Правила работы в лаборатории. Питательная среда. Патогенность микроорганизмов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное Государственное Образовательное Учреждение

Высшего Профессионального Образования

?Московская Государственная Академия Ветеринарной

Медицыны и Биотехнологии им.К.И.СКРЯБИНА."

Факультет заочного и очно-заочного обучения.

Отделение ТЭС заочной формы обучения.

Контрольная работа по ?Основы микробиологии.?

Курс 3

Студент Желанова Л.В

Содержание

1. Правила работы в бактериальной лаборатории.

2. Классификация питательных сред и их приготовление.

3. Основные факторы патогенности микроорганизмов.

1. Правила работы в бактериальной лаборатории

При выполнении лабораторных работ по биологии и микробиологии работают с различным биологическим материалом и культурами микроорганизмов. Изучают строение живых организмов и их основную структурную единицу - клетку. Клетки имеют небольшие размеры, поэтому невооруженным глазом их рассмотреть невозможно. Для их изучения готовят определенным образом препараты, которые рассматривают под микроскопом. Микробиология изучает мельчайшие, невидимые невооруженным глазом существа - микробы. Они находятся повсюду: в почве, воздухе, воде, на сырье, различных материалах, оборудовании, продуктах питания и т. д. Одни из них безопасны для человека, другие могут вызывать различные заболевания.

Увидеть микроорганизмы, так же как и отдельные клетки, можно только под микроскопом, приготовив соответствующим образом препараты. Поэтому работы на уровне клеток и микроорганизмов проводят в особых лабораториях, которые должны отвечать определенным требованиям. На лабораторном столе должны находиться: спиртовка; штатив для пробироки бактериальных петель и игл; набор красителей; промывалка; кювета с шинами для окраски препаратов; фильтровальная бумага; карандаш для стекла; дезинфицирующий раствор. В лаборатории должны быть созданы условия, обеспечивающие стерильность работы, при которых будет исключена возможность попадания как посторонних микроорганизмов извне, так и микроорганизмов из лаборатории в окружающую среду. Поэтому в микробиологической лаборатории необходимо строго соблюдать определенные правила работы и поведения, которые предотвращают возникновение заражения.

Правила работы в лаборатории

1. В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды - халата.

2. Не разрешается выходить в халате за пределы лаборатории и надевать на халат верхнюю одежду.

3. В помещении лаборатории запрещается принимать пищу и хранить продукты питания.

4. Не выносить за пределы лаборатории, какие бы то ни было посуду и материалы, которые используются для проведения лабораторных работ (пробирки, краски и т. д.).

5. Не класть на стол личные вещи (сумки, папки и др.), держать их на специально отведенных местах.

6. Если микроорганизмы попадают на оборудование или пол (разобьется пробирка или чашка Петри, на которой они росли), об этом надо сразу же сообщить преподавателю или лаборанту, а на данном месте провести обеззараживание, залив его дезинфицирующим раствором. После этого необходимо провести уборку.

7. Во время выполнения практических работ нельзя открывать форточки. Необходимо соблюдать тишину, избегать лишнего движения и хождения, открывания и закрывания дверей - всего того, что усиливает движение воздуха.

8. Перед началом работы дежурные проводят влажную уборку помещения, а столы протирают дезинфицирующим раствором.

9. Каждый студент перед началом работы должен проверить, все ли необходимое находится на его столе и исправен ли микроскоп.

10. Раздача необходимого для проведения лабораторной работы материала и посуды проводится лаборантом или дежурными.

11. На занятиях студенты должны иметь тетрадь и карандаши (простой и цветные - красный и синий). Рисунки при микроскопировании надо делать с препаратов, а не из книг или пособий.

12. По окончании работы все используемые инструменты обеззараживают. Бактериальные петли и иглы прокаливают над пламенем спиртовки, а пипетки и стекла помещают в дезинфицирующий раствор.

13. Все используемые при работе микробные культуры сдают лаборанту, который проводит их обеззараживание или в автоклаве, или в дезинфицирующем растворе.

14. В конце занятий надо привести в порядок рабочий стол, протереть и убрать микроскоп, тщательно вымыть руки (при работе с заразным материалом их сначала дезинфицируют) и снять халат.

По окончании работы берут пинцетом кусок ваты, смачивают его в 5% растворе хлорамина или в 5% растворе формалина и протирают им поверхность стола на рабочем месте. Такого рода повседневная дезинфекция носит профилактический характер.

2. Классификация питательных сред и их приготовление

При составлении питательных сред для микроорганизмов необходимо учитывать их потребность в элементах питания. По составу питательные среды подразделяются на две группы: естественные (натуральные) и синтетические. Естественными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, овощи, навоз, почва, вода морей, озер и минеральных источников. Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, обычно, все компоненты, необходимые для роста и развития. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны, выяснить, какие вещества образуются по ходу развития микроорганизмов. Это связано с тем, что состав естественных сред очень сложен; кроме того, он не является постоянным, так как существенно колеблется в зависимости от сырья и способа приготовления сред. Это заметно влияет на рост микроорганизмов. Естественные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и для диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые полусинтетические среды. В их состав наряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Синтетические среды -- это такие среды, в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды следует готовить на дистиллированной воде.

Для разработки синтетических сред, обеспечивающих нормальный рост изучаемого микроорганизма или максимальный биосинтез какого-либо продукта его жизнедеятельности, необходимо знать особенности обмена веществ данного организма и его потребности в источниках питания.

В настоящее время в распоряжении микробиологов имеется достаточное количество синтетических сред, не уступающих по своим качествам сложным средам неизвестного состава. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть и довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена. С. Н. Виноградским в практику микробиологии введены элективные (избирательные) среды для определенных групп микроорганизмов. Эти среды обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодны или совсем не пригодны для развития других. Зная физиологические особенности соответствующей группы микробов, можно подобрать такие условия культивирования (состав среды, ее активную кислотность, условия аэрации, температуру и др.), при которых будут развиваться лишь микроорганизмы этой группы. Это позволяет вести различные биологические процессы в лаборатории и в производстве без предварительной стерилизации среды. Такие среды применяются главным образом для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур. Понятие «элективные среды» входит в более широкое понятие «элективные условия». Питательные среды применяют различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие.

Плотные питательные среды используют для учета количества бактерий, выделения их в чистую культуру и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5--2,5% агар-агара или 10--15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят агар-агар в количестве 0,1--0,2%. По назначению среды разделяют на элективные и дифференциально-диагностические. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для преимущественного выделения грамотрицательных бактерий бывает достаточным добавления в питательную среду трифенилметановых красителей (кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый и т. д.). Для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5 %. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т. е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохимической активности и имеют неодинаковый набор ферментов, расщепляющих субстраты, входящие в состав питательной среды. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма.

Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством. Основными компонентами этой среды являются питательный (пептонный) агар, углевод и основной фусин, обесцвеченный сульфитом (реактив Шиффа). Исходная питательная среда окрашена в розовый цвет. Микроорганизмы, не сбраживающие лактозу, образуют бесцветные колонии. При сбраживании лактозы до ацетальдегида последний реагирует с сульфитом и развививается красная окраска соответствующих колоний. Среда с эозином и метиленовым синим (среда Левина) в качестве индикаторов содержит эозин и метиленовый синий и исходно окрашена в черно-синий цвет. Клетки, осуществляющие брожение, образуют колонии, окрашенные в черный с металлическим блеском цвет, а колонии, не обладающие этим свойством, бесцветны.Подобные изменения окраски происходят потому, что красители присутствуют в среде не в виде самостоятельных соединений, а в виде комплексов с веществами питательной среды. При низких значениях рН эти комплексы выпадают в осадок, исходные же красители в этих условиях растворимы, при больших рН комплексы красителей бесцветны, тогда как метиленовый синий приобретает синюю окраску. Данная среда позволяет дифференцировать бактерии рода Escherichia от бактерий рода Proteus.

Для поддержания оптимальной реакции питательных сред используются различные буферные растворы. Для большинства микроорганизмов оптимальная реакция среды близка к нейтральной (рН=6,5--7,5). бактериальный питательный патогенность микроорганизм

Встречаются, однако, некоторые виды, для которых оптимальны кислые или щелочные условия (рН=5, рН=8--9 соответственно). Следует помнить, что в процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы могут изменять реакцию среды в ту или другую сторону. Реакция среды может также изменяться при стерилизации.

Поэтому исходная реакция среды должна быть установлена с учетом этих факторов. Реакцию питательной среды регулируют путем добавления кислот или щелочей и контролируют по изменению цвета различных индикаторов (лакмуса, фенолфталеина и др.) или с помощью специальных приборов (рН-метров). При приготовлении питательной среды рекомендуется пользоваться продажными компонентами, хорошо очищенными и приготовленными в стандартных условиях. Наиболее удобны сухие среды, например сухой пептон или мясо-пептонный бульон, гидролизаты казеина и др. В случае необходимости, экстракты и гидролизаты могут быть приготовлены в лабораторных условиях, однако их качество будет значительно ниже. Приготовление питательной среды производится по соответствующим прописям, после чего среда фильтруется и в ней устанавливают необходимую реакцию рН. Некоторые компоненты среды иногда следует стерилизовать отдельно и добавить к среде после охлаждения, соблюдая правила стерильности. Все питательные среды стерилизуют во избежание прорастания в них посторонних микроорганизмов; сосуды, содержащие питательные среды, должны быть тщательно закрыты. Наиболее эффективный метод стерилизации -- термообработка. Выбор метода стерилизации зависит от термостабильности компонентов питательной среды. Иногда компоненты питательной среды стерилизуют отдельно различными методами, а затем смешивают. Питательные среды, не выдерживающие высокой температуры, стерилизуют фильтрованием.Стерильные питательные среды хранят в темных помещениях на холоде с достаточным уровнем влажности. Обычно допускается довольно продолжительное хранение питательных сред.

Перед употреблением питательные среды рекомендуется прокипятить (в тех случаях, когда допустима термообработка) для удаления растворенного в них воздуха. Агаровые и желатиновые среды расплавляют в водяных банях и в таком состоянии разливают.

Расфасовка питательных сред различна в зависимости от способа их применения. Как правило, питательные среды приготовляют, стерилизуют и хранят в больших емкостях и их розлив производится непосредственно перед опытом с соблюдением правил стерильности. Жидкие питательные среды разливают по колбам и пробиркам различной емкости, твердые -- по пробиркам, чашкам Петри и так называемым бактериологическим матрацам. Следует помнить, что твердые среды, заготовленные в матрацах, чашках Петри и скошенные среды -- в пробирках, нельзя хранить длительное время во избежание высыхания.

3. Основные факторы патогенности микроорганизмов

Определенная группа возбудителей не удовлетворяет триаде Коха: их выделяют от здоровых животных и от больных другими инфекционными болезнями. Они маловирулентны, и экспериментальное воспроизведение болезни на животных не удается. Причинная роль этих возбудителей устанавливается с трудом.

Факторы патогенности микроорганизмов подразделяют на две группы, которые определяют:

инвазивность микроорганизмов -- способность микроорганизмов проникать через иммунологические барьеры, кожу, слизистые оболочки внутрь тканей и органов, размножаться в них и противостоять иммунным силам макроорганизма. Инвазивность обусловлена наличием у микроорганизма капсулы, слизи, окружающих клетку и противостоящих фагоцитозу, жгутиков, пилей, ответственных за прикрепление микроорганизмов к клетке, и продукцией ферментов гиалуронидазы, фибринолизина, коллагеназы и т.д.;

токсигенность -- способность патогенных микроорганизмов продуцировать экзо- и эндотоксины.

Экзотоксины -- продукты микробного синтеза, выделяемые клеткой в окружающую среду. Это белки, обладающие высокой и строго специфичной токсичностью. Именно действие экзотоксинов определяет клинические признаки инфекционной болезни.

Эндотоксины представляют собой часть клеточной стенки бактерий. Они освобождаются при разрушении бактериальной клетки.

Независимо от микроба-продуцента эндотоксины вызывают однотипную картину патологического процесса: развиваются слабость, одышка, диарея, гипертермия.

Патогенное действие вирусов связано с их размножением в клетке живого организма, приводящим к ее гибели или к ликвидации ее функциональной активности, но возможен и абортивный процесс -- гибель вируса и выживание клетки. Взаимодействие с вирусом может привести к трансформации клетки и образованию опухолей.

У каждого возбудителя инфекции имеется свой спектр патогенности, т.е. круг восприимчивых животных, где микроорганизмы реализуют свои патогенные свойства.

Существуют облигатно патогенные микробы. Способность вызывать инфекционный процесс -- это их постоянный видовой признак. Существуют и факультативно патогенные (условно-патогенные) микроорганизмы, которые, являясь комменсалами, вызывают инфекционные процессы лишь при ослаблении резистентности своего хозяина.

Степень патогенности микроорганизмов называют вирулентностью. Это индивидуальная особенность конкретного, генетически однородного штамма микроба. Вирулентность может изменяться в зависимости от условий существования микроорганизмов.

В случае остроинфекционных болезней при попадании в организм выносливого животного возбудителей инфекции, как правило, животное заболевает. Такие возбудители полностью удовлетворяют трем условиям постулата Генле и Коха:

1. Микроб-возбудитель должен обнаруживаться при данной болезни и не встречаться ни у здоровых, ни у больных другими болезнями.

2. Микроб-возбудитель должен быть выделен из организма больного в чистом виде.

3. Чистая культура выделенного микроба должна вызывать то же заболевание у восприимчивого животного.

В настоящее время эта триада в значительной степени утратила свое значение. К основным факторам патогенности (вирулентности) относят способность микроорганизмов к колонизации, их устойчивость к разным микробицидным факторам организма, свойства инва-зивности и токсигенности, а также способность к длительномуперсистированию.

Способность к колонизации. Адгезия. Факторы колонизации.

Размножению бактерий в первичном очаге инфицирования предшествует адгезия [от лат. adhaesio, прикрепляться к чему-либо], то есть закрепление бактерий на поверхности клеток, что, собственно, и служит началом инфекционного процесса.

Прикрепление к поверхности клеток (например, к эпителию слизистых оболочек) обеспечивают адгезины, или факторы колонизации -- различные микробные продукты -- молекулы адгезии (белки, ЛПС, липо-тейхоевые кислоты). Молекулы адгезии могут располагаться непосредственно на поверхности бактериальной клетки либо входить в состав микроворсинок или капсул.

Взаимодействие инфекционного агента с эпителиальными клетками происходит в результате нескольких типов связей, различных по природе и специфичности. Выделяют связи, основанные на взаимодействии электростатических сил, обусловленные гидрофобными свойствами поверхности, лиганд-рецепторные взаимодействия.

Заряд. Бактериальные и эукариотические клетки заряжены отрицательно, но поверхностные микроворсинки грамотрицательных бактерий снижают заряд бактерий и уменьшают электростатические силы отталкивания.

Гидрофобность. Бескапсульные бактерии обладают высокой гидрофобностью, усиливающей адгезивность; гидрофобные участки обладают сродством к лигандам на поверхности эукариотических клеток, что и приводит к прочности связи.

Специфические взаимодействия. На поверхности бактерий имеются молекулы, способные к стереоспецифичному связыванию с комплементарными молекулами на мембранах эукариотических клеток (например, гемагглютинины или тейхоевые кислоты).

Другие механизмы колонизации. Некоторые бактерии способны «заранее подготавливать» место для дальнейшего размножения; например, нейраминидаза облегчает проникновение холерного вибриона через слой слизи и контакт с сиалосодержащими рецепторами эпителия кишечника.

Микроорганизмы также способны сорбироваться на бактериях, уже колонизировавших поверхность слизистых оболочек, либо связывать белки (например, фибронектин), рецепторы к которому имеются на многих клетках макроорганизма. У капсулированных бактерий в прикреплении активно участвуют полисахариды капсулы. Для успешной колонизации очага первичного инфицирования бактерии должны выдержать действие многочисленных и разнообразных микробицидных факторов хозяина. Для защиты от них микроорганизмы активно используют ряд структур (например, капсулы) и синтезируемых веществ (ферменты).

Список литературы

1. Е.ЗТеппер и др. «Практикум по микробиологии» М. «Колос» 1979

2. Г. Шлегель «Общая микробиология» М. «Мир» 1987. 566 с.

Размещено на Allbest.ru