Размещено на http://www.allbest.ru/

Глава 1. Нелинейная флуориметрия сложных органических соединений

Сложные органические соединения играют большую роль в природе, широко используются в самых различных технологиях. Поэтому разработка методов и средств их обнаружения, измерения концентрации и определения состояния (то есть методов диагностики) была и остается актуальной научной и технической проблемой. Особый интерес представляют сложные органические соединения, которые входят в состав природных сред и живых организмов или которые попадают в эти объекты, а иногда специально вводятся в них с теми или иными целями.

Очевидно, что наиболее ценными являются такие методы и средства, которые обеспечивают диагностику без разрушения объекта (то есть in vivo), непосредственно в среде обитания сложного органического соединения (то есть in situ), с высокой чувствительностью, экспрессно, а в ряде случаев (например, в системах экологического мониторинга) дистанционно.

Природа преподнесла нам подарок: многие органические соединения обладают способностью флуоресцировать при оптическом возбуждении с квантовым выходом, достаточным для решения диагностических задач. Все они обладают полосами флуоресценции, положение, форма и интенсивность которых могут быть использованы для диагностики указанных соединений.

Флуориметрия как метод спектрального анализа и диагностики сложных органических соединений обладает достоинствами, делающими ее чрезвычайно привлекательной [1]. Во-первых, полоса флуоресценции смещена (и иногда весьма значительно) в длинноволновую область спектра относительно полосы поглощения, что позволяет при регистрации флуоресценции отстраиваться от фона, создаваемого упругим рассеянием фотонов на неоднородностях среды (рассеянием Рэлея и Ми), и эффективно подавлять этот фон. Во-вторых, сечение флуоресценции для хорошо флуоресцирующих соединений настолько велико, что позволяет регистрировать флуоресценцию сред с чрезвычайно низкой концентрацией флуоресцирующих молекул. Флуориметрия - один из самых чувствительных методов оптической спектроскопии.

Замена обычных источников возбуждающего излучения на лазеры значительно улучшает характеристики флуоресцентного анализа в классическом варианте (в частности, еще больше поднимает чувствительность). Но главная, принципиально новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции - нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия [2], которой посвящена данная статья. Но прежде чем перейти к изложению физических основ этого нового метода спектроскопии, посмотрим, так ли велика необходимость в этом методе. А для этого укажем на трудности (и подчас весьма серьезные), с которыми сталкивается классическая (линейная) флуориметрия. Для разных объектов в различных задачах диагностики эти трудности проявляются по-разному. Для определенности рассмотрим, какие препятствия возникают на пути решения задач диагностики природных органических комплексов (ПОК) в водных средах.

Первое препятствие - большая ширина полос флуоресценции ПОК и перекрытие полос разных ПОК, одновременно присутствующих в природных водах. Определяющий вклад в спектр флуоресценции этих сред дают четыре класса ПОК: фотосинтезирующие организмы - фитопланктон, водное гумусовое вещество, аминокислоты в свободном состоянии или в составе белковых соединений, нефти в виде пленки на поверхности, эмульсии и в растворенной форме в объеме воды. На рис.1 показан фрагмент спектра оптического отклика природной воды при ее возбуждении излучением с длиной волны X_exc = 266 нм (это длина волны 4-й гармоники излучения лазера на кристалле иттрий-алюминиевого граната, легированного ионами неодима - ИАГ: Кс1-лазера). Обратим внимание на то, что в спектре помимо полос флуоресценции ПОК присутствует полоса комбинационного (рамановского) рассеяния света молекулами воды. Это очень важный компонент спектра, который широко используется для диагностики водных сред. В частности, он может выступать в качестве внутреннего репера, на который нормируется интенсивность флуоресценции ПОК.

Второе препятствие - идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса ПОК, поскольку, как правило, флуоресцирующие цент - хлорофилл а в водорослях, составляющих фитопланктон.

Третье препятствие. Изменение состояния ПОК, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации ПОК по интенсивности флуоресценции и не дает возможности проводить диагностику состояния ПОК (например, фотосинтетической активности водорослей).

Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики ПОК невозможно в рамках только феноменологического подхода, то есть оперируя лишь спектрами излучения и возбуждения флуоресценции, хотя, конечно, эти спектры дают большой объем информации. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. При этом указанные параметры необходимо измерять in vivo и in situ, причем в условиях дефицита информации о локальных концентрациях молекул в ПОК.

В настоящее время единственный способ измерения указанных параметров - нелинейная флуориметрия (флуориметрия насыщения). Важно подчеркнуть, что на этом пути решаются не только прикладные задачи диагностики ПОК, но и фундаментальные проблемы: установление механизмов

При достаточно больших значениях интенсивности (плотности потока фотонов) возбуждающего излучения F зависимость регистрируемого числа фотонов флуоресценции N_a (F) отклоняется от линейной - насыщается (рис.2). Причин для такого насыщения флуоресценции может быть несколько. Наиболее физически понятная состоит в следующем. Если плотность потока фотонов F столь велика, что среднее время между их попаданиями в площадку, численно равную сечению поглощения молекулы o_abs, меньше времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, то молекула не успевает вернуться в основное состояние к моменту попадания в нее следующего фотона и этот фотон пролетает мимо молекулы - мы (при величине квантового выхода флуоресценции л = 1) лишаемся одного фотона флуоресценции (если слой среды оптически тонкий, то есть о _abs ln₀ < 1, где l - толщина слоя, n₀ - концентрация молекул). Это явление обеднения основного состояния приводит к просветлению слоя среды и нелинейной зависимости N_a (F) - к насыщению флуоресценции. Есть и другие механизмы насыщения флуоресценции, на Очевидно, что параметры кривой насыщения N_fl (F) определяются фотофизическими характеристиками молекулы и, следовательно, эти характеристики могут быть определены по параметрам кривой насыщения. Решение такой обратной задачи и составляет существо нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) как метода спектрального анализа любых флуоресцирующих атомов и молекул. Особенно актуален этот метод применительно к сложным органическим соединениям и комплексам.

Какой бы алгоритм решения обратной задачи ни использовался, мы должны располагать теоретической (расчетной) кривой насыщения флуоресценции, которая может быть получена путем решения системы кинетических (скоростных) уравнений для населенностей энергетических состояний флуоресцирующих молекул.

Узловым моментом этой процедуры является рациональный выбор физической модели, описывающей взаимодействие оптического излучения с ансамблем флуоресцирующих органических молекул или комплексов. В математической формулировке это определяет число параметров, подлежащих определению при решении обратной задачи.

Для сложных органических молекул в случае, когда можно пренебречь взаимодействием между ними, приоритетными параметрами, влияющими на кривую насыщения, являются (рис.3 [1]): а) сечение поглощения о _abs = о ₁₃, определяющее вероятность перехода молекулы из основного синглетного состояния S₀ (c уровня 1) в первое возбужденное синглетное состояние S₁ (уровень 3) под действием потока фотонов с плотностью F (см"² с"¹); б) время жизни х ₃ молекулы в состоянии S₁, то есть на уровне 3; в) квантовый выход молекул в нижнее триплетное состояние T₁ (на уровень 2) в результате перехода S₁ - T₁, называемого интеркомбинационной конверсией: л_T = k3₂/k₃, где k₃ = k₃₁ + k'₃₁ + k3₂; k₃₁ и k3₁ - скорости излучательных и безызлучательных переходов из S₁ в S₀; k3₂ - скорость перехода S₁ - > T₁.

Параметр kj (его размерность с"¹) характеризует вероятность перехода с уровня на уровень j таким образом, что если n - концентрация молекул в исходном состоянии то k_ip_i - число молекул (в единице объема), перешедших за 1 секунду из состояния в состояние j. В рассматриваемой модели имеются три канала дезактивации уровня S₁, которые характеризуются параметрами k₃₁, k3₁ и k3₂. Поэтому полное число молекул (в единице объема), покидающих уровень S₁ в 1 секунду, равно k₃n₃ и, следовательно, х₃ = k^-1 - время жизни этого уровня.

Число фотонов флуоресценции, испущенных элементом объема dV= dxdydz в интервале времени от t до t + dt,

нелинейная флуориметрия органическое соединение

Глава 2. Обратные задачи флуориметрии насыщения

Зная характеристики кривой насыщения, можно в принципе определить фотофизические параметры молекулы или комплекса. Задачи такого рода называются обратными. В общем случае они являются некорректными [3]. Однако, используя априорную информацию о фотофизических процессах, формирующих флуоресценцию сложных органических соединений и комплексов, можно ограничить число параметров модели и пределы их изменения так, чтобы задача стала корректной по А.Н. Тихонову [3], то есть удовлетворяла трем условиям: решение существует, решение единственно и устойчиво. В нашей задаче устойчивость гарантирована ограниченностью числа восстанавливаемых параметров: в рассмотренных к настоящему времени обратных задачах нелинейной флуориметрии число определяемых параметров варьировали от одного до трех и в будущем оно едва ли превысит пять. Что касается единственности решения, то она доказана для трехпараметрической модели, описываемой системой кинетических уравнений с определяемыми параметрами о ₁₃, х₃, л_T = k'₃₂/k₃. Таким образом, эта обратная задача является корректной по А.Н. Тихонову. Есть все основания полагать, что добавление четвертого параметра - константы скорости синглет-синглетной аннигиляции g не приведет к утрате этого свойства, хотя здесь требуется отдельное доказательство.

Теоретически устойчивая обратная задача может стать неустойчивой на практике. Причинами практической неустойчивости являются погрешности (шумы) входных данных и отклонение реальных процессов от модели, по которой рассчитывают теоретические зависимости (в нашем случае кривые насыщения). Практическая неустойчивость возникает, когда шумы входных данных или отклонение процессов от модели превышают некоторые допустимые величины. Пороги возникновения практической неустойчивости зависят как от характера фотофизических процессов в объекте, так и от свойств алгоритма решения обратной задачи. В общем случае кривые насыщения флуоресценции - исключительно неблагоприятный класс входных данных для обратных задач. Как видно из рис.2, 4, 5, это монотонные кривые без каких-либо резких элементов, за которые можно было бы "зацепиться". Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при весьма низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Однако это имеет место при использовании наиболее распространенного метода решения обратных задач - метода наименьших квадратов (МНК) [3, 4]. В его основе лежит процедура минимизации функционала невязки между экспериментальными и теоретическими данными путем вариации искомых параметров в ограниченном объеме их возможных значений. Если экспериментальная кривая неидеальна (снята с большими погрешностями или не соответствует теоретической модели), одного интегрального параметра (невязки) оказывается недостаточно, чтобы найти наилучшую аппроксимирующую кривую, рассчитанную для значений параметров модели в допустимой (из физических соображений) области их значений.

Некоторое время ситуация казалась тупиковой, и метод нелинейной флуориметрии мог умереть, не успев родиться. На помощь пришла современная компьютерная техника искусственных нейронных сетей (ИНС) [5]. Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор:

y = т (2_, ^wi^xt),

где y - значение выходной величины, T - передаточная функция (обычно нелинейная), x_i - значения входных величин, w_{: -} веса связей. ИНС состоит из нескольких слоев нейронов. Входной слой имеет количество нейронов, равное количеству элементов в наборе входных данных, в нашем случае количеству точек на кривой насыщения. Выходной слой должен иметь число нейронов, совпадающее с числом определяемых параметров. На первом этапе работы сети происходит ее обучение на известных данных с целью получения наилучшей матрицы весов w. Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных.

Применительно к нашей обратной задаче принципиальное отличие техники ИНС от традиционного метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Набор этих признаков формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Как показали модельные расчеты (численные компьютерные эксперименты) [2], алгоритмы решения обратных задач, основанные на технике ИНС, уже сейчас обеспечивают вполне приемлемую практическую устойчивость решения, а ведь возможности ИНС в этой области далеко не исчерпаны.

В табл.1 приведены результаты определения параметров о * и yn₀ для некоторых природных органических комплексов (g - константа скорости синглет-синг-летной аннигиляции, n₀ - локальная концентрация флуоресцирующих молекул, поэтому yn₀ - максимальное значение скорости этого процесса) по экспериментальным кривым насыщения с использованием метода ИНС. По порядку величины полученные значения параметров о * и yn₀ соответствуют ожидаемым.

Измерение величин о *, yn₀ и других фотофизических параметров ПОК in vivo и in situ позволяет продвинуться в решении разнообразных задач, связанных с этими объектами природы, в частности использовать указанные параметры для более тонкого качественного анализа, чем это позволяют сделать только спектры флуоресценции. Данные, приведенные в табл.1, подтверждают сказанное.

Глава 3. Аппаратурное оформление

Фильтровый флуориметр "ФЛЮОРАТ®-02-2М"

Фильтровый флуориметр "ФЛЮОРАТ®-02-2М" используется при выполнении рутинных измерений объектов, для которых предварительно установлены спектральные характеристики люминесценции.

Селекция световых потоков осуществляется специально подобранными светофильтрами. В качестве источника света используется импульсная ксеноновая лампа высокого давления, обеспечивающая достаточные световые потоки во всем спектральном диапазоне оптических методов - от жесткого ультрафиолета до красной границы видимого света.

Основной режим работы анализатора - флуориметр. Прибор может также работать как фотометр или хемилюминометр. В кюветное отделение можно устанавливать кюветы 10х10 мм для флуориметрии и 10х20, 10х40 мм для фотометрии.

Анализатор работает от сети переменного тока или от батареи 12 В. Это позволяет использовать его в составе передвижных лабораторий. На приборе реализован метод абсорбционной фотометрии. Прибор может применяться в качестве внешнего флуориметрического детектора систем ВЭЖХ.

В основу работы прибора положен фотометрический, флуориметрический и хемилюминесцентный методы измерения массовой концентрации органических и неорганических веществ в области спектра 250-650 нм.

В пользовательское меню анализатора вносятся названия выполняемых методик, способ обработки результата и калибровочные коэффициенты. Содержание меню и введенные калибровки сохраняются в энергонезависимой памяти прибора. Во время работы оператор выбирает из меню необходимую методику, и, установив после измерения фонового сигнала кювету с пробой, запускает процесс измерения. Концентрация определяемого компонента отображается на встроенном дисплее. Оператор может вывести результат анализа на внешний компьютер и управлять прибором от внешнего компьютера.

Анализатор "Флюорат-02-2M" комплектуется наборами для анализа интересующих пользователя компонентов. В набор входят текст методики и свидетельство об аттестации, кювета, светофильтры, стандартный образец, специфические реагенты (если используются). Поскольку расход реактивов при анализе на приборе чрезвычайно низок, реагентов, как правило, достаточно для нескольких лет интенсивной работы.

Особенности:

· низкие пределы определения;

· высокая селективность;

· широкая номенклатура определяемых показателей;

· сокращение времени анализа и расхода реактивов;

· сохранение градуировок в энергонезависимой памяти;

· многофункциональность (работает как флуориметр, хемилюминометр, прибор для измерения фосфоресценции, фотометр, нефелометр; с приставками (модель 2М) реализует криолюминесцентный анализ, также работает как флуориметрический детектор для ВЭЖХ-системы).

Технические характеристики:

Области применения:

1. Экологические исследования:

· экспресс-анализ воды водоемов и водотоков на содержание загрязнителей;

· скрининговые обследования акваторий, имеющих риск загрязнения нефтепродуктами;

· мониторинговые исследования содержания вредных веществ в водоемах;

· контроль загрязненности почв и грунтов нефтепродуктами и тяжелыми металлами.

2. Санитарные исследования:

· контроль содержания токсичных веществ и соединений в питьевых и сточных водах;

· контроль загрязнения воздушной среды аэрозолями и летучими веществами (после перевода проб в жидкую фазу).

3. Геология:

· исследования гидрогеологических процессов методом "флуоресцирующей метки".

4. Технология:

· контроль содержания остаточных количеств нефтепродуктов в жидком кислороде;

· контроль чистоты технологических растворов.

5. Медицина:

· рутинные анализы биологических сред.

6. Пищевая промышленность:

контроль пищевых продуктов на содержание витаминов В1, В2, С.

Анализатор ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т - универсальный полуавтоматический анализатор для определения широкого круга биохимических показателей с помощью трех встроенных режимов измерений: фотометрического, флуоресцентного и хемилюминесцентного.

Режим работы фотометра

В этом режиме прибор выполняет стандартные фотометрические методики определения: общий белок, альбумин, общий и прямой билирубин, холестерин, триглицеридов, мочевина, АлТ, АсТ, ЛДГ, a-амилазы, 17-КС, 17-ОКС, кислая и щелочная фосфатаза, электролиты, макроэлементы и т.п.

Измерения можно проводить как в наливной кварцевой кювете К10, так и с помощью проточной кюветы, используя следующие методики:

· фотометрия: конечная точка, кинетика, двухволновая, фиксированное время, нелинейная калибровка;

· фотометрия по конечной точке со стандартом и холостой пробой по реагенту;

· фотометрия по конечной точке, по коэффициенту пересчета (фактору) и холостой пробой по реагенту;

· фотометрия по конечной точке со стандартом и холостой пробой по образцу;

· фотометрия по конечной точке, по коэффициенту пересчета (фактору) и холостой пробой по образцу;

· фотометрия, кривая калибровки по стандартам (до семи) с холостой пробой по реагенту;

· фотометрия. Кинетика (две точки) со стандартом;

· фотометрия. Кинетика (две точки) со стандартом и холостой пробой по реагенту;

· фотометрия. Кинетика. Фактор;

· оптическая плотность;

· бихроматика. Конечная точка по стандарту с холостой пробой по реагенту.

Режим работы флуориметра

В этом режиме прибор выполняет унифицированные флюориметрические методики для определения: адреналина, норадреналина, гистамина, серотонина, 11-ОКС, витаминов А, Е, В1, В2, В6, порфиринов и т.п. Измерения проводят только в наливной кювете. Используются следующие методики:

· флуоресценция по конечной точке по стандартам (максимально 7 стандартов) и холостой пробой по реагенту;

· флуоресценция по конечной точке, по коэффициенту пересчета (фактору) и холостой пробой по реагенту;

· флуоресценция по конечной точке со стандартом и холостой пробой по образцу;

Режим работы хемилюминометра

Анализатор обладает чувствительностью канала измерения хемилюминесценции 10000 фотонов за секунду и имеет две встроенные методики измерения хемилюминесценции для медицинских применений:

· Хемилюминесценция. Стандарты (максимально 7 стандартов) с холостой пробой по реагенту. Данная программа измерения хемилюминесценции дает возможность измерять светосумму хемилюминесцентной реакции за заданное пользователем время интегрирования (максимально 100 секунд). Алгоритм измерения хемилюминесценции представляет собой следующий процесс: сначала проводится измерение раствора без добавления инициирующего хемилюминесцентную реакцию реагента (измерение фона), а затем, введение в кювету, находящуюся в приборе, с помощью шприца инициирующего свечение реагента через светонепроницаемую крышку, и измерение светосуммы хемилюминесцентной реакции. На экран анализатора выводится значение измеренной светосуммы.

· Хемилюминесценция. Кинетика, которая позволяет вычислять светосумму (максимально 3600 секунд), зарегистрировать и просмотреть на дисплее анализатора кинетику хемилюминесцентной реакции (зависимость интенсивности от времени), автоматически определяет величину максимума интенсивности хемилюминесценции.

Минимальный объем рабочего раствора при измерении хемилюминесценции в стандартной кювете К10 - 1000 мкл, исследования проводятся при комнатной температуре.

Отличительные особенности прибора:

· работа в диалоговом режиме (вопрос - ответ);

· автоматическая смена светофильтров при выборе фотометрической методики измерения;

· автоматическая загрузка в оперативную память калибровочной зависимости (калибровки) при смене методики измерения;

· перистальтический насос и проточная кювета объемом 32 мкл для работы в режиме фотометра;

· малый расход реагентов 1-2 мл на 1 анализ при работе с наливной кюветой и 500 - 800 мкл при работе с проточной;

· встроенный термостат измерительной кюветы. Температуры стабилизации 25, 30, 37°C;

· хранение в памяти 100 методик анализа;

· автоматический анализ результата на попадание в диапазон нормы;

· печать протокола выполнения анализов на принтере;

· производительность выполнения анализов до 100 анализов в час методом по конечной точке;

измерение оптической плотности, интенсивности флуоресценции, хемилюминесценции и расчет концентрации определяемого компонента.

Алгоритм выполнения анализов предполагает сначала проведение специфической химической реакции (или ее начала) вне прибора (в пробирке). Для выполнения анализа используются специальные наборы реагентов и соответствующий биологический материал. Далее: перенос рабочего раствора в кюветное отделение анализатора, измерение оптической плотности (интенсивности люминесценции) рабочего раствора, расчет концентрации, анализ результата на попадание в диапазон нормы, вывод результата и необходимых комментариев на экран и принтер. Все этапы работы анализатора кроме первых двух выполняются автоматически.

Диалоговый режим работы, использованный в анализаторе - это наиболее удобный для пользователя режим, позволяющий максимально упростить работу оператора. В случае работы в этом режиме оператор просто выбирает необходимый пункт из меню, предлагаемого анализатором, или непосредственно выполняет инструкцию, которая в виде текста отображается на дисплее.

Перед началом измерений в анализатор необходимо ввести программу для выполнения анализа, в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов. Этот процесс также выполняется в диалоговом режиме.

Размещено на Allbest.ru