Свойства гидрофобинов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

С древнейших времен грибы играли в питании человека очень важную роль. Ясно, что уже охотники и собиратели доисторической эпохи умели распознавать как их питательные свойства, так и содержание яда во многих видах.

Чем дальше развивались естественные науки в классической древности, тем больше внимания врачи и ученые уделяли грибам. К тому же периоду относятся и первые письменные сообщения о грибах.

На исходе Средневековья, когда начали бурно развиваться все естественные науки, возникли принципиально новые положения и в науке о грибах. Многие ученые старались классифицировать известные к тому времени виды.

Решающим поворотом стало изобретение микроскопа голландцем Захарием Янсеном в 1590 году. Теперь ученые не ограничивались описанием внешних признаков, ибо их взгляд мог проникнуть в тонкие ткани, во внутренние структуры, тем самым обнаруживая взаимосвязи совершенно нового уровня.

Только в самое последнее время ученые снова обратили пристальное внимание на вопросы количества видов, их родство, образ жизни и распространение. В середине 20-го столетия технологии их выращивания развились настолько, что сегодня мировая грибная индустрия представляет рынок объемом в 45 миллиардов долларов.

Большие возможности открывает глубинное культивирование грибов, позволяющее значительно сократить сроки их выращивания и организовать более эффективное производство. В результате глубинного культивирования получается мицелиальная биомасса, которая по своим вкусовым, пищевым и биоактивным свойствам мало отличается от соответствующих характеристик плодовых тел [8].

Особенно привлекательным является тот факт, что в результате ферментации одного гриба могут быть получены сразу несколько ценных веществ, что значительно снижает себестоимость конечных продуктов. Технология получения БАВ из грибов проста, оборудование занимает небольшую площадь. Налаженная технологическая цепь позволяет выпускать разные БАВ грибного происхождения. Производство БАВ является практически безотходным, так как все фракции после обработки находят применение [9].

Грибы можно рассматривать в качестве источника различных пищевых заменителей. Так, учёными Бирмингенского Университета были обнаружены и выделены грибные белки особого класса - гидрофобины. Это низкомолекулярные белки, образующие стойкие эмульсии, по своим вкусовым качествам похожие на жиры [1]. В связи с этим перспективным является вопрос об их применении в качестве заменителей жиров в пищевой промышленности.

1. Гидрофобины

1.1 Общая характеристика гидрофобинов

Способность грибных организмов обитать в самых различных климатических зонах на разнообразных субстратах является результатом формирования в процессе эволюции специфических структур, защищающих мицелий от разрушительного действия различных факторов окружающей среды. Одним из эффективных средств защиты являются гидрофобины - важнейшие структурные белки клеточной поверхности. Гидрофобины обильно секретируются мицелием. Они были открыты при поиске генов, экспрессирующихся при формировании воздушных гиф на мицелии Schizophyllum commune. Эти гены были впоследствии секвенированы. Продукт одного из них был обнаружен в клеточных стенках воздушных гиф (SC3), в то время как продукт второго (SC4) - в клеточных стенках гиф, формирующих плодовое тело [2].

Гидрофобины оказались совершенно новым классом белков, обладающих своеобразными физико-химическими свойствами. Для выделения гидрофобинов потребовалось применение методов, нетипичных для экстракции белков [1].

В дальнейшем было обнаружено, что гидрофобин SC3, выделенный из S. commune, обладал способностью к формированию гидрофобного слоя палочек или гидрофобиновой мантии in vitro на границе вода-воздух. Кроме того, этот же гидрофобин оказался посредником при прикреплении гиф S. commune к гидрофобным поверхностям [2].

Разрушение гена, кодирующего гидрофобин, приводило к возникновению фенотипа, у которого смачивались конидиоспоры. На их поверхности отсутствовал характерный для конидий слой палочек - тесно упакованных переплетающихся пучков толщиной 10 нм, состоящий из гидрофобинов (рисунок 1), ориентированных так, что гидрофобные аминокислотные остатки оказывались на поверхности, а гидрофильные - внутри [3].

Рисунок 1 - Гидрофобиновая мантия на поверхности конидиоспор Aspergillus nidulans. (Метод замораживания - скалывания. Масштаб - 100 нм).

Через некоторое время гидрофобино-подобные белки были обнаружены еще у ряда грибов.

1.2 Структура и поверхностные свойства гидрофобинов

В семейство гидрофобинов входят небольшие секретируемые белки (100±25 аминокислотных остатков), содержащие типичную N-концевую последовательность сигнала секреции. Степень гомологии аминокислотных остатков между гидрофобинами невелика.

Гидрофобины разделяют на 2 класса: гидрофобины класса I собираются в агрегаты, которые стабильны к действию детергентов и этанола, а гидрофобины класса II могут диссоциировать до мономеров под действием этих реагентов. Однако следует оговориться, что это разделение отнюдь не окончательное, так как многие гидрофобины все еще не выделены и их физико-химические свойства не охарактеризованы.

Поверхностные свойства гидрофобинов были подробно изучены на белке SC3 Schizophyllum commune, в условиях как in vivo, так и in vitro. Гидрофобины отсутствуют у гиф, ассимилирующих пищу. Ген гидрофобинов начинает функционировать на 2-е - 3-и сутки роста. В это время происходит интенсивная секреция белка SC3 в среду, а также начинается формирование воздушных гиф. Было показано, что молекулы белка секретируются через апикальный кончик гиф при глубинном культивировании, но собираются в комплексы на разделе фаз клеточная стенка - воздух. При этом полимерную структуру гидрофобиновой мантии можно разрушить до мономеров, растворив её в трихлоруксусной кислоте, а затем, удалив кислоту, восстановить её снова [2].

Секретируемые в среду молекулы гидрофобинов не являются поверхностно активными, и поэтому не представляют опасности для клеточных мембран развивающихся гиф. Только после соединения за счёт гидрофобных взаимодействий на границе раздела гидрофильная-гидрофобная среда эти белки приобретают поверхностную активность. Формируется амфипатическая мембрана, гидрофобные аминокислотные остатки в которой ориентированы во внешнюю среду, а гидрофильные направлены в сторону клеточной стенки (рисунок 3 а, б). SC3 формирует такую мантию только у воздушных гиф, покрывая наружный слой клеточной стенки.

Формирование воздушных гиф связано с потерей ими способности к ассимиляции пищи, ровно как и к возможности свободно секретировать гидрофобины в окружающую среду. Белки остаются в клеточной стенке и на поверхности раздела с воздухом формируют агрегаты - покрывающие гифы амфипатические слои. Способность к формированию амфипатической мантии очень важна на стадии образования воздушных гиф, поскольку гидрофобиновое покрытие помогает преодолеть поверхностное натяжение жидкости и, таким образом, стимулирует вертикальный рост гиф [1].

Мантия у представителей I и II классов гидрофобинов, по-видимому, неодинакова, и у представителей класса II она гораздо менее стабильна.

Рисунок 3 - Функции гидрофобинов класса I.

а - появление воздушных гиф, б - гидрофобины плотно прикрепляют гифы к гидрофобным поверхностям.

1 - мономеры гидрофобинов, 2 - гидрофобиновая мантия.

2. Pleurotus ostreatus

Во время практики проводилось получение биомассы и культуральной жидкости базидиального гриба Pleurotus ostreatus. Pleurotus ostreatus или вешенка обыкновенная относится к отделу Базидиомицеты, порядку Агариковые, семейству Плевротовые (Вёшенковые).

Дереворазрушающий гриб-сапрофит (ксилофит), широко распространённый в лесах умеренной зоны. Растёт группами, реже - одиночно, на пнях, валежнике, сухостойных или живых, но ослабленных, деревьях различных лиственных (дуб, берёза, рябина, осина, ива), очень редко - на хвойных, пород в лиственных и смешанных лесах, парках и садах. На древесных стволах встречается довольно высоко над землей. Часто растёт густыми пучками из 30 и более плодовых тел, срастающимся у основания, и образует «многоярусные конструкции».

Встречается с сентября по ноябрь-декабрь (массовое плодоношение - в конце сентября-октябре), хорошо переносит отрицательные температуры. При благоприятных условиях (холодная погода) может появляться и в мае-июне.

Вёшенка обыкновенная вызывает жёлтую смешанную гниль стволов деревьев лиственных, реже хвойных пород. Заражение обычно происходит через морозобойные трещины. Плодовые тела грибов образуются в месте наибольшего развития гнили. Гриб продолжает развиваться и на мёртвой древесине.

Вёшенка обыкновенная относится к т. н. хищным грибам и способна парализовывать с помощью выделяемого нематотоксина и переваривать нематод, таким образом получая азот [8].

Цели и задачи работы

Цель:

- исследовать гриб Pleurotus ostreatus в качестве возможного продуцента гидрофобинов.

Задачи:

- отработать методику получения гидрофобинов из грибного мицелия, для чего провести экстракцию различными экстрагентами;

- отработать методику получения гидрофобинов из культуральной жидкости;

Экспериментальная часть

1 Объекты исследований

Объектом исследований являлся высший базидиальный гриб из коллекции кафедры технологии микробиологического синтеза Pleurotus ostreatus.

2 Материалы и методы

2.1 Выращивание грибов

Исходную культуру гриба выращивали в пробирках на скошенном сусло-агаре при температуре 28-30?C в течение 7-10 суток - до полного зарастания поверхности косяка. Выросшие культуры хранили в холодильнике при температуре +4?C.

Посевной материал для глубинного процесса выращивали в два этапа. На первом этапе культуры грибов выращивали в пробирках на сусло-агаре при температуре 28-30?C в течение 7-10 суток. На следующем этапе 2-3 кусочка мицелия пересевали с агаризованной среды в конические колбы объёмом 0,5 л со 150 мл среды. На дно колб засыпали стеклянные или керамические бусы диаметром 7-10 мм. Посевной материал выращивали в стационарных условиях при температуре 28-30?C в течение 7-10 суток до полного зарастания поверхности плёнкой мицелия.

Выращенный поверхностным способом посевной материал измельчали с помощью бус. Полученную суспензию использовали в качестве посевного материала для стадии глубинного культивирования.

Глубинное культивирование проводили в колбах Эрленмейера объёмом 0,75 л с 250 мл среды на роторной качалке (230 об/мин) при температуре 28-30?C в течение 7 суток. В качестве среды для получения посевного материала использовали полусинтетическую питательную среду. При глубинном культивировании применяли глюкозо-пептонную среду.

Состав питательной среды представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Состав глюкозо-пептонной среды

Стерилизацию всех сред проводили при 0,8* Па в течение 40 минут.

Для отделения биомассы гриба нативный раствор отфильтровывали через бумажный и асбестовый фильтры под вакуумом. Биомассу сушили в сушильном шкафу при температуре 50?C. Количество сухой биомассы определяли весовым методом.

2.2 Отделение биомассы продуцента

Нативный раствор отделяли от мицелия грибов фильтрованием через бумажный фильтр под вакуумом. Биомассу сушили в сушильном шкафу при температуре 50⁰С. Количество сухой биомассы определяли весовым методом.

2.3 Определение концентрации белка

Для определения количества белка образовавшегося в процессе культивирования и после экстракции необходимо узнать концентрацию белка в нативном растворе и экстракте. Для этого был использован метод Лоури, который является одним из наиболее чувствительных и точных в настоящее время.

Метод основан на сочетании биуретовой реакции на пептидную связь с реакцией Фолина на ароматические кислоты. К недостаткам следует отнести то, что он применим только для прозрачных растворов и имеет довольно большую длительность определения. Кроме того, на развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем, восстановители, комплексные детергенты, сернокислый аммоний в концентрации 0,15%, сахароза в концентрации 10%.

Реактивы:

1) Реактив А - 2%-ный раствор в 0,1 М NaOH.

2 г NaOH растворяют в небольшом количестве воды в мерной колбе на 500 мл. После полного растворения добавляют 10 г. . Объём доводят водой до метки.

2) Реактив В - 0,5%-ный раствор в 1%-ном растворе цитрата натрия. 1 г цитрата натрия растворяют в небольшом количестве воды в мерной колбе на 100 мл. После полного растворения добавляют 0,5 г . Доводят объём до метки дистиллированной водой.

3) Реактив С - готовится непосредственно перед употреблением. Смешивают 1 мл реактива В и 49 мл реактива А.

4) Реактив Фолина. Перед использованием разбавляют водой в соотношении 1:1.

Ход определения:

К 0,4 мл исследуемого белкового раствора добавляют 2 мл реактива С. Смесь тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем приливают 0,2 мл реактива Фолина, предварительно разбавленного дистиллированной водой в соотношении 1:1, энергично перемешивают и оставляют на 30 мин в темноте для развития окраски. Жёлтая окраска раствора постепенно переходит в синюю. Оптическую плотность раствора измеряют на фотоэлектрокалориметре при длине волны 750 нм.

Для количественного определения белка необходимо построить калибровочный график. Заполнение проб для построения калибровочного графика проводят по таблице 2 [10].

Таблица 2 - Схема заполнения проб для построения калибровочного графика для определения белка по методу Лоури

По результатам измерений, выполненных в трех повторностях, строят зависимость D₇₅₀⁼f(C_белка) (мг/мл) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Калибровочный график для определения белка по методу Лоури

2.4 Выделение гидрофобинов

В настоящее время в литературных источниках содержится крайне мало информации о способах выделения гидрофобинов. Нами было выбрано несколько методов экстракции.

Первый метод

Гидрофобины из мицелия P. ostreatus выделили, используя их свойства: они нерастворимы в кипящем растворе, содержащем SDS (1%) и 0,1М NaH2PO4 при рН 7 в течение 15 мин. Экстракцию проводили в колбах Эрленмейера объёмом 700 мл. На 700 мл экстрагента брали 200 г. биомассы. После этой операции нерастворимые гидрофобины были отделены от других растворимых белков путём центрифугирования при 4800 x g в течение 10 мин. и несколькими смываниями водой. Для более полной экстракции гидрофобинов мицелия биомассу высушивали в сушильном шкафу и из полученной высушенной биомассы белки экстрагировали 60% этиловым спиртом. Экстракцию проводили в 2 этапа. Вначале брали 100 мл 60% этилового спирта и экстрагировали 15 мин. Затем отделяли биомассу от супернатанта центрифугированием при 4800 х g 10 мин. Далее для повторной экстракции брали 50 мл 60% этилового спирта и повторяли описанные ранее операции.

Второй метод

Гидрофобины очищали от клеточной стенки гриба, потому что большинство данных белков связано с клеткой (80%). Очистка проводилась в два простых шага включающие экстракцию из мицелия 1% SDS при рН 9,0, с последующим осаждением KCl для удаления SDS.

Экстракцию проводили в два этапа. На первом этапе брали 230 г. мицелия на 700 мл 0,1 М буфера трис-HCl с рН 9,0, содержащем 1% SDS. Экстракцию вели при комнатной температуре в течение 1 ч, временами перемешивания. На втором этапе брали 500 мл 0,1 М буфера трис-HCl с рН 9,0, содержащем 1% SDS. Экстракцию вели также. Мицелий отделяли центрифугированием (3000 х g, 10 мин, 4^oC). SDS осаждали из первичного экстракта как нерастворимый в воде додецилсульфат калия, добавив 0,4 объема 2 М KCl и уничтожали после центрифугирования.

Третий метод

Экстракция гидрофобинов в кипящем растворе, содержащем SLS (1%) и 0,1М NaH2PO4 при рН 7 в течение 15 мин. На 500 мл экстрагента брали 100 г. биомассы. После этой операции нерастворимые гидрофобины были отделены от других растворимых белков путём центрифугирования при 4800 x g в течение 10 мин и несколькими смываниями водой. Для более полной экстракции гидрофобинов мицелия биомассу высушивали в сушильном шкафу и из полученной высушенной биомассы белки экстрагировали 60% этиловым спиртом. Экстракцию проводили также в 2 этапа. Вначале брали 100 мл 60% этилового спирта и экстрагировали 15 мин. Затем отделяли биомассу от супернатанта центрифугированием при 4800 х g 10 мин. Далее для повторной экстракции брали 50 мл 60% этилового спирта и повторяли описанные ранее операции.

Четвертый метод

Экстракцию проводили в два этапа. На первом этапе брали 200 г. мицелия на 500 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 8,0, содержащем 1% SLS. Экстракцию вели при комнатной температуре в течение 1 ч, временами перемешивания. Мицелий отделяли центрифугированием (3000 х g, 10 мин, 4^oC). На втором этапе брали 300 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 8,0, содержащем 1% SLS. Экстракцию вели также. SLS осаждали из первичного экстракта как нерастворимый в воде лаурилсульфат калия, добавив 0,4 объема 2 М KCl и уничтожали после центрифугирования.

Выделение гидрофобинов из нативного раствора

После 7 дней выращивания грибов гидрофобины, выделившиеся в среду, были агрегированы путём вспенивания культуральной жидкости с использованием блендера. Затем пена была собрана и отцентрифугированна при 4000xg. Получившийся осадок подвергали сушке.

3. Результаты

Культуру гриба выращивали в течении 7 суток. Мицелий отделяли от нативного раствора фильтрованием через бумажный фильтр под вакуумом и определяли содержание белка в нативном растворе и экстракте.

Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Концентрация белка

Также были получены экстракты белков и осадок после вспенивания культуральной жидкости, которые были отправлены в Институт высокомолекулярных соединений РАН для определения точного количества гидрофобинов с помощью ВЭЖХ.

Выводы

Проведено глубинное культивирование гриба Pleurotus ostreatus, накоплена биомасса для экстракции гидрофобинов.

Проведена экстракция гидрофобиновых белков из биомассы гриба.

Получены экстракты белков, которые в дальнейшем будут разделены с помощью ВЭЖХ.

Проведено выделение гидрофобиновых белков из культуральной жидкости.

Определено содержание белка в нативном растворе и полученных экстрактах.

Размещено на Allbest.ru