Роль оксида азота в межклеточных процессах

Размещено на http://www.allbest.ru/

Глава 1. Способы получения и применение азота

Азот в природе встречается главным образом в свободном состоянии. В воздухе объемная доля его составляет 78,09%, а массовая доля 75,6%. Соединения азота в небольших количествах содержатся в почвах. Азот входит в состав белковых веществ и многих естественных органических соединений.

Получение. В технике азот получают из жидкого воздуха. Как известно, воздух -- это смесь газов, главным образом азота и кислорода. Сухой воздух у поверхности Земли содержит (в объемных долях): азота 78,09%, кислорода 20,95%, благородных газов 0,93%, оксида углерода (IV) 0,03%, а также случайные примеси -- пыль, микроорганизмы, сероводород, оксид серы (IV) и др. Для получения азота воздух переводят в жидкое состояние, а затем испарением отделяют азот от менее летучего кислорода (т. кип. азота -195,8° С, кислорода -183° С). Полученный таким образом азот содержит примеси благородных газов (преимущественно аргона). Чистый азот можно получить в лабораторных условиях, разлагая при нагревании нитрит аммония:

Физические свойства. Азот в свободном состоянии -- газ без цвета и запаха, состоящий из двухатомных молекул N₂. Он является основным компонентом атмосферы Земли (78% по объему). Азот легче воздуха. Растворимость в воде меньше, чем у кислорода: при 20 °С в 1 л воды растворяется 15,4 мл азота (кислорода 31 мл). Поэтому в воздухе, растворенном в воде, содержание кислорода по отношению к азоту больше, чем в атмосфере. Малая растворимость азота в воде, а также его очень низкая температура кипения объясняются весьма слабыми межмолекулярными взаимодействиями как между молекулами азота и воды, так и между молекулами азота.

Природный азот состоит из двух стабильных изотопов с массовыми числами 14 (99,64%) и 15 (0,36%).

В молекуле N₂ атомы связаны тремя ковалентными связями (две p -связи, одна s -связь), поэтому энергия диссоциации этой молекулы чрезвычайно велика:

Этим объясняется малая реакционная способность азота при обычной температуре (сравните с О₂ и Cl₂).

Химические свойства. Для того чтобы азот вступил в химическую реакцию, требуется предварительная активация его молекул нагреванием, облучением или другими способами.

Из металлов азот реагирует в обычных условиях только с литием, образуя нитрид:

С другими металлами он реагирует лишь при высоких температурах, образуя нитриды. С натрием, кальцием и магнием реакция идет только при нагревании:

Образующиеся нитриды полностью гидролизуются при контакте с водой:



С кислородом азот взаимодействует только в электрической дуге (3000-4000° С) (например, при грозовом разряде в атмосфере) или при очень сильном нагревании:

Поскольку на внешнем энергетическом уровне атома азота находится 5 электронов, азот проявляет степени окисления -3 и +5, а также +4, +3, +2, +1, -1 и -2.

Применение. В больших количествах азот употребляется для получения аммиака. Широко используется для создания инертной среды -- наполнение электрических ламп накаливания и свободного пространства в ртутных термометрах, при перекачке горючих жидкостей. Им азотируют поверхность стальных изделий, т. е. насыщают их поверхность азотом при высокой температуре. В результате в поверхностном слое образуются нитриды железа, которые придают стали большую твердость. Такая сталь выдерживает нагревание до 500 °С без потери своей твердости.

Важное значение азот имеет для жизни растений и животных, поскольку он входит в состав белковых веществ. Соединения азота находят применение в производстве минеральных удобрений, взрывчатых веществ и во многих отраслях промышленности.

Аммиак. В огромных количествах азот используется для синтеза аммиака.

Реакция с водородом идет при нагревании (хотя процесс и экзотермический!) и очень высоком давлении и обязательно с катализатором:



Физические свойства. Аммиак -- важнейшее соединение азота. В обычных условиях это -- бесцветный газ, легче воздуха, с резким запахом. Аммиак сжижается при -33,35 °С и затвердевает при -77,7 °С.

Молекула аммиака имеет форму пирамиды, в основании которой лежит треугольник из атомов водорода, а в вершине -- атом азота, в жидком аммиаке молекулы NH₃ связаны между собой водородными связями, обусловливая тем самым аномально высокую температуру кипения. Полярные молекулы NH₃ очень хорошо растворимы в воде (700 объемов NH₃ в одном объеме H₂O).

Электронная формула молекулы аммиака такова:

Видно, что из четырех электронных пар при азоте три общие (связывающие) и одна неподеленная (несвязывающая).

Химическая связь N--Н полярная: положительный заряд сосредоточен на атомах водорода, отрицательный -- на атоме азота. Вследствие этого между молекулами аммиака и образуется водородная связь, что можно изобразить так:

Благодаря водородным связям аммиак имеет сравнительно высокие температуры плавления и кипения, а также высокую теплоту испарения, он легко сжижается.

Раствор аммиака в воде представляет собой раствор гидроксида аммония, содержащий одновременно молекулярные частицы NH₃ и NH₄OH и ионы NH₄⁺ и ОН:

Водный раствор аммиака обладает свойствами слабого основания, константа его диссоциации при 25 °С составляет 1,8 ? 10^-5.

Азот в аммиаке имеет наименьшую степень окисления и поэтому проявляет только восстановительные свойства. Так, например, при горении аммиака образуются азот и вода:

В присутствии катализатора аммиак может окисляться и до оксида азота NО:

При нагревании аммиака с галогенами, перокcидом водорода, оксидами тяжелых металлов образуется молекулярный азот:

Аммиак идет главным образом на производство азотной кислоты и различных удобрений -- нитрата аммония NH₄NO₃, карбамида (мочевины) (NH₂)₂CO, аммофоса (смесь гидро- и дигидрофосфатов аммония (NH₄)₂HPO₄ и NH₄H₂PO₄).

Соли аммония. Продукты взаимодействия аммиака с кислотами представляют собой соли аммония:

Соли аммония по многим свойствам похожи на соли щелочных металлов, особенно на соли калия и рубидия. Такое сходство объясняется тем, что размер иона аммония (радиус 1,48 А) близок к размерам ионов К⁺ (1,33 Е) и Rb⁺ (1,48 Е).

Они проявляют общие свойства солей, т. е. взаимодействуют с растворами щелочей, кислот и других солей:

Все аммонийные соли растворимы в воде и при этом гидролизуются. Соли аммония термически неустойчивы и при нагревании разлагаются:

Оксиды азота. В оксидах азота степень его окисления меняется от 1+ до 5+. Оксиды N₂O и NO--- бесцветные газы, оксид азота (IV) NO₂ -- бурый газ, получивший в промышленности название “лисий хвост”. Оксид азота (III) N₂O₃ -- синяя жидкость, оксид азота (V) N₂O₅ при обычных условиях -- прозрачные бесцветные кристаллы.

Оксиды N₂O и NO не реагируют c водой и щелочами, тогда как N₂O₃ и N₂O₅, являясь ангидридами, при взаимодействии с водой дают соответствующие кислоты:

Азотистая кислота. HNO₂ неустойчива, тогда как ее соли нитриты, устойчивы.

Оксид азота (IV) NO₂ легко подвергается димеризации, уже при незначительном охлаждении образуя жидкость желто-зеленого цвета:

Оксид азота NO₂ при растворении в воде обратимо диспропорционирует:

Поскольку образующаяся азотистая кислота неустойчива, то при нагревании реакция идет по-другому:

Если диоксид азота NO₂ растворяют в воде в присутствии кислорода, то получают только азотную кислоту:



Последнюю реакцию используют в промышленности для получения азотной кислоты.

Азотная кислота. НNO₃ в чистом виде -- бесцветная жидкость с резким удушливым запахом, очень гигроскопична, “дымит” на воздухе. В небольших количествах она образуется при грозовых разрядах и присутствует в дождевой воде.

Химические свойства. Под действием света азотная кислота частично разлагается с выделением NО₂ и за счет этого приобретает светло-бурый цвет:

Азотная кислота принадлежит к числу наиболее сильных кислот, и для нее характерны все реакции, в которые вступают кислоты, -- с основаниями, основными оксидами и т. д.

Специфическим свойством азотной кислоты является ее ярко выраженная окислительная способность. Сущность окисления различных веществ азотной кислотой заключается в том, что ион NO₃^? , имеющий в своем составе азот в степени окисления 5+, в зависимости от условий (концентрации кислоты, природы восстановителя, температуры) может принимать от одного до восьми электронов. Восстановление аниона NO₃^? в связи с этим может протекать до различных веществ:

Какое из этих веществ образуется, т. е. насколько глубоко произошло восстановление азотной кислоты, в каждом конкретном случае зависит от природы восстановителя, от условий протекания реакции и от концентрации самой кислоты.

При прочих равных условиях образование тех или иных продуктов восстановления азотной кислоты зависит от концентрации. Азотная кислота обладает окислительной способностью при любой концентрации, при этом, однако, чем концентрированнее HNO₃, тем менее глубоко она восстанавливается.

С одним и тем же восстановителем, например цинком, кислота, если она концентрированная, будет обязательно реагировать по схеме (1) с выделением NO₂; если HNO₃ разбавленная, то она может взаимодействовать с Zn по любой схеме (2--5), в зависимости от степени разбавления.

Чтобы восстановление HNO₃ провести наиболее глубоко, необходимо использовать максимально разбавленную кислоту, применять сильный восстановитель и реакцию вести на холоде. При использовании более концентрированной кислоты низшие оксиды азота (образованные в ходе реакции) окисляются концентрированной кислотой до высших.

Азотная кислота взаимодействует со всеми металлами, за исключением Au, Pt, W. Концентрированная HNO₃ не взаимодействует при обычных условиях также с Fe, Al и Сr, которые она пассивирует, однако при очень сильном нагревании HNO₃ взаимодействует и с этими металлами.

Большинство неметаллов и сложных веществ восстанавливают HNO₃, как правило, до NO (реже до NO₂):

Азотная кислота окисляет при нагревании даже кремний:

Однако полного растворения образца кремния при этом не происходит, так как, едва начавшись, последняя реакция быстро прекращается, поскольку образующийся на поверхности кристаллический SiO₂ (кислотный оксид с высшей степенью окисления кремния) препятствует дальнейшему протеканию реакции.

Если же взять смесь азотной и плавиковой кислот, то при нагревании происходит полное растворение образца кремния:

С помощью концентрированной HNO₃ можно растворить также и золото. Для этого необходимо взять смесь, состоящую из одного объема концентрированной HNO₃ и трех объемов концентрированной соляной кислоты (такую смесь называют царской водкой):

Действие царской водки объясняется тем, что концентрированная HNO₃ окисляет НСl по реакции (*) до свободного хлора, который в момент выделения является очень сильным окислителем. По этой причине при растворении металлов в царской водке никогда не получаются соли азотной кислоты, а получаются соответствующие хлориды.

Разложение нитратов. При нагревании твердых нитратов практически все они разлагаются с выделением кислорода (единственным исключением является нитрат аммония), при этом все нитраты можно разделить на четыре группы.

Первую группу составляют нитраты щелочных металлов, которые при нагревании разлагаются на нитриты и кислород, например:

Вторую группу составляет большинство нитратов менее активных металлов (от щелочноземельных металлов до меди включительно), которые разлагаются на оксид металла, NO₂ и кислород:

Третью группу составляют нитраты наиболее тяжелых металлов, разлагающиеся до свободного металла, NO₂ и кислорода:

Четвертую группу составляет нитрат аммония.

Азотистая кислота. HNО₂ принадлежит к слабым кислотам (К = 6?10^-4 при 25 °С), она лишь немного сильнее уксусной. Азотистая кислота неустойчива и известна только в разбавленных растворах, в которых осуществляется равновесие

Нитриты, в отличие от самой кислоты, устойчивы даже при нагревании. Исключением является кристаллический нитрит аммония, который при нагревании разлагается на свободный азот и воду:

Применение. Большие количества азотной кислоты расходуются на приготовление азотных удобрений, взрывчатых и лекарственных веществ, красителей пластмасс, искусственных волокон и др. материалов. Дымящая азотная кислота применяется в ракетной технике в качестве окислителя ракетного топлива.

При использовании экстрактивных АИС представительную пробу газа (далее - проба) отбирают в газоходе с помощью зонда для отбора проб и направляют через трубку для отбора и систему подготовки проб к газоанализатору.

Неэкстрактивные АИС не содержат устройств отбора и подготовки пробы за пределами газохода. Для установки этих АИС в газоходе выбирают представительное место. АИС, работающие "на месте", могут отбирать большую часть отходящего газа.

Результаты, полученные с помощью газоанализатора, регистрируют и(или) сохраняют в электронном блоке обработки данных.

Описанные в стандарте АИС в основном измеряют массовую концентрацию только NO. Если с помощью АИС необходимо определять содержание или суммарное содержание оксидов азота (NO +), следует использовать конвертер для превращения в NO. Конвертер может быть отдельным блоком или частью газоанализатора NO.

Существуют также АИС с принципом действия, основанным на УФ-методе, с помощью которых напрямую контролируют содержание. Их часто используют в сочетании с газоанализаторами для NO.

В большинстве случаев определяют только NO, так как содержание в отходящих газах незначительно. Если присутствует в больших количествах и его концентрацию следует учитывать, то применяют метод прямого измерения или измерения с использованием конвертера. В этом случае отбор проб будет затруднен из-за высокой реакционной способности .

1 - зонд для отбора пробы;

2 - фильтр для удаления твердых частиц;

3 - нагреватель; 4 - трубка отбора проб (при необходимости подогреваемая);

5 - охладитель пробы с сепаратором конденсата;

6 - насос для откачивания пробы;

7 - фильтр; 8 - вентиль тонкой регулировки;

9 - расходомер; 10 - газоанализатор NO;

11 - регистратор данных;

12 - ввод нулевого газа и калибровочного газа (предпочтительно помещать перед фильтром) для проверки и настройки всей системы;

13 - сброс избытка газа;

14 - ввод нулевого газа и калибровочного газа для проверки и настройки газоанализатора;

15 - конвертер;

16 - газоанализатор

Глава 2. Оксид азота как межклеточный посредник

NO-синтаза -- это сложно устроенный фермент, представляющий собой гомодимер, то есть он состоит из двух одинаковых белковых субъединиц, к каждой из которых присоединено несколько кофакторов, определяющих каталитические свойства фермента (рис. 1). Активность фермента проявляется только при объединении двух его субъединиц.

Одним из важных кофакторов является внутриклеточный кальцийсвязывающий белок кальмодулин. При повышении содержания ионов кальция в клетке он присоединяется к молекуле NO-синтазы, что приводит к активации фермента и синтезу NO (рис. 2). Такое свойство фермента имеет большое значение для клеток, поскольку ферментативная активность, а значит, и синтез NO прямо зависят от функционального состояния

Оксид азота (NO) -- газ, хорошо известный химикам и физикам, в последнее время привлек пристальное внимание биологов и медиков. Интенсивное изучение биологического влияния NO началось с 80-х годов, когда Р. Фуршготт и Дж. Завадски показали, что расширение кровеносных сосудов под влиянием ацетилхолина происходит только при наличии эндотелия -- эпителиопо-добных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность всех сосудов. Вещество, выделяющееся эндотелиальны-ми клетками в ответ не только на ацетилхолин, но и на многие другие внешние воздействия, приводящее к расширению сосудов, получило название "сосудорасширяющий эндотелиальный фактор". Несколько позже было доказано, что это вещество является газом NO и в клетках имеются особые ферментные системы, способные его синтезировать.

NO-синтаза - фермент, синтезирующий NO

Оксид азота образуется в результате окисления аминокислоты аргинина с одновременным синтезом другой аминокислоты цитруллина под влиянием фермента NO-синтазы. Фермент был назван синтазой, а не синтетазой, поскольку для его работы не требуется энергия АТФ.

NO-синтазы составляют семейство, то есть имеется группа ферментов, несколько различающихся по аминокислотной последовательности белковой части молекулы и механизмам, регулирующим их активность, но тем не менее катализирующих одну и ту же реакцию превращения аминокислот с образованием оксида азота. В настоящее время хорошо изучена структура разных изоформ NO-синтазы, известны механизмы, регулирующие их активность, и хромосомная локализация генов, ответственных за синтез ферментов, проведено клонирование (получение большого числа копий) этих генов, получены генетически модифицированные мыши без генов разных изоформ фермента (так называемые нокаут мыши).

Синтезировать и выделять NO способно большинство клеток организма человека и животных, однако наиболее изучены три клеточные популяции: эндотелий кровеносных сосудов, клетки нервной ткани (нейроны) и макрофаги -- клетки соединительной ткани, обладающие высокой фагоцитарной активностью. В связи с этим традиционно выделяют три основные изо-формы NO-синтаз: нейрональную, макрофагальную и эндотелиальную (обозначаются соответственно как NO-синтаза I, II и III). Нейрональная и эндотелиаль-ная изоформы фермента постоянно присутствуют в клетках и называются конститутивными, а вторая изо-форма (макрофагальная) является индуцибельной -- фермент синтезируется в ответ на определенное внешнее воздействие на клетку.

Активность конститутивных изоформ фермента прямо зависит от внутриклеточной концентрации ионов кальция или кальмодулина и, таким образом, повышается под влиянием различных агентов, приводящих к увеличению их уровня в клетке. Конститутивные изоформы NO-синтазы имеют преимущественно физиологическое значение, поскольку количество образуемого NO относительно невелико.

Индуцибельные изоформы NO-синтазы проявляют активность через некоторое время (как правило, 6--8 ч -- время, необходимое для активации генов и начала синтеза фермента) после внешнего воздействия на клетки, продуцируют огромные (в 100--1000 раз больше, чем конститутивные изоформы фермента) количества NO. Поскольку высокие дозы NO токсичны для клеток, эта форма фермента считается патологической в отличие от конститутивной. Активность индуцибельной NO-синтазы не зависит от уровня кальция/кальмодулина, поскольку, как полагают, кальмодулин постоянно и прочно связан с ферментом. В настоящее время показано, что не только макрофаги, но многие другие клетки способны при определенных внешних воздействиях, в основном в условиях патологии, синтезировать индуцибельную форму NO-синтазы. Нейрональная и макрофагальная формы фермента находятся в клетках преимущественно в растворенном состоянии -- в цито-золе, а эндотелиальная NO-синтаза обычно связана с клеточными мембранами.

???????? ???????? NO

Низкомолекулярный газ NO легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, однако время его полужизни (в среднем не более 5 с) и расстояние возможной диффузии (небольшое, в среднем 30 мкм) ограничиваются высокой реакционной способностью молекулы и ее взаимодействием со многими возможными субстратами. Среди последних следует отметить гемоглобин, к гемовой группе которого NO имеет очень высокое сродство.

Действие, оказываемое NO на клетки, во многом зависит от количества газа. В небольших количествах, продуцирующихся обычно конститутивными формами NO-синтазы, эффект NO в основном связан с влиянием на гемовую группу растворимой (цитозольной) формы гуанилатциклазы. Активированный фермент синтезирует циклический гуанозин монофосфат (цГМФ) -- активный внутриклеточный посредник, регулирующий работу мембранных ионных каналов, процессы фос-форилирования белков (через протеинкиназы), активность фосфодиэстеразы, а также другие реакции.

В больших концентрациях, образующихся, как правило, индуцибельной изоформой NO-синтазы, NO может оказывать на клетки токсический эффект, связанный как с прямым действием на железосодержащие ферменты, так и с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободнорадикального соединения пероксинитрита. Пероксинитрит (ONOO~) образуется при взаимодействии NO с радикальным супероксид анионом (O2):

Токсический эффект NO проявляется, прежде всего, в ингибировании митохондриальных ферментов, что приводит к снижению выработки АТФ, а также ферментов, участвующих в репликации ДНК. Кроме того, NO и пероксинитрит могут непосредственно повреждать ДНК, это приводит к активации защитных механизмов, в частности стимуляции фермента поли(АДФрибоза) синтетазы, что еще больше снижает уровень АТФ и может приводить к клеточной гибели. Повреждение ДНК под влиянием NO является одной из причин развития апоптоза, особого вида клеточной смерти, регулирующейся геномом клетки.

Следует отметить еще одно интересное наблюдение, связанное уже с нейронами, содержащими NO-синтазу, и не получившее пока полного объяснения. Еще в 60-х годах Е. Томас и Э. Пирс использовали новый гистохимический метод выявления активности фермента НАДФН-диафоразы (фермент, способный восстанавливать окисленную форму НАДФ) для анализа нервной системы и показали, что в разных отделах головного мозга имеются единичные нейроны с интенсивной положительной реакцией. Эти нейроны, которые получили название "одиночные активные клетки", остаются неповрежденными при разнообразной патологии нервной системы, в то время как большинство других клеток погибает. Относительно недавно выяснилось, что НАДФН-диафоразная активность свойственна NO-синтазе (НАДФН-диафоразная активность широко используется в настоящее время для гистохимической идентификации клеток, содержащих NO-синта-зу, хотя НАДФН-диафораза и NO-синтаза -- разные ферменты и их распределение в клетках мозга не всегда совпадает), и, таким образом, была установлена устойчивость нейронов, содержащих NO-синтазу, к разнообразным патологическим воздействия. Механизмы такого необычного и имеющего большое биологическое значение свойства клеток окончательно не выяснены.

Остается невыясненным и вопрос о том, почему большие дозы синтезированного газа не оказывают токсического влияния на клетки, в которых они образуются. Одним из возможных объяснений такого парадокса может быть то, что в нейронах, содержащих NO-синтазу, определяется высокая активность фермента супероксиддисмутазы, катализирующей распад токсических радикалов и защищающей, таким образом, клетку от их губительного действия.

Участие NO в защитных иммунологических реакциях

Участие нитропроизводных (производных нитритов (NO2) и нитратов (NO3)) во многих патологических процессах, в том числе и опухолевом росте, было известно давно. Первоначально разрозненные и часто необъяснимые данные о связи противомикробного и противоопухолевого действия макрофагов и нитропроизводных прояснились после открытия синтеза NO в эндотелиальных клетках. Действие макрофагов на чужеродные агенты также стали связывать с NO, и многочисленные эксперименты подтвердили, что макрофаги способны синтезировать NO-синтазу и выделять большое количество газа. Уже отмечалось, что NO-синтаза макрофагов является индуцибельным ферментом. В нормальных условиях клетки не содержат этот фермент и не продуцируют NO. Под влиянием липополисахари-дов микробного происхождения или цитокинов -- высокоактивных межклеточных посредников, выделяющихся, в частности, лимфоцитами при их контакте с чужеродными агентами, в макрофагах начинается синтез индуцибельной изоформы NO-синтазы, образующей большой объем NO, оказывающего, в свою очередь, цитостатическое и цитолитическое действие на бактериальные и чужеродные, в том числе и раковые, клетки.

Нейтрофилы также способны экспрессировать индуцибельную форму NO-синтазы и синтезировать NO, однако данные о цитотоксическом действии этих клеток, связанном с NO, неизвестны, и значение такой способности нейтрофилов остается невыясненным. Известно, что нейтрофилы и макрофаги способны активно образовывать свободные радикалы кислорода (это имеет огромное значение в их защитном противомикробном действии), возможно, образование пероксинитрита в реакции NO со свободными радикалами может усиливать антимикробный эффект этих клеток.

Следует также отметить, что клетки многих, если не большинства, тканей и органов способны экспрессировать под влиянием тех же иммунологических факторов (микробные липополисахариды, цитокины) ин-дуцибельный фермент в условиях патологии, что может иметь значение в защитных механизмах от чужеродных агентов. Интересно, что глюкокортикоиды (гидрокортизон, кортизол), известные своей противовоспалительной активностью, ингибируют экспрессию NO-синтазы в клетках.

NO и кровеносные сосуды

Значение NO в кровообращении многогранно. Прежде всего, NO -- мощный сосудорасширяющий агент. Эндотелий постоянно продуцирует небольшие количества NO (так называемый базовый фон), а при различных воздействиях -- механических (например, при усилении тока или пульсации крови), химических, бактериальных и вирусных (опосредуемых микробными липопо-лисахаридами и различными цитокинами, выделяющимися из лимфоцитов и кровяных пластинок) -- синтез NO в эндотелиальных клетках значительно повышается.

Расширение сосудов связано с диффузией NO из эндотелия к соседним гладкомышечным клеткам стенки сосуда, активацией в них гуанилатциклазы и образованием цГМФ. Повышение уровня цГМФ приводит к снижению уровня ионов кальция в цитозоле клеток и ослаблению связи между миозином и актином, что и позволяет клеткам расслабляться, то есть принять первоначальную форму и размеры. Следует напомнить, что расслабление мышечных клеток обусловлено не внутриклеточными процессами, а связано с внешними по отношению к клеткам механическим факторам, в частности для гладких мышц сосудов это упругость эластических волокон, окружающих и оплетающих гладкомышечные клетки и растягивающих клетки после прекращения процесса сокращения и устранения связи между миозином и актином.

Действует NO очень быстро -- образование цГМФ происходит через 5 с, а начало расслабления гладких мышц -- через 10 с после добавления NO в культуру изолированных кровеносных сосудов. Открытие сосудорасширяющего действия NO позволило прояснить механизм действия самого распространенного и эффективного лекарственного средства, применяемого для лечения спазма коронарных артерий -- нитроглицерина. При расщеплении препарата образуется NO, приводящий к расширению сосудов сердца и снимающий в результате этого чувство боли.

Большое значение NO имеет в регуляции мозгового кровообращения. Известные более ста лет данные об усилении кровотока в активно работающих областях мозга получили после открытия сосудорасширяющего действия NO более полную интерпретацию. Имеется несколько источников NO для регуляции просвета мозговых сосудов. Это эндотелий сосудов, нейроны, содержащие NO-синтазу и оплетающие своими отростками стенки сосудов и астроциты, образующие пери-васкулярные оболочки (рис. 3). Активация нейронов какой-либо области мозга приводит к возбуждению нейронов, содержащих NO-синтазу, и/или астроцитов, в которых также может индуцироваться синтез NO, и выделяющийся из клеток газ приводит к локальному расширению сосудов в области возбуждения.

С NO связывают и развитие септического шока, когда большое количество микробов, циркулирующих в крови, резко активирует синтез газа в эндотелии, что приводит к длительному и сильному расширению мелких кровеносных сосудов и как следствие -- значительному снижению артериального давления, с трудом поддающемуся терапевтическому воздействию.

NO, образующийся в эндотелии, оказывает влияние и на взаимодействие клеток крови с эндотелием. Газ препятствует прилипанию лейкоцитов и кровяных пластинок к эндотелию и также снижает агрегацию последних. Такое действие NO может иметь большое значение на ранних стадиях развития тромбов и в генезе атеросклеротических повреждений стенки сосудов. Участие NO в развитии атеросклероза может заключаться и еще в одной стороне его действия. NO может выступать в роли антиростового фактора, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток стенки сосудов, важного звена в патогенезе болезни.

NO и нервная система

В нервной системе NO имеет большое значение как в нормальных физиологических условиях, так и при различной патологии. Источниками NO в центральной нервной системе (ЦНС) являются нейроны, нейрогли-альные клетки -- астроциты и клетки микроглии (достоверные данные о наличие NO-синтазы в других нейрог-лиальных клетках -- олигодендроцитах и эпендимных отсутствуют) и эндотелий кровеносных сосудов.

Нейроны, содержащие NO-синтазу, находятся во многих отделах ЦНС и большинстве изученных периферических ганглиев нервной системы. В коре больших полушарий в среднем 2% процента нейронов содержат NO-синтазу, в большинстве других отделов головного мозга число таких нейронов также невелико. Однако имеются и области с высоким их содержанием. Так, максимальное количество нейронов, содержащих NO-синтазу, находится в коре мозжечка, где большинство клеток-зерен и корзинчатых нейронов содержат фермент. Самые крупные нейроны коры мозжечка -- клетки Пуркинье не содержат NO-синтазу. Сравнительно много нейронов, содержащих NO-синтазу, находится в обонятельных луковицах, а также в некоторых отделах гиппокампа и полосатого тела. Только, по-видимому, в мозжечке нейроны, содержащие NO-синтазу, составляют компактную популяцию клеток, в остальных отделах это одиночные, редко расположенные нейроны.

Обобщая имеющие данные о нейронах ЦНС, содержащих NO-синтазу, следует отметить, что преимущественная часть их относится к небольшим по размерам клеткам, многие из которых не содержат дендритных шипиков и являются ассоциативными нейронами. Крупные клетки, например пирамидные нейроны коры больших полушарий или гиппокампа (исключением можно считать отдельные пирамидные нейроны поля CA1 гиппокампа), моторные нейроны передних рогов спинного мозга, не содержат NO-синтазу. NO-синтаза сосуществует в нервных клетках с другими традиционными нейромедиаторами и нейропептидами, чаще фермент определяется в холинергических нейронах.

Большое внимание уделяется NO в реализации нервных воздействий на ткани внутренних органов. Нервы, содержащие NO-синтазу, показаны практически во всех изученных внутренних органах преимущественно в стенке кровеносных сосудов, где они наряду с эндотелием могут оказывать сосудорасширяющий эффект. NO признается одним из основных эффекторных агентов в так называемых неадренергических -- нехоли-нергических нервах. В периферических нервах подробно изучено сосуществование NO-синтазы с нейропеп-тидами. Наиболее часто фермент определяется вместе с вазоактивным кишечным нейропептидом (VIP) и ней-ропептидом Y.

Значение NO в ЦНС в нормальных условиях связывают с тремя процессами (так называемая NO-гипотеза): 1) участие в межнейронной связи в качестве своеобразного нейромедиатора, причем основное значение, как полагают, NO имеет в синаптической пластичности, под которой понимают эффективность синаптической передачи, 2) регуляция церебрального кровотока

NO как нейромедиатор

Нейромедиаторная сущность NO заключается в том, что он синтезируется при возбуждении нейрона (в ответ на поступление ионов кальция) и, диффундируя в соседние клетки, активизирует в них образование цГМФ, способного влиять на проводимость ионных каналов и, таким образом, изменять электрогенез нейронов. NO отличается от традиционных нейромедиаторов тем, что он оказывает воздействие на ионные каналы не через плазмалеммальные рецепторы, а изнутри, со стороны цитоплазмы. Кроме того, действие NO не ограничивается только областью синаптических контактов, газ может влиять на ионные каналы на значительной площади плазматической мембраны нейрона.

Участие NO в синаптической пластичности наиболее ярко проявляется в таких процессах, как длительная синаптическая потенциация (повышение эффективности проведения возбуждения через синапс для каждого последующего импульса в их последовательности), более детально проанализированная в гиппокампе, и длительная синаптическая депрессия (снижение эффективности проведения возбуждения через синапс), лучше исследованная в коре мозжечка.

В первом случае возбуждение постсинаптического окончания приводит к повышению внутриклеточного уровня Са²⁺/кальмодулина, активирующих NO-синта-зу и образование NO. NO, диффундируя в пресинаптическое окончание, вызывает образование цГМФ, что приводит к усилению и увеличению длительности выделения из пресинапса нейромедиатора, который, в свою очередь, оказывает возбуждающее действие на постсинаптический нейрон и таким образом возникает обратная положительная связь с постоянным усилением. Такому механизму особое внимание уделяется в синапсах с наиболее распространенным и сильным возбуждающим нейромедиатором ЦНС глутаматом и особому глутаматному рецептору -- NMDA-рецептору, являющемуся трансмембранным каналом для ионов кальция.

С длительной синаптической потенциацией, прежде всего в гиппокампе, связывают пластичность межнейронных связей, лежащих в основе памяти. Такое предположение основывается на ставших уже классическими представлениях Д. Хэбба (1949 год) о повышении эффективности синаптической передачи при возбужденном состоянии постсинаптического нейрона. Физиологические наблюдения об участии NO в процессах памяти и обучения противоречивы. Наряду с работами, в которых показано нарушение процессов обучения у экспериментальных животных при введении ингибиторов NO-синтазы, имеются и исследования с противоположными результатами. Неоднозначность получаемых результатов, возможно, связана с тем, что вводимые в организм ингибиторы NO-синтазы оказывали действие не только на всю нервную систему, но и на все органы и ткани животных, что не позволяло достичь локального влияния на продукцию NO в мозге.

Интересно, что нахождение животных (крыс) в обогащенной внешней среде (лабиринт, новая обстановка) приводит к увеличению числа нейронов, содержащих NO-синтазу во многих отделах головного мозга, причем предварительное введение ингибиторов NO-синтазы и NMDA-рецепторов приводило как с снижению активности NO-синтазы в нейронах, так и к нарушению процессов обучения.

В переживающих (живущих некоторое время в условиях культуры тканей) срезах головного мозга был показан и другой механизм действия NO на пресинаптические окончания. NO способен инициировать выделение нейромедиатора дофамина из нейронов не посредством экзоцитоза (обычный способ выделения нейромедиаторов с участием синаптических пузырьков), а путем трансмембранной диффузии при участии особого мембранного переносчика дофамина, участвующего в его захвате из межклеточной среды. В этом процессе не участвует цГМФ и предполагается прямое влияние NO на транспортные белки мембран.

Длительную синоптическую депрессию, в частности в контактах между параллельными волокнами, являющимися аксонами самых маленьких нейронов в организме человека, так называемых клеток-зерен, и нейронами Пуркинье в коре мозжечке связывают с десенсибилизацией другого класса глутаматных рецепторов, так называемых AMPA-рецепторов. Выделяющийся из аксонов корзинчатых нейронов (особый тип нейронов коры мозжечка) NO диффундирует к нейронам Пуркинье и активирует в них синтез цГМФ, что приводит к инактивации AMPA-рецепторов и снижению эффективности работы синапсов между клетками зернами и нейронами Пуркинье.

В основе первого положения NO-гипотезы лежит возможность образования NO в постсинаптическом окончании при его возбуждении и влияние газа на пресинаптический аксон. Однако за счет диффузии к соседним нервным клеткам NO может оказывать влияние не только на пресинаптическое расширение аксона, формирующего синапс на этом постсинаптическом окончании, но и на близлежащие аксоны и дендриты, модулируя их активность.

Традиционная формулировка положения об участии NO в межнейронной коммуникации ограничивается обычно возможностью синтеза и выделения NO из локальной области нейрона -- постсинаптического окончания. Однако, как показывают результаты свето- и электронно-микроскопических исследований, NO-синтаза определяется во всем объеме тела нейронов -- в перикарионе, аксоне и дендритах. Поскольку при возбуждении нейрона по всей длине его отростков и в теле уровень кальция циклически колеблется (образуются своеобразные кальциевые волны), можно считать, что синтез и выделение NO могут инициироваться в любом участке тела и отростков нейронов. Таким образом, нейроны, содержащие NO-синтазу, способны создавать вокруг себя поле воздействия, то есть могут считаться своеобразными полевыми нейронами в отличие от традиционных нейронов, связанных друг с другом в локальных участках -- синапсах.

Основное внимание в процессах синаптической пластичности уделяется, конечно, нейронам, однако нельзя не учитывать и роль глии. Известно, что астроциты способны продуцировать NO, причем они обладают как конститутивной (в небольшом количестве), так и индуцибельной NO-синтазой. Если принять во внимание, что число астроцитов в 10--100 раз превосходит (в зависимости от области мозга) количество нейронов, то их роль в продукции NO и влиянии на механизмы электрогенеза нейронов может является весьма значимой.

Значение астроцитов как источника NO особенно ярко проявляется при патологии ЦНС. При многих нейродегенеративных заболеваниях, ишемии, травмах, опухолях головного мозга астроциты начинают экспрессировать NO-синтазу и продуцировать большой объем NO. С этим связывают гибель нейронов и других макроглиальных клеток, в частности одигодендроцитов.

Глава 3. Роль оксида азота (NO) в механизме действия средств для наркоза

азот химический фермент индуцибельный

Выявление физиологической роли оксида азота явилось одним из наиболее важных открытий в биологии и медицине конца XX века. В 1986 г. оксид азота идентифицирован как эндотелиальный вазорелаксирующий фактор, позже выявили, что он является нейротрансмиттером, иммуномодулятором, а также выполняет другие важные функции. В 1992 г. оксид азота был объявлен "молекулой года", а в 1998 г. автором открытия была присуждена Нобелевская премия. Синтез оксида азота катализируется группой металлоферментов -- синтез оксида азота, или NО-синтаз (NOS). Единственным субстратом для этих ферментов является аминокислота аргинин. NO-синтазы окисляют аминогруппу в гуанидиновом остатке этой аминокислоты, в результате чего высвобождается оксид азота, а аргинин превращается в цитруллин. Выделены 3 изоформы NO-синтаз: эндотелиальная (eNOS), нейрональная (nNOS), индуцибельная (iNOS). Соответствующие гены картированы в геноме человека на 7, 12 и 17-й хромосомах. eNOS и nNOS -- конститутивные ферменты, которые всегда присутствуют в тканях, хотя и в неактивной форме. Активизируясь, ферменты связывают ионы кальция и кальмодулин, осуществляя таким образом регуляцию многочисленных клеточных процессов. iNOS в норме не экспрессируется в клетках, ее синтез запускается в ответ на различные токсические и опосредующие процесс воспаления соединения -- токсины, цитокины, активные формы кислорода. Как правило, NO-синтазами в тканях поддерживается постоянный уровень NO. Оксид азота может непосредственно влиять на активность многих ферментов. Однако более специфичным является действие, опосредованное вторичными передатчиками сигналов (мессенджерами). Кроме уже упоминавшихся ионов кальция и кольмодулина, NO активизирует G-белки и гуанилатциклазу, способствуя синтезу циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). В этом плане механизм действия NO близок механизму действия некоторых гормонов и нейротрансмиттеров. Механизм действия многих фармакологических препаратов также связан с высвобождением NO или активизацией NOсинтаз, так действует и давно известный нитроглицерин и недавно нашумевший препарат "Виагра". В ЦНС NO задействован в исполнении нескольких функций. Недавно было обнаружено, что NO является нейротрансмиттером. Предполагается, что при ишемическом повреждении головного мозга NO может одновременно оказывать благоприятное и вредное воздействие: с одной стороны, оксид азота оказывает защитное действие на ткань головного мозга, с другой стороны, реагируя с ионами перекисей, NO образует вредный анион пероксинитрит. Heyдивительно, что возможная роль образования NO в механизме действия средств для наркоза является предметом многочисленных исследований. Знание роли оксида азота в механизме развития наркоза важно не только для понимания механизма действия средств для наркоза, но и для предотвращения eго нежелательных побочных эффектов. В предлагаемом обзоре мы рассмотрим данные литературы по влиянию средств для наркоза на синтез NO и активность синтазы оксида азота, а также обсудим полученные другими авторами данные в сравнении с недавно полученными нами результатами по прямому определению NO в головном мозге крыс при наркозе.

Литература

1. Албертс А., Брей Д., Льюис Р. и др. Молекулярная биология клетки: В 3 т.: Пер. с англ. 2-е изд. М.: Мир, 1994.

Зеленин К.Н. Оксид азота (II): Новые возможности давно известной молекулы // Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 10. С. 105--110.

Реутов В.П. Цикл окиси азота в организме млекопитающих // Успехи биол. химии. 1995. Т. 35. С. 189--228.

Garthwaite J. Neural Nitric Oxide Signalling // Trends Neurosci. 1995. Vol. 18. P. 51--56.

Moncada S., PalmerR..M.J., HiggsE.A. Nitric Oxide: Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology // Pharmacol. Rev. 1991. Vol. 43. P. 109--141.

Размещено на Allbest.ru