Віскозиметрія у визначенні активності ферментів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КУРСОВА РОБОТА

з дисципліни:

«Спеціальні фізико-хімічні методи контролю біотехнологічного виробництва»

«Віскозиметрія у визначенні активності ферментів»

Вступ

Ферменти - це біологічно активні речовини. Вони є каталізаторами білкової природи, що утворюються й функціонують у всіх живих організмах. Ферментні препарати широко використовуються в найрізноманітніших галузях харчової та легкої промисловості, у косметиці, у виробництві миючих засобів, в сільському господарстві, в аналітичних дослідах, медичній промисловості та охороні здоров'я. З кожним роком росте об'єм виробництва цих препаратів, розширюється їх асортимент та сфера застосування.

Але для того, щоб виробляти високоякісні ферментні препарати, необхідно вміти правильно контролювати показники продукту, найголовнішим з яких є активність ферменту. Для цього розроблено велику кількість методів, одним з яких є віскозиметричний метод. Він застосовується для визначення активності пектолітичних ферментів.

1. Властивості ферментів

Фермент - від лат. fermentum - закваска; ензим - від греч. ен - усередині, зимі - закваска.

Ферменти, або ензими, - це каталізатори білкової природи, що утворюються й функціонують у всіх живих організмах. Походження термінів пов'язані з тим, що спочатку ферментативні процеси були відкриті й вивчені в бродильному виробництві. У кожній клітині є сотні різних ферментів. З їхньою допомогою здійснюються багато хімічних реакцій, які можуть із великою швидкістю йти при температурах, що підходять для даного організму, тобто в межах від 5 до 40⁰ С. Щоб ці реакції з тією же швидкістю протікали поза організмом, потрібні були б високі температури й різкі зміни деяких інших умов. Для клітини це означало б загибель, тому що вся робота клітини будується таким чином, щоб уникнути будь-яких помітних змін у нормальних умовах її існування. Отже, ферменти можна визначити як біологічні каталізатори, тобто як речовини, що прискорюють реакції. Вони абсолютно необхідні, тому що без них реакції в клітинах протікали б занадто повільно й не могли б підтримувати життя. Сукупність біохімічних реакцій, що каталізуються ферментами, становить сутність обміну речовин, що є відмітною рисою всіх живих організмів. Через ферментативний апарат, регуляцію його активності відбувається й регуляція швидкості метаболічних реакцій, їхньої спрямованості [2].

1.1 Спільні з небіологічними каталізаторами властивості

Будучи каталізаторами, ферменти мають ряд спільних з небіологічними каталізаторами властивостей.

1. Ферменти не входять до складу кінцевих продуктів реакції й виходять із неї, як правило, у первісному виді, тобто вони не витрачаються в процесі каталізу (але сьогодні доведено, що деякі ферменти наприкінці хімічної реакції піддаються модифікації й навіть розпадаються, а не звільняються в незмінному виді).

2. Ферменти не можуть збудити ті реакції, протікання яких суперечить законам термодинаміки, вони прискорюють тільки ті реакції, які можуть протікати й без них.

3. Ферменти не зміщають положення рівноваги, а лише прискорюють його досягнення [1].

1.2 Специфічні властивості

Ферменти також мають специфічні властивості.

1. За своєю хімічною будовою всі ферменти є білками.

2. Ефективність ферментів набагато вище, ніж небіологічних каталізаторів (швидкість протікання реакції при участі ферменту вище на кілька порядків).

3. Ферменти мають вузьку специфічність, вибірковість дії на субстрати, тобто на речовини, перетворення яких вони каталізують. Висока специфічність ферментів обумовлена конформаційною і електростатичною комплементарністю між молекулами субстрату й ферменту й унікальною структурою активного центра ферменту, що забезпечують «дізнавання», висока спорідненість і вибірковість протікання однієї якої-небудь реакції з тисячі інших хімічних реакцій, що здійснюються одночасно в живих клітинах.

Залежно від механізму дії розрізняють ферменти з відносною (або груповою) специфічністю й абсолютною специфічністю. Так, для дії деяких гідролітичних ферментів найбільше значення має тип хімічного зв'язку в молекулі субстрату. Наприклад, пепсин розщеплює білки тваринного й рослинного походження, хоча вони можуть істотно відрізнятися друг від друга як за хімічною будовою й за амінокислотним складом, так і за фізико-хімічними властивостями. Однак пепсин не розщеплює вуглеводи або жири. Пояснюється це тим, що місцем дії пепсину є пептидний - С - NH - зв'язок. Для дії ліпази, що каталізу гідроліз жирів до гліцерину і жирних кислот, таким місцем є складноефірний зв'язок. Аналогічною відносною специфічністю володіють також деякі внутрішньоклітинні ферменти, наприклад гексокиназа, що каталізує в присутності АТФ фосфорилювання майже всіх гексоз, хоча одночасно в клітинах є специфічні для кожної гексози ферменти, що виконують таке ж фосфорилювання.

Абсолютною специфічністю дії називають здатність ферменту каталізувати перетворення тільки єдиного субстрату. Будь-які модифікації в структурі субстрату роблять його недоступними для дії ферменту.

Стереохімічна специфічність ферментів обумовлена існуванням оптично ізомерних L- і D-форм або геометричних (цис- і транс-) ізомерів хімічних речовин. Так, відомі оксидази L- і D-амінокислот, хоча в природних білках виявлені тільки L-амінокислоти. Кожний з видів оксидаз діє тільки на свій специфічний стереоізомер.

+ЅО₂

L-амінокислота б - кетокислота + NH₃ + H₂O оксидаза L-амінокислот

+ЅО₂

D-амінокислота б - кетокислота + NH₃ + H₂O оксидаза D-амінокислот

Наочним прикладом стереохімічної специфічності є бактеріальна аспартатдекарбоксилаза, що каталізує відщіплення СО₂ тільки від L-аспаргінової кислоти з перетворення її в L-аланін [3].

4. Регулюємість ферментів як біокаталізаторів. Через регуляцію ферментативного апарата здійснюється координація всіх метаболічних процесів у часі й просторі, що спрямовані на відтворення живої матерії, підтримку сталості внутрішньоклітинного середовища, пристосування до мінливих зовнішніх умов [6].

5. Термолабільність ферментів. Швидкість хімічних реакцій залежить від температури, тому реакції, що каталізуються ферментами, також чутливі до змін температури. Однак внаслідок білкової природи ферменту теплова денатурація при підвищенні температури буде знижувати ефективну концентрацію ферменту з відповідним зниженням швидкості реакції. Таким чином, термолабільність, або чутливість до підвищення температури є одним з характерних властивостей ферментів, що різко відрізняють їх від неорганічних каталізаторів. При 100⁰С майже всі ферменти втрачають свою активність (виключення становлять, мабуть, тільки один фермент м'язової тканини - міокіназа, що витримує нагрівання до 100⁰С). При низьких температурах (0⁰С и нижче) ферменти, як правило, не руйнуються, хоча активність їх падає майже до нуля. У всіх випадках має значення час впливу відповідної температури. У цей час для пепсину, трипсину й ряду інших ферментів доведене існування прямої залежності між швидкістю інактивації ферменту й ступенем денатурації білка. На термолабильность ферментів певний вплив роблять концентрація субстрату, рН середовища й інші фактори.

6. Залежність активності ферментів від рН середовища. Ферменти звичайно найбільш активні в межах вузької зони концентрації водневих іонів, що відповідає для тваринних тканин в основному виробленим у процесі еволюції фізіологічним значенням рН середовища 6.0 - 8.0. рН-оптимум дії ферментів лежить у межах фізіологічних значень. Виключення становить пепсин, рН-оптимум якого дорівнює 2.0. Пояснюється це тим, що пепсин входить до складу шлункового соку, що містить вільну соляну кислоту, що створює оптимальне кисле середовище для дії цього ферменту. З іншого боку, рН-оптимум аргінази лежить у сильно лужній зоні (близько 10.0); такого середовища немає в клітинах печінки, отже, in vivo аргіназа функціонує, очевидно, не у своїй оптимальній зоні рН середовища. Вплив змін рН середовища на молекули ферменту полягає у впливі на стан і ступінь іонізації кислотних і основних груп (СООН-групи дикарбонових амінокислот, SH-групи цистеїна, імідазольного азоту гістидина й ін.). При різних значеннях рН середовища активний центр може перебувати в частково іонізованій або в неіонізованій формі, що позначається на третинній структурі білка й відповідно формуванні активного фермент-субстратного комплексу. Крім того, має значення й стан іонізації субстратів і кофакторів.

2. Загальні методи визначення активності ферментів

Перш ніж переступити до виділення ферменту, необхідно обрати й ретельно відробити метод визначення активності, під контролем якого здійснюється вибір найбільш ефективних прийомів очищення ферментів, а потім і виконання послідовних стадій його препаративного одержання. Активність ферменту змінюється при різних умовах реакції й залежить від температури, рН середовища, від концентрацій субстратів і кофакторів. Тому при визначенні активності ферменту на різних стадіях очищення необхідно строго витримувати ті самі умови. Бажано не обмежуватися визначенням активності за одним яким-небудь методом. Кількість субстрату, перетворюваного в умовах тесту на визначення активності ферменту, повинне бути пропорційна кількості останнього й часу інкубації. Якщо ж немає такої пропорційності, то активність розраховують по попередньо побудованому калібрувальному графіку, що відбиває залежність швидкості реакції від кількості одиниць ферменту. Коли хід реакції нелінійний у часі, варто визначати початкову швидкість реакції (за тангенсом кута нахилу дотичної до початкового відрізка кривої перетворення). Для цього легше всього застосовувати такі методи зміни активності, які дозволяють стежити без зупинки за ходом перетворення в часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні й т.п. Для виміру швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, що не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близького до оптимального для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить у більшості випадків у межах 25-40⁰С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів і ін.), концентрація яких може знижуватися по мірі очищення ферменту, у реакційну суміш варто додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т. п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу дослідних сумішей. У багатьох випадках додавання желатину, альбуміну й інших добавок запобігає денатурації ферментного білка.

2.1 Спектрофотометричні методи

Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектра багатьма сполуками, що є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для виміру спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін. Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малою витратою ферменту й реактивів і дозволяє стежити за плином реакції в часі. Для цього реакційну суміш поміщають у кювету, вставлену в кюветотримач, який термостатували. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, що характерна для використаного субстрату або кінцевого продукту, що утвориться в даній реакції. За допомогою спектрофотометричного методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатнього очищення) по величині характерних максимумів поглинання міцно зв'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно обрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту й активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від методу визначення, що обирається. У випадку спектрофотометричного методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичній густині за певний час за даних умов досліду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини у хвилину, і т.д. Тоді питому активність ферменту, що є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка) [4].

Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимір поглинання світла, але також виміру флюоресценції - спектрофлюорометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти й субстрати мають сильну флюоресценцію. НАД і НАДФ у відновленому стані мають сильну флюоресценцію й не флюоресціюють в окисненому стані. Тому спектрофлюорометрію використовують для вивчення кінетики й механізму дії нікотинамідних і флавінових ферментів.

2.2 Колориметричні (фотометричні) методи

В основі цих методів лежить вимір за допомогою візуального або фотоелектричного колориметра забарвленого продукту, що утвориться при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які звичайно додаються у фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи досить різноманітні. Розроблено кількісні методи, засновані на біуретовій реакції, при якій склад білка не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла й співавторів, заснований на вимірі смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретові мікрометоди, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0,1 - 2,0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелике, але варто вносити виправлення на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найціннішими є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення за зміною забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Фолина й Чиокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенній природі деяких бічних груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу достатньо 0,01 - 0,1 мг білка), але багато небілкових речовин заважають визначенню [5].

Для визначення кількості білка широко користуються вимірами інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках відрізняється й, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчині, що містить 1 мг «усередненого» білка в 1 мл, оптична густина дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити виправлення на їхню присутність, проводячи вимір при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість виміру активності ферментів. Ті ж самі вимоги й до виміру кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому методу визначення білка шляхом виміру величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання білка, що виділяється, іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, що були присутні у вихідному матеріалі.

2.3 Манометричні методи

Ці методи використаються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів перебуває в газоподібному стані. До таких реакцій відносяться головним чином ті, які пов'язані із процесами окиснення й декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню й вуглекислоти, а також реакції, у яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з реактивом, що доданий в систему. Спостереження за ходом реакції в часі проводиться в спеціальних приладах - манометричних апаратах Варбурга.

2.4 Спеціальні методи визначення активності пепсину і папаіну

Пепсин і папаін відносяться до однієї з найбільш численних груп ферментів - протеолітичних ферментів (протеази). Вони належать до класу гідролаз, до підкласу пептидгідролаз і каталізують розщеплення білків і поліпептидів відповідно до рівняння:

R₁CONHR₂ + H₂O R₁COOH + H₂NR₂,

де R₁ і R₂ - залишки амінокислот.

Тобто протеази каталізують розщеплення пептидного зв'язку - CO - NH -.

2.5 Інші методи

Визначення активності можна проводити, використовуючи методи хроматографії й електрофореза на папері. Ці методи високочутливі й специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно зменшити витрати ферменту на вимір активності. Але їх не завжди можна застосовувати через тривалість розділення речовин у процесі хроматографії та електрофореза [7].

Також сюди відноситься ряд методів, що включають потенціо- і кондуктометричні виміри, поляриметрію та віскозиметрію - метод виміру в'язкості середовища.

3. Віскозиметрія

Віскозиметрія (viscоsimetry, від латинського viscosus - грузлий, клейкий і від грецького metreo - вимірюю) - сукупність методів виміру в'язкості середовищ. Прилади, що використовуються при цьому називаються віскозиметрами. Серед них дуже розповсюджений віскозиметр Оствальда, який використовують для визначення активності ферментів.

3.1 Методи віскозиметрії

3.1.1 Ультразвукова віскозиметрія

Суть методу ультразвукової віскозиметрії полягає в тому, що в досліджуване середовище занурюють пластинку з магнітострікційного матеріалу, що називається зондом віскозиметра, на яку намотана котушка, в якій виникають короткі імпульси струму тривалістю порядка 20±10 мксек, що приводять до виникнення коливань. Відповідно до закону збереження, при коливаннях пластинки в котушці наводиться ЕДС, яка зменшується зі швидкістю, що залежить від в'язкості середовища. Потім, при падінні ЕДС до певного порогового значення, в котушку поступає новий імпульс. Віскозиметр визначає в'язкість середовища по частоті проходження імпульсів.

Віскозиметри, дія яких заснована на ультразвуковому методі віскозиметрії, не можна віднести до класу віскозиметрів з широким діапазоном вимірювань. До класу високотемпературних віскозиметрів їх також не можна віднести через величину відносної погрішності, що виникає при високотемпературній віскозиметрії і властивостей матеріалів приладу.

3.1.2 Ротаційна віскозиметрія

Ротаційний метод віскозиметрії полягає в тому, що досліджувана рідина поміщається в малий зазор між двома тілами, необхідний для зрушення досліджуваного середовища. Одне з тіл впродовж всього досліду залишається нерухомим, інше, зване ротором ротаційного віскозиметра, здійснює обертання з постійною швидкістю. Очевидно, що обертальний рух ротора візкозіметра передається до іншої поверхні (за допомогою руху в'язкого середовища; відсутність прослизання середовища у поверхонь тіла передбачається, таким чином розглядаються). Звідси слідує теза: момент обертання ротора ротаційного віскозиметра є мірою в'язкості.

Ротаційні віскозиметри мають дві коаксиально розташовані циліндричні поверхні (дві циліндричні склянки), у просвіт між якими вміщується досліджувана речовина. Один із циліндрів обертається з кутовою швидкістю Щ і, за допомогою в'язкості досліджуваної речовини, обертання передається на інший циліндр, на якому виміряється величина крутного моменту М. Тоді коефіцієнт в'язкості речовини визначається по формулі

з ?= k/Щ,

де k - постійна, пов'язана з геометрією приладу.

Розглянемо інверсну модель ротаційного віскозиметра: обертається зовнішнє тіло, внутрішнє тіло залишиться нерухомим. Скорочено внутрішнє тіло називають ротором ротаційного віскозиметра.

Рис. 3.1. Ротаційний віскозиметр

Введемо необхідні позначення:

R1, L - радіус і довжина ротора ротаційного віскозиметра;

щ - постійна кутова швидкість обертання зовнішнього тіла;

R2 - радіус резервуару ротаційного віскозиметра, що обертається;

з - в'язкість досліджуваного середовища;

M1 - момент обертання, передаваний через в'язку рідину, рівний

d, l - діаметр і довжина пружної нитки,

ц - кут, на який закручується нерухомо закріплена нитка,

G - момент пружності матеріалу нитки.

При цьому момент M1 ротора ротаційного віскозиметра, що крутить, врівноважується моментом сил пружності нитки М2:

Відмітимо знов, що М1 = М2, звідки після декількох перетворень маємо:

або

де k - постійна ротаційного віскозиметра.

Якщо розглядати те ж завдання для ротаційного віскозиметра з внутрішнім, що обертається, і нерухомим зовнішнім тілами, маємо:



або

.

В цьому випадку G - момент, необхідний для підтримки постійної частоти обертання (один оборот ротора віскозиметра за ф с).

Відмітимо, що отримані відносини справедливі для циліндра нескінченної довжини, в реальних умовах враховується поправка на розміри тіл ротаційного віскозиметра. Для цього проводиться обчислення так званої ефективної висоти H ротаційного віскозиметра:

1. проводиться вимірювання моменту для рідин з різним значенням в'язкості (з1 и з2) при двох різних висотах внутрішнього циліндра (L1 і L2);

2. екстраполяцією прямих М1 = f(L) і М2 = f(L) до нульового значення М1 і М2 отримують величину ?L;

3. H=l+?l.

Ефективну висоту ротаційного віскозиметра H підставляють в рівняння.

3.1.3 Капілярна віскозиметрія

Капілярні віскозиметри пов'язані з виміром об'ємної швидкості Q (м³/с) витікання досліджуваної речовини через трубку радіуса r і довжини L під дією перепаду тисків ДР на кінцях трубки. Коефіцієнт в'язкості визначається по формулі Пуазейля

з = рr⁴ДР/8QL.

Оскільки формула вірна для ізотермічного руху в необмежено довгій трубці, при її практичному використанні вводять виправлення, враховуючі особливості плину на вході й виході із трубки, а також коливання температури й тиску.

Метод капілярної віскозиметрії спирається на закон Пуазейля про в'язку рідину, що описує закономірності руху рідини в капілярі.

Приведемо рівняння гідродинаміки для стаціонарного перебігу рідини, з в'язкістю з через капіляр віскозиметра:

Q - кількість рідини, що протікає через капіляр капілярного віскозиметра в одиницю часу, м³/с,

R - радіус капіляра віскозиметра, м,

L - довжина капіляра капілярного віскозиметра, м,

з - в'язкість рідини, Па·с,

р - різниця тиску на кінцях капіляра віскозиметра, Па.

Відзначимо, що формула Пуазейля справедлива тільки для ламінарного потоку рідини, тобто за відсутності ковзання на межі рідина - стінка капіляра віскозиметра. Приведене рівняння використовують для визначення динамічної в'язкості. Нижче розміщено схематичне зображення капілярного віскозиметра.

Рис. 3.2. Капілярний віскозиметр

У капілярному віскозиметрі рідина з однієї судини під впливом різниці тиску р витікає через капіляр з перетином 2R і довжиною L в іншу судину. З рисунку видно, що судини мають у багато разів більший поперечний перетин, чим капіляр віскозиметра, і відповідно до цього швидкість руху рідини в обох судинах в N разів менше, ніж в капілярі віскозиметра. Таким чином не весь тиск піде на подолання в'язкого опору рідині, очевидно, що частина його витрачатиметься на передачу рідині невизначеної кінетичної енергії. Отже, в рівняння Пуазейля необхідно ввести деяку поправку на кінетичну енергію, що називається поправкою Хагенбаха:

де h - коефіцієнт, що прагне до одиниці, d - густина досліджуємої рідини.

Другу поправку умовно назвемо поправкою впливу початкової ділянки капіляра віскозиметра на характер руху досліджуваної рідини. Вона характеризуватиме можливе виникнення гвинтового руху і завихорення в місці сполучення капіляра з резервуаром капілярного віскозиметра (звідки витікає рідина). Суть поправки полягає в тому, що замість дійсної довжини капіляра віскозиметра L ми вводимо довжину L', що здається:

n - визначається експериментально на основі змін при різних значеннях L і приблизно дорівнює одиниці.

Слід враховувати, що при вимірюванні в'язкості органічних рідин з великою кінематичною в'язкістю поправка Хагенбаха незначна і складає долі відсотка. Якщо ж говорити про високотемпературні віскозиметри, то внаслідок малої кінематичної в'язкості рідких металів поправка може досягати 15%.

Метод капілярної віскозиметрії цілком можна віднести до високоточного методу віскозиметрії внаслідок того, що відносна погрішність вимірювань складає долі відсотка, залежно від підбору матеріалів віскозиметра і точності відліку часу, а також інших параметрів, що беруть участь в методі капілярного витікання.

3.1.4 Метод падаючої кульки

Метод падаючої кульки пов'язаний з виміром швидкості v встановленого руху кульки з матеріалу з відомою густиною н у середовищі із густиною с₀ під дією сили тяжіння. Коефіцієнт в'язкості визначається по формулі

з ?= k (с-с₀)/v,

де k - постійна приладу.

Метод падаючої кульки в віскозиметрії заснований на законі Стокса, згідно якого швидкість вільного падіння твердої кульки у в'язкому необмеженому середовищі можна описати наступним рівнянням:

де V - швидкість поступальної рівномірної ходи кульки віскозиметра; r - радіус кульки; g - прискорення вільного падіння; d - густина матеріалу кульки; с - густина рідини.

Необхідно зазначити, що рівняння справедливе тільки в тому випадку, якщо швидкість падіння кульки віскозиметра досить мала і при цьому дотримується якесь емпіричне співвідношення:

.



Рис. 3.3. Метод падаючої кульки в віскозиметрії

Як і в капілярному методі віскозиметрії, необхідно враховувати виникаючі поправки на кінцеві розміри циліндрової судини віскозиметра з падаючою кулькою (висотою L і радіусом R, за умови, якщо виконується ). Такі дії приводять до рівняння для визначення динамічної в'язкості рідини методом падаючої кульки віскозиметрії:

.

На основі методу створено безліч моделей високотемпературних віскозиметрів, в яких вимірюється в'язкість розплавлених стекол і солей.

3.1.5 Вібраційна віскозиметрія

Вібраційні методи віскозиметрії засновані на вимірі швидкості загасання коливань твердого тіла (пластини приладу, закріпленої на пружному підвісі), що поміщений в досліджуване середовище. При цьому формули для розрахунку h різні залежно від конструкції приладу.

Вібраційний метод віскозиметрії базується на визначенні змін параметрів вимушених коливань тіла правильної геометричної форми, що називається зондом вібраційного віскозиметра, при зануренні його в досліджуване середовище. В'язкість досліджуваного середовища визначається за значеннями цих параметрів, при цьому зазвичай використовується градуювальна крива віскозиметра (для випадку примітивного вібраційного віскозиметра; в цілому цей принцип переноситься і на складніші прилади).

Рис. 3.4. Вібраційний віскозиметр

Введемо декілька позначень:

щ - частота коливань, ф - час коливання тонкого пружно закріпленого зонда вібраційного віскозиметра, S - площа пластини зонда віскозиметра; коливання відбуваються під дією гармонійної сили . В'язкість і густину досліджуваного середовища відповідно позначимо з і d.

Частотнофазовий варіант вібраційного методу віскозиметрії використовується для дуже в'язких рідин. В цьому випадку вимірюється частота коливань зонда віскозиметра, спочатку не зануреного (щ0) і потім зануреного (щ) в рідину при зрушенні фаз .

Для вимірювання в'язкості менш в'язких середовищ, наприклад, металевих розплавів найдоцільнишим є амплітудно-резонансний варіант вібраційного методу віскозиметрії. В цьому випадку домагаються того, щоб амплітуда А коливань була максимальною (шляхом підбору частот коливань). Тому вимірюваним параметром, по якому визначається в'язкість стає амплітуда коливань зонда віскозиметра. У загальному випадку для малих значень в'язкості маємо:

.

Врахуємо поправки С2 (сторонні сили: тертя, поверхневого натягу, лобового опору і тому подібне). Маємо кінцеву формулу методу вібраційної віскозиметрії:

.

Градуювання віскозиметра проводиться за відомими рідинами (визначаються постійні С1, С2).

Вібраційний віскозиметр в найпростішому випадку являє собою резервуар з в'язкою рідиною і деяке тіло (пластина, куля, циліндр), що проводить вимушені коливання у в'язкому середовищі.

Суть експерименту полягає у визначенні змін параметрів вимушених коливань зонда віскозиметра при зануренні його у в'язке середовище. Керуючись теорією методу вібраційної віскозиметрії, за значеннями цих параметрів визначають в'язкість середовища.

Вібраційний віскозиметр має значно велику в порівнянні з ротаційними віскозиметрами чутливість і також може бути застосований для середовищ з температурою до 2000 °C у інертній атмосфері або вакуумі за наявності як великих, так і порівняно малих мас розплавів.

В даний час для вимірювання динамічної в'язкості широко застосовують електронні вібраційні віскозиметри, в яких зонд здійснює вимушені коливання під впливом імпульсів електромагнітного вібратора з вбудованим датчиком амплітуди.

Вібраційні високотемпературні віскозиметри з електронним дистанційним керуванням можуть використовуватися в агресивних умовах.

Відносна погрішність вимірювань при використанні вібраційного віскозиметра складає ±0,5-1%. При роботі з розплавами в інтервалі, що дорівнює 700-1900°C, загальна погрішність віскозиметра збільшується і може скласти ±3-5%.

3.2 Визначення активності пектолітичних ферментів

Найчастіше віскозиметрію застосовують для визначення активності пектолітичних ферментів. Цей метод заснований на гідролізі пектину ферментним препаратом та визначенні ступеня його розщеплення за величиною зниження в'язкості. Оскільки головну роль в зниженні в'язкості відіграє ендополігалактуроназа, метод в основному характеризує активність цього ферменту.

За одиницю пектолітичної активності в цьому методі приймають таку кількість ферменту, яка при відповідних вимогах при температурі 30 °С за 10 хвилин каналізує гідроліз 1 г пектину зі зниженням в'язкості розчину на 30%.

Для визначення необхідні наступні реактиви. 1%-ий розчин пектину (найчастіше використовують яблучний пектин із вмістом метоксильних груп 5-5,5% на повітро-суху речовину. При відсутності яблучного пектину можна використовувати буряковий з відповідними показниками. Відносна в'язкість 1%-го розчину пектину при 30 °С повинна бути у межах 16-19); розчин ферменту.

Техніка визначення наступна. Сухий віскозиметр Оствальда з діаметром капіляра 0,8 мм поміщають у водяну баню з температурою 30 °С. Піпеткою вводять в нього 10 см³ 1%-го розчину пектину. Через 5 хвилин вводять необхідну кількість дистильованої води та розчин ферменту (від 1 до 5 см³). Загальний об'єм реакційної суміші у віскозиметрі повинен дорівнювати 15 см³. Після введення ферменту одразу за секундоміром відмічають початок пектолізу та одночасно ретельно перемішують вміст віскозиметра повітрям за допомогою груші, що надіта на вузьке коліно віскозиметра. Через 10 хвилин після введення ферменту заміряють в'язкість за часом витікання реакційної суміші.

Паралельно ставлять контрольний дослід визначення в'язкості (часу закінчення) вихідного розчину пектину, який проводять за такою же методикою, тільки без ферменту, а з додаванням 5 см³ води.

При аналізі малоактивних препаратів контрольне визначення необхідно проводити з ферментним розчином, інактивованим кип'ятінням в водній бані протягом 1 години.

У більшості випадків при аналізі активних препаратів для визначення беруть розчини з таким розведенням, що в'язкість їх майже не відрізняється від в'язкості води.

Водне число віскозиметра, взяте для дослідів при температурі 30 °С, складає 30-40 с.

Ступінь гідролізу пектину, що визначають за величиною зниження в'язкості В (у%), розраховують за формулою

В = (t_К-t)·100/ (t_К-t_B),

де t_К - час витікання контрольного розчину пектину з водою або інактивованим ферментом, с; t - час витікання дослідного розчину (після пектолізу), с; t_B - час витікання води, с.

Величина В повинна знаходитись у межах 20-40%. Зміною дозування ферментного препарату домагаються отримання не менш двох значень В у цих границях, одне з яких повинно бути менше 30%, а інше більше.

На підґрунті отриманих даних будують графік, по осі абсцис якого відкладають кількість ферментного препарату у міліграмах, по осі ординат - величину зниження в'язкості В (1 см = 1%). Отримані точки з'єднують прямою та інтерполюванням знаходять кількість препарату в міліграмах, яка дає зниження в'язкості на 30%.

Висновки

фермент каталізатор віскозиметрія пектолітичний

Таким чином ферменти - біологічні каталізатори - дещо відмінні від небілкових каталізаторів. Вони мають певні особливості: біологічна природа, висока ефективність, вузька специфічність, регулюємість, термолабільність, залежність активності ферментів від рН середовища та інші.

Для контролю активності ферменту на виробництві використовують різні методи, одним із яких є віскозиметрія. Вона базується на вимірі в'язкості середовищ.

Існують такі види віскозиметрії: ультразвукова, ротаційна, капілярна, за методом падаючої кульки та вібраційна.

У ферментному виробництві віскозиметрію застосовують для визначення активності пектолітичних ферментів. Цей метод заснований на гідролізі пектину ферментним препаратом та визначенні ступеня його розщеплення за величиною зниження в'язкості. Оскільки головну роль в зниженні в'язкості відіграє ендополігалактуроназа, метод в основному характеризує активність цього ферменту. Для визначення пектолітичної активності використовують віскозиметр Оствальда.

Список літератури

1. Грачёва И.М., Грачёв Ю.П. Мосичев М.С. и др. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов: Учебное пособие для вузов. - М.: Лёгкая и пищевая пром-сть, 1982. - с. 50-52.

2. Грачёва И.М. Технология ферментных препаратов. - 2-е изд. - М.: Агропромиздат, 1987. - с. 178-183.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. - М.: Медицина, 1990. - с. 115.

4. Основы биохимии: Учебник для студ. биол. спец. ун-тов / под ред. А.А. Анисимова. - М.: Выс.шк., 1986. - с. 133-140.

5. Фершт Э. Структура и механизм действия ферментов. - М.: Мир., 1980. - с. 373-388.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - М., 1989.

7. Диксон М., Уэбб Е. Ферменты: перев. с англ. - М.: Мир, 1982. - т. 1. - с. 370-375.

Размещено на Allbest.ru