992).

В ходе экспериментов было установлено, что через 1 сутки после воздействия физического стресса наблюдалось достоверное по отношению к интактным животным уменьшение содержания МДА на 35,6% (рис. 2).

Пчелиный яд, провоцирующий достаточно длительный выброс кортикостероидов (Крылов и др., 2007), приводил к отсроченному снижению уровня МДА эритроцитов относительно интактной на 1 неделе после последнего воздействия, что характеризовалось снижением данного показателя на 17,1% относительно интактных (рис.2). Концентрация МДА при физической нагрузке восстанавливалась к 1 неделе наблюдения.

Рис. 2. Динамика изменения концентрации МДА в эритроцитах крыс при различных стрессогенных воздействиях «*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05

Учитывая, выявленное изменение концентрации МДА, характеризующее активацию процессов ПОЛ в ходе развития стресс-реакции при действии повторяющихся стрессоров, нами было проведено исследование состояния системы глутатиона, нейтрализующей перекиси липидов и поддерживающей в восстановленном состоянии сульфогидрильные группы белков, что обеспечивает их функциональную активность. Система глутатиона рассматривается как буферная, защищающая эритроциты от деструктивного действия окислителей (Владимиров, 1972).

Исследование концентрации общего глутатиона позволило установить наличие единой для животных всех групп тенденции к падению его уровня в динамике эксперимента (рис. 3, 4, 5).

Рис. 3. Динамика изменения концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс при различных стрессирующих воздействиях

«*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05

Рассматривая динамику изменения содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах крыс, необходимо отметить, что для обеих групп отмечено снижение уровня восстановленного глутатиона на 1 час после воздействия с последующим повышением к 1 неделе (рис. 3).

Рис. 4. Динамика изменения концентрации окисленного глутатиона в эритроцитах крыс при различных стрессирующих воздействиях «*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05

Изучение содержания в эритроцитах окисленного глутатиона показало, что его концентрация существенно отклоняется от уровня таковой у крыс интактной группы на 1 час после воздействия токсического стресса регистрировался рост на 79,9% и после воздействия физического стресса на 1 сутки после воздействия (63,7%) (рис. 4).

Очевидно, что система глутатиона, являющаяся ключевым внутриклеточным антиоксидантом, активировалась при воздействии изучаемых стрессоров. Анализ полученных результатов свидетельствует, что в процессе повторяющегося стрессового воздействия происходит истощение системы глутатиона, что по все видимости направлено на восстановление окислительного потенциала клетки.

Следует отметить, что изменение динамики ЭФПЭ сочеталось с показателями, полученными при расчете концентрации МДА и общего глутатиона: понижение ЭФПЭ сопровождалось увеличением концентрации МДА и снижением концентрации общего глутатиона.

Рис. 5. Динамика изменения концентрации общего глутатиона в эритроцитах крыс при различных стрессирующих воздействиях «*» - статистическая значимость различий с интактными животными р<0,05

Воздействие на клетки тканей и органов разных повреждающих факторов (токсические соединения, свободные радикалы, продукты липопероксидации, гипергликемия и т.д.) вызывает запуск универсального ответа вследствие действия сходных молекулярных механизмов повреждения при различных причинах, его вызвавших. К их числу относятся, прежде всего, интенсификация ПОЛ, окислительная модификация белковых молекул, активация эндогенных фосфолипаз и протеаз, снижение активности системы антиоксидантной защиты клетки. Инициация этих механизмов сопровождается неспецифическими изменениями структуры и функции клеточных мембран (Sushil, 1988).

Наиболее тяжелые последствия для клетки вызывает повреждение липидного бислоя мембраны вследствие активации процессов ПОЛ, действия мембранных фосфолипаз, механического (осмотического) растяжения мембраны, адсорбции на липидном слое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды. При этом ПОЛ отводится роль механизма, обеспечивающего доступность липидных и белковых компонентов для действия фосфолипаз и протеаз. Активация ПОЛ затрагивает важнейшие физико-химические свойства мембран (проницаемость, вязкость, фазовое состояние) (Новицкий и соавт., 2003). Усиление ПОЛ клеточных мембран приводит к уплотнению либо деструкции липидного бислоя, повышению его микровязкости, сокращению площади белок-липидных контактов, нарушению функциональной активности ферментов, изменению мембранной проницаемости и поверхностного заряда, нарушению функционального состояния мембрано-рецепторного комплекса. Процесс ПОЛ играет роль механизма, обеспечивающего доступность липидно-белковых компонентов мембран клеток для фосфолипаз и протеаз соответственно. Возникает «порочный круг»: патогенный фактор (например, недостаток О2) нарушает энергетический обмен и стимулирует свободнорадикальные процессы в клетке, а активация свободнорадикального окисления приводит к повреждению мембран и усугубляет дефицит энергии, таким образом, отмечается уменьшение уровня макроэргов, накопление в клетках ионов Са2+, так как снижение уровня АТФ приводит к выключению ионных насосов и поступлению ионов кальция из межклеточной среды, а также активация мембраносвязанных фосфолипаз, гидролиз части ФЛ, увеличение проницаемости мембран (Кагава, 1985).

Таким образом, очевидно, что развитие различных по механизму альтерирующих процессов и состояний сопровождается молекулярными изменениями плазматических мембран клеток, являющихся как непосредственной мишенью повреждающего действия патогенных факторов, так и вовлеченных в патологический процесс в связи с инициацией универсальных механизмов повреждения клетки (дефицит энергопродукции, интенсификация процессов свободнорадикального окисления, активация фосфолипаз, протеаз, нарушение ионного гомеостаза и др.). Сложность установления причинно-следственных связей между различными параметрами, характеризующими состояние мембран и метаболизм клеток, а также оценки удельного веса отдельных молекулярных механизмов в реализации мембранодеструктивных процессов обусловлены тесной взаимосвязью данных факторов между собой. Однако получение обобщающих положений о базисных механизмах и общих закономерностях реагирования разнообразных клеточных систем при патологии разного генеза не только сулит успех для понимания общебиологических законов развития патологических процессов, но и позволяет по-новому взглянуть на методологию их коррекции (Новицкий и соавт., 2004).

Выводы

1. Повторяющееся стрессовое воздействие вызывало рост ЭФПЭ при действии физической нагрузки к 1 суткам после последнего воздействия, а при внутрибрюшинном введении пчелиного яда к 1 неделе.

2. Концентрация малонового диальдегида при исследуемых стрессовых воздействиях понижалась на 1 сутки наблюдения при действии физической нагрузки, и к 1 неделе - при действии пчелиного яда.

3. Повторяющееся физическое воздействие и введение пчелиного яда определили снижение концентрации глутатиона 1 часу после последнего воздействия за счет восстановленной формы глутатиона.

Цитированная литература

1. Александрова, О.И. (Коновалова, О.И.) Влияние пчелиного яда на интенсивность перекисного окисления липидов и энергетический обмен у крыс при многократном введении в условиях относительной нормы/О.И. Александрова (О.И. Коновалова), Е.А. Ерофеева, A.C. Корягин, О.Н. Гамова//Естествознание и гуманизм. Сб. науч. трудов. 2006. Т.3. № 4. С. 36.

2. Альберс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. М., 1994. Т.1. 515 с.

3. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: «Медицина», 1982. 151 с.

4. Апчел В.Я., Цыган В.Н. Стресс и стрессустойчивость человека. СПб., 1999. 86 с.

5. Артемов Н.М. Физиологические основы действия на организм пчелиного яда: Автореф. дисс. Докт. биол. наук. Горький, 1969. - 55 с.

6. Артемов Н.М., Побережская Т.И., Сергеева Л.И. Холинолитические свойства пчелиного яда и его ганглиоблокирующие действие//Проблемы эволюции функций и энзимохимии процессов возбуждения. М., 1961. С. 7 - 16.

7. Байдан Л.В., Жолос А.В. Апамин - высокоспецифический и эффективный блокатор некоторых кальцийзависимых калиевых проводимостей//Нейрофизиология. 1988. Т.20, №6. С. 833 - 846.

8. Богач П.Г., Курский МД., Кучеренко Н.Е., Рыбальченко В.К. Структура и функция биологических мембран. Киев: «Высшая школа». 1981. 336 с.

9. Булгакова О.С., Баранцева В.И. Общий клинический анализ крови как метод определения постстрессорной реабилитации//Успехи соврем. естествознания. 2009. №6. С 22 - 27.

10. Вайсфельд И.Л. Гистамин в биохимии и физиологии. М.: «Наука», 1981. 277 с.

11. Васильева Е.М., Баканов М.И., Гордеева Г.Ф и др. Фосфолипидный состав эритроцитов при неврологических нарушениях у детей; влияние сопутствующей патологии//Медиц. научный и учебно-методический журнал. 2001. №2. С. 92 - 109.

12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: «Наука», 1972. 252 с.

13. Владимиров Ю.А. Биологические мембраны и незапрограммированная смерть клетки//Соросовск. образов. журнал. 2000. Т.6, №9. С.2 - 10.

14. Гаркави Л.Х. Активационная терапия. Ростов - на - Дону: РГУ, 2006. 256 с.

15. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов - на - Дону: РГУ, 1990. 376 с.

16. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б. Антистрессорные реакции и активационная терапия. М.: «Имедис», 1998. 565 с.

17. Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б. О критериях оценки неспецифической резистентности организма при действии различных биологически активных факторов с позиции теории адаптационных реакций//Миллиметр. волны в биол. и медицине. 1995. № 6. С.11-21.

18. Гелашвили Д.Б. Анализ физиологических механизмов действия некоторых животных ядов и их фракций на центральную нервную систему: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Горький. 1975. 19 с.

19. Гелашвили Д.Б. Нейрогуморальные механизмы стрессорного действия зоотоксинов и физиологические основы коррекции их повреждающих эффектов. Автореф. дисс. докт.биол.наук. Тбилиси. 1989. 47 с.

20. Геннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.: «Мир», 1997. 599 с.

21. Горизонтов П.Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. М., 1983. 240 с.

22. Грибанов Г.А. Особенности структуры и биологическая роль лизофосфолипидов//Вопр. медиц. химии. 1991. Т.37, № 4. С. 2 - 16.

23. Джарвис Д.С. Мёд и другие естественные продукты. Бухарест: «Апимондия», 1975. 136 с.

24. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты//Успехи физиолог. наук. 2001. Т.32, №3. С. 66 - 78.

25. Ивенс И., Скейлак Р. Механика и термодинамика биологических мембран. М.: «Мир», 1982. 304с.

26. Иржак Л.И. Состав и функции крови//Соросовск. образов. журнал. 2001 Т.7, №2. С. 11 - 19.

27. Казимирко В.К., Мальцев В.И., Бутылин В.Ю., Горобец Н.И. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. Морион, Киев, 2004, 160с.

28. Казеннов А.М., Маслова М.Н., Шалабодов А.Д. Роль мембранного скелета безъядерных эритроцитов в функционировании мембранных ферментов//Доклады АН СССР. 1990. Т. 312, №1. С. 223 - 226.

29. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и патологии. Биоантиокислители. М.: «Наука», 1985, С.4-5.

30. Козлов М.М., Маркин В.С. Мембранный скелет эритроцита. Теоретическая модель//Биологич. мембраны. 1986. Т.3, №4. С. 404 - 422.

31. Кокс Т. Стресс. М.: «Медицина», 1981. 216 с.

32. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. Минск.: «Наука и техника», 1987. 240 с.

33. Корягин А.С., Ерофеева Е.А. Исследование адаптогенных свойств животных ядов к действию повреждающих факторов (на примере ионизирующей радиации)//Поволж. экологич. журнал. 2004. №2. С 173 - 182.

34. Корягин, A.C. Адаптогенные свойства пчелиного яда при действии экстремальных факторов различной природы/A.C. Корягин, Е.А. Ерофеева, О.И. Александрова (О.И. Коновалова)//Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2007. №3. С. 113-115.

35. Крылов В.Н. Пчелиный яд. Свойства, получение, применение. Н.Новгород: ННГУ, 1995. 223 с.

36. Крылов В.Н., Агафонов А.В., Кривцов Н.И. и др. Теория и средства апитерапии. М., 2007. 296 с.

37. Крылов В.Н., Дерюгина А.В. Типовые изменения электрофоретической подвижности эритроцитов при стрессовых воздействиях (статья)//Бюлл. эксп. биол. и мед. 2005. №4. С. 364-366.

38. Крылов В.Н., Млявый В.П. Пчелиный яд в научной и практической медицине. Минск.: УП «Технопринт», 2002. 266 с.

39. Кулапина О.И., Киричук В.Ф., Утц И.А. и др. Проницаемость мембран эритроцитов у больных с инфекционной патологией//Крит. технол. мембраны. 2005. № 1 (25). С 3 - 11.

40. Курашвили Л.В., Васильков В.Г. Липидный обмен при неотложных состояниях. Пенза, 2003. 198 с.

41. Кучеренко Н.Е., Васильев А.Н. Липиды. Киев: «Высшая школа», 1985. 247 с.

42. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке//Цитология. 2000. №42 (4). С. 323 - 342.

43. Маслова М.Н. Активность мембранных ферментов эритроцитов при различных стрессовых воздействиях//Росс. физиологич. журнал. 1994. Т.80, №7. С. 76 - 80.

44. Маслова М.Н. Молекулярные механизмы стресса//Росс. физиологич. журнал. 2005. Т. 91, №11. С. 1320 - 1328.

45. Медведева И.А., Маслова М.Н. Активность Nа, К-АТфазы эритроцитов при иммобилизационном стрессе у крыс с различной двигательной активностью//Росс. физиологич. журнал. 1993. Т.79, №10. С. 17 - 22.

46. Медведева И.А., Маслова М.Н. Динамика и механизмы изменения активности Nа, К-АТфазы эритроцитов крыс при действии стрессоров различной природы//Росс. физиологич. журнал. 1993. Т.79, №12. С. 28 - 34.

47. Мищенко В.П. Перекисное окисление липидов, антиоксиданты и свертываемость крови // Актуальные проблемы гемостазиологии. Молекулярно-биологические и физиологические аспекты. 2-е доп. изд. М.: Наука, 1981. 504 с.

48. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Вечерский Ю.Ю. Патоморфоз эритроцита у больных с приобретенными пороками сердца и в условиях их хирургической коррекции//Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2004. Т.137, №3. С. 336 - 340.

49. Орлов Б.Д., Гелашвили Д.В. Зоотоксинология. Ядовитые животные и их яды. М., 1985. 280 с.

50. Ошевенский Л.В., Преснухина Н.Г., Лобкаева Е.П., Елисеева Т.И. Электрофоретическая подвижность эритроцитов. Нижний Новгород. 2005. 20 с.

51. Робу А.И. Стресс и гипоталамические гормоны. Кишенев.: «Штица», 1989. 210 с.

52. Парин С.Б. Роль эндогенной опиоидной системы в физиологических и повреждающих эффектах некоторых зоотоксинов. Автореф. дисс. канд.биол. наук. Киев. 1986. 22 с.

53. Рязанцева Н.В., Новицкий В.В. Типовые нарушения молекулярной организации мембраны эритроцита при соматической и психической патологии//Успехи физиологич. наук. 2004. Т.35, №1. С 53 - 65.

54. Рязанцева Н.В., Степовая Е.А., Колосова М.В., Новицкий В.В. Типовая реакция периферического звена эритрона при патологических процессах//Бюлл. сиб. медицины. 2001. №1. С. 29 - 35.

55. Сопов В.Ф. Эмоциональная саморегуляция: теория и прикладные аспекты. Самара: СГПУ 2002. 142 с.

56. Татков О.В., Гаркави Л.Х., Рубцов В.В., Фатькина Н.Б. Опыт применения препарата «Пантогематоген» на клиническом и санаторном этапах//В кн./Актуальные проблемы восстановительной медицины, курортологии и физиотерапии/. СПб. 2004. С.242.

57. Трещинский А.И., Мицук И.И. Электрокинетические свойства крови//Анестез. и реаниматология. 1981. №4. С. 17 - 21.

58. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Зарицкая Г.А., Переведенцева Е.В. Авторегуляция неспецифической проницаемости мембраны эритроцита. М.: «Наука», 1999. 77 с.

59. Харакоз Д.П. Гипотеза о физиологической роли перехода «жидкое-твердое» биологических мембран//Успехи биологич. химии. 2001. Т.41. С. 333 - 364.

60. Харамоненко С.С., Ракитянская А.А. Электрофорез клеток крови в норме и патологии. Минск: «Беларусь», 1974. 143 с.

61. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск: «Наука и техника», 1981. 115 с.

62. Шкендеров С., Иванов Ц. Пчелиные продукты. София: «Земиздат», 1985. 456 с.

63. Habermann E. Bee and wasp venoms.//Science. 1972. V.177, P. 314 - 322.

64. Habermann E. Apamin//Pharmic. Ther. 1984. V.25, P. 225 - 270.

65. Нabermann E., Neumann W. Beiningung der Phospholipase A der Bienengifts//Biochem. 1957. V.328, P. 465 - 472.

66. Нabermann E., Zenner G. Comperativ studies of nature and synthetic melittins//Naynyn-Schmiederberg Arch. Pharmacol. 1971. V.270, №1. P. 1 - 9.

67. Kiefer C.R., Snyder L.M. Oxidation and erythrocyte senescence//Curr. Opin. Hematol. 2000. V.7, №2. P. 113 - 116.

68. Kolesnichenko L.S., Kulinsky V.I., Bardymov V.V., Shprakh V.V., Verlan N.V. Investigation of blood glutathione system in ischemic stroke//JRME NIIGATA. Japan, 2004. P.59.

69. Rao N.M. Differential suscetibility of phosphotidylcholine small unilamellar vesicles to phospholipases A2, C and D in the presence of membrane active peptides//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. Vol. 182, №2. P.682 - 688.