Клеточная радиочувствительность

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реакция клетки на облучение. Клеточная радиочувствительность

В результате облучения, повреждающего абсолютно все внутриклеточные структуры, в клетке можно зарегистрировать множество самых разнообразных реакций -- задержку деления, угнетение синтеза ДНК, повреждение мембран и др. Степень выраженности этих реакций зависит от того, на какой стадии жизненного цикла клетки произведено облучение.

Синтез ДНК в клетке происходит в интерфазе, занимая в ней определенный промежуток времени. Это позволило разделить ннтерфазу на три периода -- период синтеза ДНК (S-период), пред- и постсинтетические периоды (соответственно G₁ и G₂) (От англ. Gap -- интервал.) Митоз, четвертый период цикла, обозначается буквой М. Продолжительность жизненного, или митотического, цикла -- время между двумя последовательными делениями клетки -- слагается из отдельных стадий, длительность которых в разных тканях варьирует относительно друг друга по величине, располагаясь, как правило, следующим образом: М < G₂ <S < G₁ (рис. III.4).

Рис. III.4. Митотическнй цикл: М - митоз, G₁ - предсннтетическнй период, S - период синтеза ДНК, G₂ - постсинтетический период. G₀ - фаза покоя (клетка может переходить в нее либо после завершения синтеза ДНК, либо по окончании митоза; в фазе покоя клетка находится до тех пор, пока некоторый стимул не побудит ее снова вступить в цикл соответственно в G₂ - или G₁ -периоды)

В активно обновляющихся тканях (эпителий ворсинок кишечника, костный мозг, кожа и др.), а также в быстрорастущих опухолях и клеточных культурах продолжительность цикла составляет от 10 до 48 ч. Наиболее продолжительны периоды G₁ и S, а самый кратковременный период -- митоз -- завершается в большинстве случаев в течение 30 -- 60 мин.

В малообновляющихся тканях большинство клеток находится в G₁-периоде, длительность которого измеряется неделями, а иногда месяцами и даже годами (например, в ЦНС), что в последнее время обусловило выделение еще одной стадии -- G₀; клетки, находящиеся на этой стадии, принято считать вне цикла, или покоящимися. Такие клетки составляют резерв репопуляции в случае гибели части клеточного пула от различных причин. Таков, например, механизм посттравматической регенерации тканей или возобновления роста опухоли после ее облучения.

Многие из лучевых реакций клетки легко переносятся клеткой, так как являются следствием повреждения множественных структур, утрата которых очень быстро восполняется или просто остается незамеченной. Такие преходящие клеточные реакции называют физиологическими или кумулятивными эффектами облучения. К ним относятся различные нарушения метаболизма, в том числе ингибирование нуклеинового обмена или окислительного фосфорилирования, слипание хромосом и др.

Как правило, подобные реакции проявляются в ближайшие сроки после облучения и с течением времени исчезают. Наиболее универсальная из них -- временная задержка (угнетение) клеточного деления, часто называемая в литературе радиационным блокированием митозов. Снижение числа делящихся клеток после облучения было замечено уже вскоре после открытия рентгеновских лучей, что и послужило одним из оснований к применению этих лучей для подавления опухолевого роста. Эта реакция к настоящему времени наиболее хорошо изучена в количественном отношении на самых разнообразных объектах в экспериментах in vivo и in vitro для большого числа нормальных клеток и тканей, а также для опухолей человека и животных.

Рис. III.5. Динамика размножения клеток после облучения в разных дозах. А и А' -- икра вьюна; Б и Б' -- яйца морского ежа; В и В' -- почкование дрожжей (по В. И. Корогоднну, 1964): A, А', 1 -- необлученные зиготы. 2, 3, 4, 5--облученные (300 Гр) сперматозоиды, яйцеклетки, сперматозоиды и яйцеклетки до оплодотворения, зигота тотчас после оплодотворения соответственно: Б, Б'.1 -- необлученные, 2, 3, 4--сперматозоиды, облученные непосредственно перед оплодотворением (1, 2, 10 Гр соответственно); В, В',1 -- необлученные. 2, 3 -- облученные 160 н 180 Гр соответственно

Проведенные эксперименты показали, что длительность задержки деления зависит от дозы ионизирующего облучения и проявляется у всех клеток облученной популяции, независимо от дальнейшей судьбы той или иной клетки -- выживет она или погибнет. Однако продолжительность этого эффекта различна у разных объектов, что наглядно представлено на рис. III.5, где сведены и проанализированы результаты экспериментов ряда исследователей. Во всех случаях после облучения деление клеток дрожжей прекращалось и возобновлялось спустя некоторое время, различное у разных объектов, но всегда растущее с дозой облучения. У каждого из объектов кривые первого пострадиационного деления имеют почти такую же форму, как и кривые соответствующих контрольных (необлученных) клеток, и лишь сдвинуты по оси абсцисс вправо. Это особенно хорошо видно при представлении данных в координатах "пробит-эффект -- логарифм времени".

(Термин "пробит" происходит от англ. probability unit -- вероятностная единица. Пробит-анализ -- количественная оценка экспериментальных данных, основанная на изучении зависимости между логарифмами доз и пробитами, соответствующими наблюдавшимся эффектам. В этих координатах S-образные или, как их называют, сигмоидные кривые выпрямляются.)

Рис. III.6 Сдвиг максимума митотической активности клеток почки человека при облучении в S-периоде (по И. Скайф v, 1969); стрелками показан сдвиг волны деления при соответствующей дозе облучения, Гр.

Многочисленные исследования показали, что для большинства изученных культур клеток задержка деления соответствует примерно 1 ч на каждый 1 Гр, т. е. около 0,6 мин на каждый сГр. Следовательно, эта реакция на облучение идентична у всех особей однородной популяции не только качественно, но и по величине, причем с увеличением дозы возрастает не доля реагирующих особей, а продолжительность задержки деления каждой облученной клетки. В этом состоит принципиальное отличие такого рода клеточных эффектов облучения от летальных поражений, анализ которых будет проведен ниже.

Время задержки деления клеток зависит и от стадии клеточного цикла, в которой находятся клетки при облучении; наиболее длительно оно в тех случаях, когда воздействию подвергаются клетки в стадии синтеза ДНК или в постсинтетической стадии, и самое короткое - при облучении в митозе, когда абсолютное большинство клеток, начав митоз, заканчивает его без задержки.

Из-за различий в длительности задержки деления, наблюдающейся на отдельных стадиях клеточного цикла, восстановление митотической активности при облучении активно пролиферирующих тканей происходит волнообразно, так как эти ткани представляют собой асинхронную клеточную популяцию, т. е. состоящую из клеток, находящихся на разных стадиях жизненного цикла.

Из рис. III.7 видно, что через 4 ч после облучения клеточное деление еще сильно подавлено, степень угнетения пропорциональна дозе. Восстановление митотической активности клетки происходит волнообразно, причем картина при всех использованных видах ионизирующих излучений однотипна.

Вскоре после первоначального падения митотический индекс достаточно резко повышается, иногда даже достигая исходного уровня, а затем вновь снижается. Это начальное повышение еще не является истинным увеличением количества митозов. Объяснением этому служит тот факт, что под влиянием облучения некоторые клетки запаздывают со вступлением в деление, что отражается в снижении митотического индекса сразу после облучения. Вероятно, эти клетки в момент облучения находились на наиболее чувствительной к излучению (по данному критерию) стадии интерфазы. Затем они начинают делиться, причем одновременно с клетками, которые к моменту облучения находились на менее чувствительной стадии, и потому вступили в митоз в обычное время. Так образуется компенсаторная волна увеличения митотического индекса, которая иногда может превышать исходные показатели. С увеличением дозы облучения и компенсаторная волна, и новое значение митотического индекса еще долго оказываются меньшими по сравнению с исходными, что объясняется подавлением способностей клеток к делению.

Рис. III.7 Динамика митотической активности костного мозга мышей после общего облучения. Цифрами у начала кривых обозначены дозы облучения

Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о роли радиационного повреждения ядра (большей, чем цитоплазмы) в механизме угнетения клеточного деления; в то же время установлено, что оно не связано с повреждением хромосом.

Можно рассматривать задержку деления как проявление неспецифического компонента реакции клеток на облучение (тем более что она наблюдается в ответ на действие многих внешних факторов), имеющее защитно-приспособительный характер.

(Американский цитолог Д. Мэзия в предисловии к монографии, посвященной физиологии клеточного деления, справедливо заметил, что "...обобщения дают возможность улавливать доказательства существования некоего общего плана (иными словами, осмысленности явления), которые может поставить нам природа".)

Суждение о защитном характере задержки митозов основано на том, что продолжительность задержки отражает меру восстановления клеток от вызванных излучением поражений, например, путем разрушения гипотетических токсинов или ресинтеза метаболитов, необходимых для деления. В этом случае следовало бы ожидать, что чем больше времени есть у клетки для восстановления, тем вероятнее, что она успешно разделится и даст жизнеспособное потомство. Однако прямые наблюдения показали, что степень задержки митозов одинакова как для гибнущих, так и для сохранивших жизнеспособность клеток. Отсутствие связи между задержкой деления и гибелью клетки подтверждается и данными о разной величине ОБЭ для этих феноменов (И. Скайф, 1969), и разнонаправленным изменением радиочувствительности и задержки деления по стадиям цикла.

До сих пор нет достаточных данных для того, чтобы однозначно отнести задержку деления к проявлениям радиационного повреждения множественных внутриклеточных структур или оценить ее как защитную реакцию клеток на их повреждение;

Все сказанное относится к временной задержке первого пострадиационного деления, наблюдаемой после облучения в определенном, хоти и достаточно большом диапазоне доз (для большинства клеток млекопитающих в пределах 10 Гр). Еще менее изучен механизм задержки деления при повторных облучениях, а потому и более затруднена интерпретация.

Описываемую реакцию задержки деления следует отличать от полного подавления митоза, наступающего после воздействия больших доз, когда клетка значительное время продолжает жизнь, но необратимо утрачивает способность к делению. В результате такой необратимой реакции на облучение часто образуются патологические формы гигантских клеток, иногда даже содержащие несколько наборов хромосом вследствие их редупликации в пределах одной и той же не разделившейся клетки (эндомитоз).

Среди многих проявлений действия излучения на жизнедеятельность клетки подавление способности к делению является наиболее важным. В связи с этим под клеточной гибелью, или летальным эффектом облучения, в радиобиологии понимают утрату клеткой способности к пролиферации. Наоборот, выжившими клетками считают те, которые сохранили способность к неограниченному размножению, т. е. к клонообразованию. Таким образом, речь идет здесь о репродуктивной гибели клеток. Репродуктивная форма лучевой инактивации клеток наиболее распространена в природе, Она же и лучше изучена методами количественной радиобиологии в связи с тем, что ее можно наблюдать при культивировании клеток вне организма.

При наблюдении за облученными клетками линии L (мышиных фибробластов) было установлено, что их гибель происходит как в процессе 1-го пострадиационного деления, так и во 2-м, 3-м и 4-м митозах. На рис. 17 схематически показана судьба потомков одной клетки, облученной в дозе 2 Гр. Их гибель (фрагментация) наблюдалась только через 70 и 140 ч после облучения исходной клетки, т.е. соответственно после 2-го и 3-го деления. После облучения в дозе 4 Гр клетки линии L более чем в 80% случаев успешно заканчивали 1-е пострадиационное деление, но зато вероятность деления дочерних клеток (1-я генерация) и "внучек" (2-я генерация) составляла около 30%; остальные 70 % клеток, начав деление, погибали.

Другая разновидность репродуктивной гибели потомков облученных клеток -- формирование так называемых гигантских клеток возникающих в результате слияния двух соседних, чаще "сестринских" клеток. Такие клетки способны не более чем к 2--3 делениям, после чего они погибают. Гигантские клетки могут возникнуть без слияния при длительной задержке истинного деления (эндомитоз) облученных клеток или их потомков. Такие клетки также нежизнеспособны.

Какие же реакции приводят делящиеся и малодифференцированные клетки к гибели? Основной причиной репродуктивной гибели клеток являются структурные повреждения ДНК, возникающие под влиянием облучения. Они легко обнаруживаются, в частности, цитологическими методами в виде так называемых хромосомных перестроек или аберраций хромосом. При этом разорванные хромосомы могут соединяться неправильно, а очень часто отдельные фрагменты их просто теряются при делении. Возникающие хромосомные перестройки весьма разнообразны. Отметим лишь основные виды аберраций: фрагментация хромосом, формирование хромосомных мостов, дицентриков, кольцевых хромосом, появление внутри- и меж хромосомных обменов и т.п. Часть аберраций, как, например, мосты, механически препятствует делению клетки; появление обменов и ацентрических фрагментов приводит к неравномерному разделению хромосом и утрате генетического материала, вызывающей гибель клетки из-за нехватки метаболитов, синтез которых кодировался ДНК утраченной части хромосомы.

Рис. III.8. Результаты наблюдения за потомками клетки линии L, облученной на 5-стадии (по К. tpottv, 1969): 1 -- гибель клетки. 2 -- слияние двух клеток с образованием гигантской клетки

Долю клеток с хромосомными перестройками часто используют в качестве количественного показателя радиочувствительности, так как, с одной стороны, число таких перестроек четко зависит от дозы облучения, а с другой -- они, отражая летальное действие излучений, хорошо коррелируют с выживаемостью клеток.

Итак, рассмотренные виды лучевой инактивации клеток, наступающей после первого пострадиационного митоза и ведущей к прекращению клонобразования, называют репродуктивной или митотической формой гибели. Другая форма радиационной инактивации клеток -- интерфазная гибель -- наступает до вступления клетки в митоз. При очень больших дозах облучения это происходит непосредственно "под лучом" или вскоре после облучения. В диапазоне умеренных доз (до 10 Гр) гибель наступает в первые часы после облучения и может быть зарегистрирована в виде различных дегенеративных изменений клетки; чаще всего под микроскопом через 2--6 ч можно наблюдать клетки с резким пикнозом ядра и фрагментацией хроматина. Для размножающихся клеток в культуре ткани, а также для большинства клеток соматических тканей взрослых животных и человека интерфазная гибель регистрируется только после облучения при дозах в десятки и сотни грей. При меньших дозах наблюдается репродуктивная форма гибели, причиной которой, как упоминалось, в большинстве случаев являются структурные хромосомные повреждения. Количественный метод определения выживаемости клеток, млекопитающих после облучения впервые был разработан в 1956 г. Т. Паком и П. Маркусом для культуры клеток HeLa. Так как и по сей день он является основным методом, применяемым в количественной радиобиологии, будет подробно рассмотрен его первоначальный вариант, а также описаны некоторые дальнейшие его усовершенствования. Клетки снимают со стенок культурального сосуда раствором трипсина или версена (рис. III.9), пипетируют до получения взвеси из строго одиночных клеток и рассеивают по чашкам Петри так, чтобы в каждую чашку попало заданное количество клеток. На каждую дозу облучения и контроль берут по 5--8 чашек. После посева чашки с клетками облучают при нескольких дозах вплоть до 10-- 20 Гр и выращивают в термостате 7--14 дней до получения видимых невооруженным глазом колоний, содержащих не менее 50 клеток. Следовательно, облученная, но сохранившая жизнеспособность клетка и ее потомки должны совершить не менее шести последовательных делений. Выживаемость клеток при каждой дозе облучения определяют как отношение числа колоний, выросших в облученных чашках, к числу колоний, выросших в контроле (рис. III.9).

Рис. III.9. Техника клонирования клеток для определения их выживаемости после облучения (по методу Т. Пака, Р. Маркуса): / -- в две серии чашек Петри высевают одинаковое число клеток; // опытные чашки облучают, контрольные -- нет; /// через 10--14 дней выжившие клетки делятся и образуют видимые колонии (клоны)

Полученная по такому методу кривая выживания растущих в культуре клеток опухоли Эрлиха (линии EL.D) приведена на рис. III.10.

Рис. III.10. Выживаемость клеток ELD при действии г-излучения ('"Cs) в культуре: точками показаны результаты отдельных экспериментов

В настоящее время радиобиологи имеют возможность в эксперименте количественно оценивать радиочувствительность многих тканей и опухолей, сравнивая кривые выживания клеток после облучения (в том числе in vivo).

Существуют и другие критерии радиочувствительности, хорошо коррелирующие с выживаемостью, но прежде чем они будут описаны, необходимо остановиться на общем анализе кривых выживания.

Кривые выживания самых различных клеток при действии рентгеновского, гамма- или любого другого редко ионизирующего излучения имеют форму, аналогичную приведенной на рис. III.10.

Рис. III.11. Кривые выживания клеток (кривые доза--эффект) при действии плотно ионизирующего излучения. А -- линейные координаты; Б -- полулогарифмические координаты: пунктиром обозначена 37%-ная выживаемость

Рис. III.12 Основные параметры кривой выживания (объяснение см. в тексте)

В системе полулогарифмических координат (дозу облучения откладывают по шкале абсцисс в нелинейном масштабе, а выживаемость на оси ординат в логарифмическом) кривая состоит из так называемого плеча и линейного участка, начинающегося обычно после доз 3--5 Гр.

Для упрощения последующих рассуждений необходимо отметить, что при облучении клеток плотно ионизирующими частицами кривые их выживания не имеют плеча и в полулогарифмических координатах прямолинейны на всем своем протяжении (рис. III.11).

Такая зависимость хорошо описывается уравнением вида

,

где N -- число выживших клеток из общего их числа, D -- любая доза облучения, D₀ -- доза, при которой доля живых клеток уменьшается в сравнении с исходной в е раз: N/N₀ = е^-1 = 1/2,71 = 0,367. Таким образом, при дозе облучения, равной D₀, выживает ~37%, а погибает ~63 % клеток.

Величина D₀ служит мерой радиочувствительности клеток и определяется по кривой выживания как доза, при которой выживает ~37 % клеток от исходного количества. Иногда поэтому ее называют D₃₇, что в случае экспоненциальных кривых одно и то же, но для кривых, имеющих плечо, величины D₀ и D₃₇, различны (рис. III.10).

Графическое представление данных (см. рис. III.8 - III.10) определяет бытующее иногда представление о существовании некоей "критической дозы", при которой якобы погибают все клетки, так как экстраполяция кривой выживания в полулогарифмическом масштабе приводит к пересечению с осью абсцисс. На самом деле при возрастании дозы облучения фракция выживших клеток (или вероятность выживания) лишь асимптотически стремится к нулю.

Представление о критической дозе, однако, не лишено смысла: при облучении ткани, где клетки находятся в близком контакте друг с другом, те из них, которые пережили облучение, могут погибнуть за счет автолиза и выхода ферментов из соседних клеток. Есть основания полагать, что снижение фракции выживших клеток до Ю^-6 -- Ю^-7 (при этом в 1 см³ остается от 100 до 1000 живых клеток) приводит к полной гибели всех клеток под действием других (не связанных с облучением) процессов, и соответствующая доза облучения может рассматриваться как критическая. Для клеток, не контактирующих друг с другом, например находящихся в асцитной жидкости лейкозных клеток, представление о критической дозе неприменимо.

Кривые, имеющие плечо (см. рис. III.8, III.10), кроме величины D₀, определяющей наклон ее линейного участка, характеризуются еще и так называемым экстраполяционным числом п. Оно определяется в месте пересечения ординаты экстраполированным прямолинейным участком кривой выживания. Здесь величина D₀ определяется как инкремент (приращение) дозы, снижающей выживаемость в е раз на прямолинейном участке кривой выживания.

Мерой способности клеток к репарации является величина плеча, оцениваемая квазипороговой дозой D_q. Она измеряется длиной отрезка прямой, параллельной оси абсцисс, проведенной на уровне 100%-ной выживаемости от оси ординат до точки пересечения с экстраполированным участком кривой выживания (см. рис. III.10).

Летальные реакции клеток имеют специфическую особенность, отличающую их от рассмотренных выше обратимых преходящих клеточных эффектов.

Эта особенность состоит в том, что с увеличением дозы облучения увеличивается не только (и даже не столько) степень поражения всех облученных клеток, как это имеет место, например, в отношении задержки деления, сколько доля пораженных, т. е. погибших, клеток. Иными словами, с одной стороны, даже при самых малых дозах может быть зарегистрирован экстремальный эффект - гибель клетки (разумеется, с малой вероятностью), с другой - и при очень больших дозах (опять же с малой вероятностью) могут сохраниться отдельные жизнеспособные клетки.

Одним из часто используемых количественных методов оценки летального поражения пролиферирующих клеток служит подсчет числа клеток с аберрациями хромосом.

Согласно данным метафазного анализа (табл. III.1) существует полный параллелизм в изменении выживаемости клеток и долей безаберрантных клеток при облучении клеточной культуры, синхронизированной на отдельных периодах интерфазы, а также в условиях защиты или сенсибилизации. Из табл. III.1 видно, что при дозах облучения, различающихся даже в 9 раз, но вызывающих одно и то же подавление жизнеспособности клеток, одинаковой оказывается и доля безаберрантных клеток.

Из табл. III.1 также следует, что доля клеток без хромосомных аберраций несколько меньше доли выживших клеток, способных к образованию колоний. Это может быть объяснено тем, что некоторые аберрации обусловливают гибель только одного из потомков облученной клетки, вызывая образование неполноценных абортивных колоний. Близкое соответствие кривых гибели и снижения числа клеток аберраций хромосом наблюдается и при учете аберраций не в метафазе, а в анафазе (см. также рис. III.11).

Таблица III.1. Корреляция между аберрациями хромосом и выживаемостью клеток китайского хомячка при разных условиях облучения

Рис. III.11. Выживаемость (A) и доля клеток без аберраций хромосом (Б) при облучении культуры клеток китайского хомячка: 1 -- г-нзлучение ¹³⁷Cs, 2 -- протоны 200 МэВ

На рис. III.11 в отличие от данных, представленных в табл. III.1, число клеток без аберраций здесь несколько больше числа выживших клеток. Это определяется тем, что анафазный метод выявляет не все аберрации (по некоторым данным, в два раза меньше, чем метафазный), например, потому, что фрагменты увлекаются расходящимися хромосомами в анафазные "шапки", где их нельзя обнаружить. Но и в этом случае существует соответствие характера кривых, а одинаковое снижение эффекта облучения при переходе от г-излучения к протонам высоких энергий, выявляемое по обоим критериям, также свидетельствует о связи аберраций хромосом с клеточной гибелью. Отсутствие полного соответствия между выживаемостью клеток и возникновением аберраций (во многих работах отмечено 20 -- 30%-ное расхождение между уровнем погибших и аберрантных клеток) не умаляет роли аберраций хромосом в качестве пригодного количественного критерия клеточной радиочувствительности.

При анализе причин летального радиационного поражения клетки следует, прежде всего, рассмотреть вопрос об относительной радиочувствительности двух основных ее компонентов -- ядра и цитоплазмы.

Можно утверждать, что результаты абсолютного большинства многочисленных исследований дали весьма убедительные доказательства о несравненно большей радиочувствительности ядра и решающей роли его поражения в исходе облучения клети. Поскольку и сейчас приходится встречаться с противниками этой точки зрения, ниже будут приведены наиболее убедительные примеры доказательства ее справедливости. Рассмотренная выше корреляция между долей клеток с хромосомными аберрациями и летальным эффектом свидетельствует в пользу определяющей роли ядерного материала в исходе лучевого поражения клетки. Однако этот факт сам по себе еще нельзя однозначно интерпретировать как следствие большей радиочувствительности ядра, ибо можно предположить, что повреждения хромосом могут происходить и в результате опосредованных цитоплазматических влияний.

Рис. III.12. Схема опытов Б. Л. Астаурова (объяснение см. в тексте)

Прямые доказательства большей радиочувствительности ядра по сравнению с цитоплазмой были получены позже и другими исследователями в опытах с прицельным облучением ядра на объектах, в клетках которых оно строго фиксировано. Оказалось, например, что попадание уже одной б-частицы в ядро оплодотворенного яйца насекомого (наездника) вызывает гибель зародыша, которая в случае облучения цитоплазмы яйца регистрируется лишь после прохождения 15 млн. б-частиц.

Особый интерес представляют также эксперименты, в которых с помощью микропучка протонов (90% частиц находилось в поле диаметром 5 мкм) было показано, что структурные повреждения хромосом в клетках наступают уже после непосредственного их облучения 15--20 протонами, в то время как при облучении различных участков цитоплазмы сотнями тысяч частиц его влияния не обнаружено.

Приведенные примеры наглядно демонстрируют значительно большую радиочувствительность ядра по сравнению с цитоплазмой, однако они не отвергают роль последней в радиационном поражении ядерного аппарата. Более того, существует достаточно много экспериментальных данных о зависимости проявления и размера ядерных нарушений от степени облучения цитоплазмы, что является следствием сложных и пока малоизученных ядерно-цитоплазматических отношений. Важно, что для разных объектов удельный вес прямого поражения ядра и опосредованных влияний может сильно различаться, отражая особенности жизнедеятельности целых клеток и функционирования их основных органелл.

Итак, подводя итог современному состоянию этого вопроса, следует подтвердить правильность точки зрения о решающей роли поражения ядра как первопричины лучевой гибели клетки и его несравненно большей по сравнению с цитоплазмой радиочувствительности. Однако в реализации летального клеточного эффекта несомненна и роль цитоплазмы, которая выражена неодинаково у разных объектов и зависит от их функционального состояния и внешних условий.

Какие же внутриядерные структуры ответственны за жизнеспособность клетки? Естественно, что при этом важны события и поражения, возникающие и определяемые при дозах до 10 Гр, существенных для гибели млекопитающих, ибо в принципе не существует структур, не поражаемых при облучении: все зависит от использованной дозы.

В клетке содержится несколько десятков молекул ДНК, имеющих очень большую длину. (У млекопитающих на клетку приходится 3·10⁹ -- 6·10⁹ пар нуклеотидов, общая длина молекул ДНК при этом составляет от 1 до 2 м.). ДНК постоянно связана с белками, которые участвуют в поддержании структуры интерфазного хроматина, формировании хромосом и переносе генетической информации.

Облучение вызывает различные повреждения ДНК и ее комплексов. К их числу относят разрывы молекулы ДНК, образование щелочно-лабильных связей, потерю оснований и изменения их состава, изменения нуклеотидных последовательностей, сшивки ДНК--ДНК и ДНК--белок, нарушения комплексов ДНК с другими молекулами.

Различают одиночные разрывы, когда связь между отдельными атомными группировками нарушается в одной из нитей двунитчатой молекулы ДНК, и двойные, когда разрыв происходит сразу в близких участках двух цепей, что приводит к распаду молекулы. При любом разрыве нарушаются считывание информации с молекулы ДНК и пространственная структура хроматина.

Одиночные разрывы не приводят к поломкам молекулы ДНК, так как разорванная нить прочно удерживается на месте водородными, гидрофобными и другими видами взаимодействий с противоположной нитью ДНК и, кроме того, структура довольно хорошо восстанавливается мощной системой репарации. Многие авторы поэтому склонны думать, что одиночные разрывы сами по себе (если они не переходят в двойные) не являются причиной гибели клеток.

При дозах до 20 Гр двойные разрывы являются следствием одновременного повреждения обеих нитей ДНК. С увеличением дозы облучения, более того, возрастает вероятность перехода одиночных разрывов в двойные, так как увеличивается возможность того, что независимые разрывы в противоположных цепях возникают друг против друга, При действии излучений с небольшой плотностью ионизации (г- и рентгеновское излучение, быстрые электроны) 20--100 одиночных разрывов вызывают один двойной.

Плотно ионизирующие излучения вызывают значительно большее число двойных разрывов. Такие виды лучевого поражения макромолекул удается регистрировать непосредственно после облучения в виде аберраций хромосом.

Расчеты показывают, что уже при дозе 1 Гр в каждой клетке человека повреждается 5000 оснований молекул ДНК, возникает 1000 одиночных и 10 - 100 двойных разрывов, каждый из которых может стать причиной возникновения аберрации.

Исходя из этих представлений, выживаемость клеток во многих случаях может быть описана с помощью, так называемой линейно-квадратичной модели Чедвика и Линхаутса. Разрабатывая модель, авторы исходили из того, что при облучении клеток летальными являются двойные разрывы ДНК, которые появляются либо в результате односменного разрыва обеих спиралей ДНК одной ионизирующей частицей, либо в результате совпадений двух независимо образовавшихся одиночных разрывов комплементарных спиралей, оказавшихся напротив друг друга.

Согласно этой модели выживаемость клеток S выражается формулой

,

где D - поглощенная доза, а б и в -- параметры, характеризующие вероятность индукции и репарации разрывов ДНК в облученных клетках. (Данная модель позволяет во многих случаях более точно аппроксимировать экспериментальные данные о выживаемости клеток, чем при использовании формулы с параметрами D₀ и n. Однако наглядность последних и удобство их оценки определяет более широкое использование параметров D₀ и n, чем б и в. )

Кроме образования разрывов в облученной ДНК нарушается структура оснований, прежде всего тимина, что увеличивает число генных мутаций. Отмечается образование сшивок между ДНК и белком нуклеопротеинового комплекса.

Разработанные к настоящему времени методы позволяют в ряде случаев обнаружить радиационные нарушения в структуре интерфазного хроматина уже при облучении клетки дозой в несколько грей. Так, вязкость интерфазного хроматина в клетках тимуса уменьшается после облучения в дозе 1--2 Гр, а при дозе 1 Гр отмечается подавление синтеза РНК, вызванное нарушениями дезоксирибонуклеопротеинового комплекса.

В последние годы интенсивно исследуется ДНК-мембранный комплекс -- сложное структурное образование в области соединения нитей ДНК с ядерной мембраной, в состав которого помимо ДНК входят белок и липиды (рис. III.13). Как показывают данные М. Элкинда и соавторов (1972), распад комплекса и деградацию молекул ДНК можно зафиксировать после облучения клеток китайского хомячка при дозе всего 2 Гр .

Помимо структурных нарушений ДНК в облученной клетке наблюдается нарушение регуляции, прежде всего выдачи в цитоплазму информации от ДНК, а также нарушение функционирования многочисленных внутриклеточных мембран. В этом проявляется роль внеядерных органелл, а также сложных взаимоопределяющих влияний ядра и цитоплазмы.

Многие сложные процессы клеточного метаболизма протекают именно на мембранах, так как последние позволяют обеспечить нужное пространственное разделение реагирующих молекул. Не удивительно, что радиочувствительными оказываются именно те биохимические процессы, для которых необходима пространственная организация участвующих групп ферментов. Снижение энергетического обмена клетки, вызванное поражением митохондрий, в отдельных случаях удается наблюдать после облучения в дозах, равных нескольким Греям. Кроме того, нарушение целостности мембран может приводить к сдвигу ионного баланса клетки из-за выравнивания концентраций калия и натрия (в норме клетка накачивает внутрь калий и высвобождает в окружающую среду натрий), что также неблагоприятно отражается на ходе метаболических процессов.

Рис. III.13. Основные виды структурных радиационных повреждений:

1 - однонитчатые (одиночные) разрывы в молекуле ДНК, 2 - двунитчатые (двойные) разрывы ДНК, 3 - нарушение связи ДНК с белком, 4 - повреждение структуры ДНК мембранного комплекса, 5 - разрушение ядерной мембраны, 6 - повреждение мнтохондриальной мембраны

Наконец, важным последствием облучения является изменение эпигеномной (не связанной с ядерным материалом) наследственности клетки, носителем которой служат различные цитоплазматические органеллы. При этом снижается функциональная активность потомков облученных клеток, в чем может состоять одна из причин отдаленных последствий облучения. Однако главной причиной репродуктивной формы гибели клеток при облучении является повреждение ее генетического аппарата.

Многие радиационные повреждения репарируются. Здесь это явление будет рассмотрено на клеточном уровне. Феномен пострадиационного восстановления обусловлен тем, что при облучении в клетках, среди прочих, возникают и такие повреждения, которые обычно приводят клетку к гибели, но при определенных условиях могут быть устранены системами ферментативной репарации. Такие повреждения принято называть потенциальными. Их дальнейшая судьба после возникновения двоякая: либо они репарируются, и тогда клетка выживает, либо реализуются, и тогда она гибнет. Термин потенциальное повреждение -- чисто формальное, феноменологическое понятие, так как не определяет какое-либо конкретное молекулярное повреждение, а потому может применяться к любому виду радиационных поражений. В отношении репродуктивной гибели клеток наиболее изучены два вида потенциальных повреждений - сублетальные и потенциально летальные, различающиеся по способу их выявления.

Сублетальные повреждения выявляют методом фракционированного облучения, а потенциально летальные -- по изменению выживаемости клеток под влиянием изменения условий, в которых они находятся в первые часы после облучения. Например, не исключено, что часть двойных разрывов ДНК, образовавшихся при облучении клеток в предсинтетический период, может быть восстановлена за время, оставшееся до репликации ДНК, а те из них, что клетка не успела "залечить" до момента синтеза ДНК, становятся летальными и вызывают ее гибель, образуя аберрации хромосом. Очевидно, что эффективность репарации, т. е. долю выживших клеток, можно увеличить, если искусственно удлинить период G₁.

Влияние условий пострадиационного культивирования на последующую судьбу клеток показано многими авторами на различных объектах и в разные годы. Ф. Шерман и Г. Чейз еще в 1949 г. обнаружили увеличение выживаемости облученных дрожжей в том случае, если помещать их на питательную среду не сразу после облучения, а выдержав некоторое время в буферном растворе. Только в 1959 г. В. И. Корогодину в четко поставленном эксперименте удалось воспроизвести тот же феномен, а главное, правильно объяснить его, доказав реальность существования истинного пострадиационного восстановления, что было зарегистрировано в качестве открытия. Соответствующие опыты столь изящны по своей простоте и убедительности, что могут служить примером экспериментального мастерства. После г-облучения дрожжей штамма Мегри-139-В в дозе 1.2 кГр суспензию клеток разводили 1:10 000 и делили на две части. Из одной производили посев на питательную среду в чашки Петри сразу после облучения и оценивали выживаемость, подсчитывая колонии через 96 ч инкубации при температуре 30? С. Другую половину суспензии выдерживали после облучения в течение 48 ч в голодной среде при той же температуре, а затем рассеивали по чашкам. Оказалось, что в первом случае выживало лишь около 0,2 % облученных клеток, во втором - выживаемость наблюдалась почти у 40 %, причем во всех изученных пробах. Результаты этих опытов, схема которых приведена на рис. III.14, можно рассматривать как прямое доказательство реальности пострадиационного восстановления дрожжевых клеток, способность к которому "внутренне присуща" облученным клеткам, и не зависит от наличия в популяции нелетально пораженных особей.

Рис. III.14. Схема опыта В. И. Корогоднна, доказывающая реальность существования пострадиационного восстановления дрожжевых клеток

Влияние условий пострадиационного культивирования клеток млекопитающих на их последующую судьбу продемонстрировано С. Н. Александровым (1959) на клетках рака молочной железы, выращиваемых в разных температурных условиях, а позднее И. М. Пархоменко (1963), которая помещала облученные клетки в фосфатный буфер или ингибировала синтез белка.

Во всех этих примерах речь идет о длительно (в течение нескольких часов) протекающих процессах -- медленное восстановление. Hapяду с ними в клетке возникает и другой тип потенциально летальных повреждений, которые реализуются в летальные в течение нескольких минут после облучения. Как показали опыты У. Деви (1972), реализация такого типа поражений в клетках китайского хомячка происходит в условиях нормального метаболизма; снижение температуры среды до 20°С во время или сразу после облучения затормаживает процессы реализации, но не влияет на одновременно идущие восстановительные реакции, в результате чего поражение клеток уменьшается.

В 1981 г. А. В. Глазуновым и Ю. Г. Капульцевичем у дрожжей обнаружено и быстрое восстановление. Оказалось, что выживаемость диплоидных дрожжей при высеве их после облучения на питательную среду, содержащую 8 или 10% NaCl, зависит от температуры во время облучения: понижение температуры с 20 до 3 - 0°С приводит к существенному снижению выживаемости. Выдерживание клеток, облученных при 0°С, в воде при 28°С уже через 30--40 мин приводит к быстрому повышению выживаемости.

Эффект быстрого восстановления жизнеспособности нельзя обнаружить, облучая клетки при комнатной температуре или высевая их на стандартную питательную среду, так как в этих условиях восстановление успевает завершиться. Этот тип пострадиационного восстановления у дрожжей вносит большой вклад в регистрируемую выживаемость этих клеток в стандартных условиях (при высеве облученных клеток на стандартную питательную среду) в отличие от медленного пострадиационного восстановления.

Рис. III.15. Быстрое (1) и медленное (2) восстановление жизнеспособности диплоидных дрожжей Saccharomyces cerevisiae после г-облучения в дозе 40 Гр

Для примера на рис. III.15 показана выживаемость дрожжей на солевой (10 % NaCl) (кривая 1) и стандартной (кривая 2) питательных средах в зависимости от времени выдерживания клеток в воде при 28? C. В первые 30--40 мин происходит быстрое увеличение выживаемости клеток на солевой среде до постоянного значения, которое сохраняется в течение последующих одного - двух часов, что соответствует завершению быстрого пострадиационного восстановления; дальнейший рост выживаемости обусловлен медленным восстановлением, заканчивающимся через 40 - 50 ч. При высеве облученных клеток на стандартную питательную среду (без NaCI) можно наблюдать лишь медленное восстановление жизнеспособности.

Быстрое восстановление наблюдали как после г-облучения, так и после облучения б-частицами ²³⁸Pu. Рассматриваемый тип восстановления, как и медленное, отсутствует у гаплоидных дрожжей, с чем авторы связывают повышенную радиочувствительность гаплоидных дрожжей по сравнению с диплоидными.

Придавая большое научное и принципиальное значение рассмотренному феномену репарации потенциально летальных повреждений дрожжевых клеток, где он так сильно выражен, следует иметь в виду, что вклад такого типа репарации в повышение выживаемости клеток млекопитающих оказывается несоизмеримо меньшим. В экспериментах in vitro показано, что выживаемость многих видов клеток млекопитающих за счет восстановления от потенциально летальных повреждений может быть повышена не более чем в 2--3 раза (в зависимости от дозы).

В настоящее время еще не разработаны методы количественной оценки репарации потенциально летальных повреждений непосредственно in vivo, однако в косвенных экспериментах получены убедительные данные о реальности этого процесса и в организме. На многих перевивных опухолях экспериментальных животных показано, что выживаемость опухолевых клеток, оцениваемая in vitro, зависит от времени их рассева после облучения самих опухолей in vivo. Так, например, выживаемость клеток асцитной или солидной опухоли Эрлиха при посеве клеток не сразу, а через 2 ч после облучения в дозе 10 Гр возрастает вдвое, а при посеве клеток некоторых фибросарком через 6 ч после облучения последних она увеличивается в 2--5 раз. Наблюдаемое в этих экспериментах возрастание выживаемости происходит благодаря репарации части потенциально летальных повреждений, что свидетельствует о существовании аналогичного процесса и в организме, количественное выражение которого, по-видимому, может различаться у разных тканей.

Восстановление клеток китайского хомячка от сублетальных повреждений полностью проходит за 2 - 3 ч. У других клеток этот интервал может быть несколько большим; например, у клеток костного мозга мышей он равен 5 - 6 ч.

Характер кривых выживаемости клеток при фракционированном воздействии.

Рис. III.16. Восстановление плеча на кривой выживания клеток лимфомы мышей при повторном облучении (по Дж. Толмачу, 1970}: 1 - однократное облучение, 2 - повторное облучение через 4 ч после первого

На рис. III.16 представлены результаты соответствующих экспериментов, свидетельствующие, что при повторном облучении клеток, сохранивших жизнеспособность после первого облучения, форма кривой их выживаемости (2) повторяет соответствующую кривую при однократном облучении (1). На ней вновь возникает плечо (величина которого при полном восстановлении не отличается от регистрируемого при первом облучении), а наклон (т. е. D₀) не изменяется. Аналогичным образом величины указанных параметров не изменяются и при многократном облучении, что проверено на разнообразных клетках в культуре ткани.

Иными словами, радиочувствительность выживающих после облучения клеток не отличается от контрольных, так как степень их восстановления (по данному критерию) не уменьшается при повторных экспозициях.

Эффективность восстановления (ЭВ) от сублетальных повреждений оценивают по величине так называемого фактора восстановления -- отношения выживаемости клеток при фракционированном облучении к выживаемости при однократном облучении, или по величине разности доз двукратного (D₂) и однократного (D₁) облучения, требуемых для достижения одинакового эффекта (ЭВ = D₂ - D₁). В случае дробления дозы на N фракций формула имеет вид: ЭВ = (D₂ - D₁)(N -- 1). Величина фактора восстановления зависит от собственной интенсивности восстановления и от скорости перехода клеток в более чувствительные фазы цикла, причем эти процессы противоположно влияют на радиочувствительность клеток в момент 2-го облучения.

Фактор репарации сильно зависит также от дозы облучения, причем как от первого, так и от последующих. Если доза недостаточно велика и не выходит за пределы D_q, репаративные возможности клетки не могут полностью выявиться и фактор репарации невелик.

Способность к восстановлению при фракционированном облучении хорошо коррелирует с величиной плеча, поэтому такие параметры кривой выживания, как п и особенно D_q, позволяют предсказать степень поражения различных тканей при повторных облучениях, что и используют на практике. Отсутствие плеча на кривой выживания, как это имеет место, например, при воздействии плотноионизирующими излучениями или при использовании некоторых модифицирующих агентов, свидетельствует об ингибировании процессов репарации или образовании нерепарируемых повреждений.

Наиболее изучена репарация структурных повреждений ДНК, которым приписывают большую роль в клеточной гибели. Такие повреждения ДНК, как одно- и двунитевые разрывы, могут быть количественно определены в разное время после облучения специальными методами, например, с помощью седиментации ДНК в градиенте плотности сахарозы после мягкого лизиса клетки.

Основные типы репарации.

По времени осуществления различают дорепликативную, пострепликативную и репликативную репарации.

Дорепликативная репарация (до этапа удвоения ДНК) может происходить путем воссоединения разрывов, а также с помощью удаления (эксцизии) поврежденных оснований. В воссоединении одиночных разрывов участвует несколько ферментов. В простейшем случае разрывы могут быть воссоединены лигазой. В других ситуациях требуется полная ферментативная система репарации, включающая специфические эндонуклеазы, экзонуклеазы, ДНК-полимеразу, ДНК-лигазу, а также вспомогательные ферменты, обеспечивающие подготовку концов ДНК для заключительного акта репарации -- лигазного воссоединения.

Исследованиями, проведенными на бактериальной ДНК, выявлены три типа репарации одиночных разрывов -- сверхбыстрая, быстрая и медленная. Сверхбыстрая завершается в течение 1--2 мин и обеспечивается одной ДНК-лигазой. Быстрая репарация, осуществляемая с помощью ДНК-полимеразы 1, воссоединяет 90% разрывов, остающихся после сверхбыстрой репарации. Время воссоединения половины разрывов составляет в зависимости от температуры от 1 до 10 мин. Медленная репарация завершается за 40--60 мин, воссоединяя около двух разрывов на каждую цепь ДНК, оставшихся после сверхбыстрой и быстрой репараций.

Феномен репарации двухнитевых разрывов в ДНК впервые был обнаружен у Micrococcus radiodurens, а в последние годы показан и на клетках млекопитающих. В клетках HeLa полное восстановление молекулярной массы ДНК наступает в течение 2,5 ч пострадиационной инкубации. Механизм этого вида репарации неясен, а сам эффект восстановления двойных разрывов долго вообще не удавалось наблюдать, хотя в последние годы он был показан в ряде лабораторий.

Наряду с разрывами ДНК после облучения возникают множественные повреждения оснований, последние ликвидируются системой эксцизионной репарации, проходящей с помощью репаративного синтеза, который представляет собой многоэтапный процесс типа выщепление - замещение. В начале повреждение узнается специфической г-эндонуклеазой, после чего происходит выщепление (инцизия) поврежденного участка вблизи измененного основания, затем - экзонуклеотическая деградация поврежденной цепи с захватом смежных неповрежденных нуклеотидов и, наконец, - репаративный синтез в области образовавшегося дефекта при участии ДНК-полимеразы 1 и полинуклеотидлигазы комплементарного участка неповрежденной цепи ДНК в качестве матрицы (шаблона).

Пострепликативная репарация постулируется на основании того факта, что некоторые клетки млекопитающих выживают при большой дозе облучения, несмотря на пониженную способность к удалению пиримидиновых димеров. Механизм этого вида репарации точно не изучен, предполагают разные варианты синтеза ДНК на поврежденной матрице.

Репликативная репарация -- восстановление ДНК в процессе ее репликации. Этот тип репарации осуществляется удалением в ходе репликации повреждений в зоне точки роста цепи либо продолжающейся элонгацией в обход повреждений.

К настоящему времени, несмотря на значительный прогресс в изучении проблемы репарации, нерешенными остаются многие вопросы, касающиеся молекулярных механизмов этого процесса и его роли в пострадиационной выживаемости клеток. Результаты соответствующих экспериментов показывают, например, что связь восстановления жизнеспособности клетки с репарацией одиночных разрывов ДНК не безусловна. С одной стороны, последняя заканчивается в течение получаса, т. е. быстрее, чем восстанавливается сама клетка, а с другой -- полная репарация разрывов наблюдается и при очень больших дозах, составляющих десятки грей, когда выживают лишь одиночные клетки. Еще нет строгих данных о том, что "отремонтированная" ДНК обладает абсолютно теми же свойствами, что и исходная. (В равной степени это относится и к восстановлению клеток, регистрируемому по их выживаемости, ибо при этом неизвестна функциональная активность таких выживших клеток, а тем более судьба их потомков в отдаленные сроки.)

Как уже было показано, репарация повреждений ДНК - процесс метаболический; она осуществляется ферментами, постоянно присутствующими в клетке, участвующими, как в ее нормальном метаболизме, так и в реакциях восстановления от различных (не только радиационных) повреждений. Эти мощные репарационные системы, по всей видимости, ликвидируют и большую долю радиационных повреждений ДНК.

Поскольку пострадиационная репарация -- процесс ферментативный, ее интенсивность, а, следовательно, и судьба облученной клетки зависят от общего уровня клеточного метаболизма.

Для работы ферментов репарации требуется энергия. Если образование АТФ подавить, например, фторидом натрия, то скорость восстановления снижается. При небольшом уменьшении общей скорости метаболизма, например, понижением температуры до комнатной, эффективность восстановления не меняется. При снижении температуры до 20°С наблюдается временная задержка в восстановлении некоторых клеток. Интенсивность восстановления значительно снижается при 8?С, а при 2 - 5°С -- приостанавливается.