Нанотехнологии в молекулярной биологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования

"Московский Педагогический Государственный Университет"

Реферат

на тему: Нанотехнологии в молекулярной биологии

Выполнила студентка Поленок Екатерина

Проверила Горленко В.А.

Москва, 2010

Нанотехнологии в наше время - это область стремительно развивающаяся. Открытия в ней совершаются ежедневно, СМИ пестрят сообщениями о новейших разработках. Именно поэтому в своем реферате я сделала упор на самых примечательных открытиях в нанобиотехнологии в последнее время.

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия на службе молекулярной биологии

Динамика конформационных изменений белковой молекулы под действием внешних импульсов является важным для изучения биологических процессов, однако исследование этой динамики чрезвычайно затруднено. Однако, применение высокоскоростной АСМ помогает решить эту проблему. На данный момент существует возможность съемки с временным разрешением 30 мс, однако цикл фотовозбуждения бактериородопсина составляет всего 10 мс, поэтому в работе применялся мутантный бактериородопсин, цикл фотовозбуждения которого составляет около 10 с.

Белковая молекула бактериородопсина, динамику которого и изучали исследователи, состоит из нескольких альфа-спиралей (особых трехмерных структур), обозначаемых A-F, соединенных переходными участками. Кроме того, молекулы бактериородопсина на цитоплазматической мембране существуют в виде тримеров. Положение альфа-спиралей отдельных мономеров в процессе возбуждения может меняться, что и будет отражаться при атомно-силовой микроскопии. На Рис.1а и Рис.1b представлены результаты сканирования, стрелки указывают смещение выступов во времени, при этом происходит вращение выступов относительно центра тримера.

В процессе фотовозбуждения молекула бактериородопсина меняет конформацию, в результате чего открываются протонные каналы цитоплазматической мембраны. Однако точный механизм этого неизвестен, так же, как неизвестно, какие именно альфа-спирали участвуют в открытии канала - экспериментальные данные, полученные разными научными группами, сильно расходятся. В результате обработки сканов АСМ установлено, что происходит поднятие связки между спиралями E и F, при этом происходит их смещение (Рис.1с).

При изменении рН среды, стабильность промежуточных конформаций также изменяется (Рис. 1d). В качестве подтверждения того, что данные АСМ представляют динамику молекулы, а не являются случайными артефактами, ученые сравнили результаты спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой области с данными АСМ-сканирования при различных рН. Данные, полученные двумя методами, хорошо согласуются между собой, однако время релаксации, полученное методом АСМ, оказывается немного большое, что может свидетельствовать о наличии неописанных ранее промежуточных состояний.

Особенно интересными являются результаты, представляющие кооперативные эффекты. Оказывается, при возбуждении бактериородопсина мономеры объединяются в структуры, названные трилистниками. Механизм возбуждения мономеров, составляющих трилистник, оказывается довольно сложным - при малой интенсивности возбуждающего света возбуждение отдельного мономера подчиняется экспоненциальному закону, но при более интенсивном освещении тот мономер, которых возбудился позже, чрезвычайно быстро релаксирует, в то время как ранее возбудившийся мономер трилистника теряет энергию существенно дольше и не по экспоненциальному закону. Стоит отметить, что интегрально возбуждение светом малой и большой интенсивности не различаются по длительности, и описанный механизм, включающий перенос энергии в пределах трилистника, не может быть зафиксировано никакой методикой, предполагающей усреднение.

Таким образом, высокоскоростное АСМ-сканирование является перспективным методом изучения молекулярной динамики, позволяющим изучать различные нюансы процесса, которые недоступны для других методов.

Убийство с помощью света

Борьба с инфекционными заболеваниями при помощи антибиотиков приводит к появлению устойчивых микроорганизмов, которые не погибают от лекарств. Для борьбы с резистентными бактериями применяют антибиотики нового поколения - но через некоторое время ситуация повторяется. Это порочный круг, в котором усовершенствование лекарства приводит к усовершенствованию возбудителя болезни.

Разорвать этот круг можно, заменив одно из звеньев - антибиотики - чем-то совершенно иным. Например, бактерии можно разрушить фототермически. Не менее интересный способ - фотодинамическая терапия. Метод основан на том, что при облучении светом определённой длины волны молекула-сенсибилизатор производит синглетный кислород, который атакует живые клетки.

Именно на этом принципе основано действие фотоактивного гибридного наноматериала, созданного немецкими учёными. Материал представляет собой кристаллы цеолита L (50 нм в длину и в диаметре), с которым ассоциированы аж три функционально различных соединения. Цеолит состоит из мельчайших каналов, которые были заполнены зеленым флуоресцентным красителем DXP. К поверхности цеолита были пришиты фталоцианинаты Si(IV). Фталоцианины являются перспективными фототерапевтическими агентами благодаря сочетанию выдающихся свойств. Они низкотоксичны, высокостабильны, а также эффективно производят синглетный кислород, поглощая свет как раз в терапевтически значимом диапазоне длин волн. Наконец, для более направленного действия материала поверхность частиц была модифицирована аминогруппами - благодаря этому наночастицы должны лучше связываться с кишечной палочкой E.coli, на которой сначала и были поставлены эксперименты.

На рисунке 1 показано, как наночастицы связываются с бактериями и окрашивают их. В данном случае в качестве модельного биологического объекта выбран штамм кишечной палочки, устойчивый к антибиотику хлорамфениколу. Устойчивость к антибиотику не помогла им выжить: обработка наночастицами и последующее облучение в течение 2.5 часов светом в диапазоне длин волн 570-900 нм привело к гибели более 95% бактерий (рисунок 2). Совсем другой микроорганизм, устойчивая к тетрациклину бактерия Neisseria gonorrhoeae (возбудитель гонореи), показал сходные результаты (рисунок 3).

Ученые считают, что они создали отличное средство для борьбы с микроорганизмами. К сожалению, в работе не изучено влияние того же самого материала на клетки эукариот.

 Рис.1

Рис.2

Рис.3

Там, где антибиотики бессильны

Фототермическое разрушение клеток в настоящее время является перспективным направлением как при терапии рака, так и в лечении инфекционных заболеваний. Суть явления такова: наночастицы золота имеют максимум поглощения в ближней инфракрасной области, и при облучении соответствующим светом сильно разогреваются. Если они при этом находятся внутри или вокруг каких-либо клеток, то эти клетки погибают.

При лечении инфекционных заболеваний всё более актуальной становится проблема устойчивости патогенных организмов к антибиотикам. Например, синегнойная палочка Pseudomonas aeruginosa, широко распространенный и довольно неприятный паразит, который поражает практически любые ткани ослабленного организма, обладает устойчивостью к очень широкому спектру антибиотиков. Некоторые штаммы этой бактерии вообще не чувствительны ни к одному из применяемых антибиотиков, поэтому обычные методы лечения оказываются недейственными.

Тут-то на помощь и могут прийти наночастицы золота и фотодинамическая терапия! Так решили исследователи из Южной Каролины, США. Ученые синтезировали золотые нанопалочки размером 68 нм в длину и 18 нм в диаметре, максимум поглощения для которых наблюдается при длине волны около 785 нм (рисунок 1), и ковалентно пришили к этим палочкам антитела к синегнойной палочке. Затем такие частицы были добавлены к клеткам (рисунок 2). Наконец, клетки облучили лазером (785 нм, 50 мВатт) в течение 10 минут. Оказалось, что результат соответствует ожиданиям: выжило лишь 25% бактерий по сравнению с необлученным образцом (рисунок 3). Таким образом, фотодинамическая терапия, по-видимому, может быть успешно применена там, где антибиотики бессильны.

атомный микроскопия молекулярный биология

рис.1

рис.2

рис.3

Искусственный рецептор

Живые клетки умеют удивительно точно распознавать внешние регуляторные сигналы и адекватно реагировать на них. Сигналы могут приходить, например, в виде химических соединений (гормонов, факторов роста, токсинов). В этом случае клетка распознает даже малые их количества при помощи специальных белков-рецепторов, расположенных во внешней (плазматической) мембране. Распознав сигнал, рецепторы передают информацию внутрь клетки, где она многократно усиливается и приводит к тому или иному клеточному ответу. Ничего удивительного, что нанотехнологи неравнодушны к клеточным рецепторам.

Самое многочисленное семейство рецепторов - рецепторы, связанные с G-белками, или GPCR (G-protein-coupled receptors). Они умеют распознавать широкий спектр химических соединений, в том числе многие лекарства, наркотики и яды (именно благодаря такому узнаванию эти вещества оказывают свой эффект на организм). Однако после распознавания лиганда GPCR передают сигнал в форме, удобной лишь для живой клетки, и совершенно не удобной для исследователей - в виде активированных G-белков.

В этом смысле более удобны ионные каналы (это тоже белки). Они пронизывают клеточную мембрану насквозь и могут либо пропускать, либо не пропускать сквозь нее те или иные ионы. Открытое или закрытое состояние канала напрямую связано с потенциалом на мембране, который можно измерить.

Французские ученые решили совместить GPCR и АТФ-зависимый калиевый канал (рисунок 1). Полученную конструкцию назвали ICCR: ion-channel-coupled receptor; рецептор, связанный с ионным каналом. В качестве лиганд-узнающей части взяли человеческий GPCR M2, природным лигандом которого является ацетилхолин, а антагонистом - атропин. Ту часть M2, которая в норме связана с G-белком, отрезали. Вместо нее к белку «пришили» часть АТФ-зависимого калиевого канала, которая является собственно ионным каналом (регуляторную субъединицу при этом выбросили совсем). Теперь этот ионный канал должен был стать не АТФ-зависимым, а ацетилхолин/атропин-зависимым.

 рис.1

Исследователи продуцировали химерный рецептор в клетках лягушки. Как видно из рисунка 2, добавление ацетилхолина действительно приводило к открыванию калиевых каналов. В то же время атропин действовал противоположным образом: M2 (по всей видимости) переходил в неактивную форму, и калиевые каналы закрывались (рисунок 3).

рис.2 рис.3

Таким образом, в полученном ICCR калиевый канал является электрическим детектором активности рецептора M2 - что, несомненно, открывает замечательные перспективы. Благодаря разработанному рецептору можно исследовать влияние различных агонистов и антагонистов ацетилхолина на активность рецептора M2, то есть изучать и предсказывать их физиологическое действие. Напрямую преобразуя химическую информацию в электрический сигнал, ICCR является наглядной демонстрацией возможностей биоподражательной нанотехнологии.

Размещено на Allbest.ru