Методы окраски бактерий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Методы окраски бактерий

В цитологической практике нередко возникает необходимость в окраске и исследовании бактерий. Это чаще всего касается различного рода экссудатов, мазков из различных органов и тканей. Мазки готовят различно. В тех случаях, когда материал жидкий, наносят каплю его на чистое предметное стекло и размазывают, пользуясь краем другого предметного стекла (лучше шлифованного); если материал очень густой (например, гной), то его либо разводят физиологическим раствором и тогда поступают, как в первом случае, либо размазывают тонким слоем по предметному стеклу при помощи петли или стеклянной палочки. Наконец, можно готовить мазки-отпечатки, для чего чистое предметное стекло прикладывают непосредственно к серозному покрову, слизистой оболочке или к свежей поверхности разреза какого-либо органа (ткани). При наличии жидкого содержимого (экссудат, моча и пр.) рекомендуется центрифугировать и из осадка готовить мазки.

Полученные по одному из вышеуказанных способов мазки тщательно высушивают и затем фиксируют сухим жаром. Фиксация достигается посредством несильного нагревания (примерно до 70°С) предметного стекла, которое для этого трижды проводят над пламенем спиртовки мазком вверх. Можно фиксировать мазки и в 96°спирте (10--15 минут).

Фиксированные мазки сохраняются в течение какого угодно времени.

Окрашенные мазки исследуют в масле, с иммерсионным объективом; при желании заключают в бальзам, в таком случае на окрашенный и хорошо высушенный мазок кладут каплю бальзама и покрывают покровным стеклом.

В настоящее время классическую бактериоскопию с окрашиванием микробов различными красителями дополняют получившие широкое распространение иммуноцитохимические методы с применением меченых антител. Во многих случаях (особенно если применяют моноклональные антитела против поверхностных антигенов возбудителя) они позволяют провести высокоспецифичный экспресс-анализ.

Нередко наиболее доступными для исследования с целью идентификации возбудителя являются обработанные в центрифуге экссудаты, выделения, а также - кровь, пунктаты паренхиматозных органов, мазки и отпечатки тканей.

Для обнаружения возбудителей используют различные методы и группы методов.

1. Методы выявления кислых гликозаминогликанов (ГАГ) с помощью ШИК-реакции. Наилучшие результаты получают при выявлении простейших, в частности пневмоцист и токсоплазм, микоплазм, хламидий, некоторых грибов (особенно рода Candida) и капсулообразующих бактерий.

2. Методы с использованием основного фуксина, азура, тионина и метиленового синего (окраски по Пфейферу, Леффлеру, Николя и др.), которые в небольших концентрациях позволяют выявить разную, в основном бактериальную флору- Наиболее эффективны способы окраски по Цилю-Нильсену для выявления спирто- и кислотоустойчивых бактерий, в частности семейства Mycobacteriaceae (микобактерий туберкулеза, лепры и др.) и некоторых простейших (криптоспоридий). Используемые при этом основной фуксин и метиленовый синий позволяют выявить, помимо бактериальной флоры, фуксинофильные внутриклеточные включения, характерные для некоторых вирусных, особенно респираторных, инфекций. Азур и эозин эффективны для выявления различной бактериальной микрофлоры, особенно грамположительной, и некоторых простейших, в частности плазмодия малярии.

3. Методы, основанные на использовании анилинового фиолетового (окраска по Граму и ее модификации), позволяющие выявлять грамположительные бактерии и некоторые грибы, в первую очередь рода Candida. Следует, однако, иметь в виду, что наиболее интенсивно окрашиваются молодые формы. Погибшие или погибающие микроорганизмы утрачивают способность окрашиваться этими методами. В то же время часть грамотрицательных возбудителей, по крайней мере эшерихий, в случае их гибели становятся грамположительными или окрашиваются полихромно.

4. Методы, основанные на импрегнации нитратом серебра кусочков тканей, срезов или мазков, направлены на выявление разной, в основном бактериальной, флоры, поиски которой облегчаются в связи с тем, что импрегнированные серебром микроорганизмы немного увеличиваются в размерах.

Говоря о гистологических срезах, следует отметить, что некоторые микроорганизмы, особенно ДНК-вирусы (семейств Herpesviridae и Adenoviridae) и многие грибы (классов Ascomycetes и Phycomycetes), вполне удовлетворительно окрашиваются гематоксилином. В этом случае использование дополнительных способов окраски из числа перечисленных излишне. Осторожно следует подходить к интерпретации находок при бактериоскопии секционного материала, особенно при поздних вскрытиях, поскольку происходит постмортальная инвазия, а размножение многих видов бактерий происходит даже в предагональном периоде, на что указывают многие авторы.

Окраска метиленовым синим Лефлера

Методика окраски.

Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 -- 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Окраска основным фуксином по Пфейферу

Вместо метиленового синего можно воспользоваться карбол-фуксином либо как таковым, либо в разведенном виде (1:10). Окрашивание длится от 15--30 секунд до 2--3 минут, в зависимости от степени разведения перекрашивания допускают дифференцировку 70° спиртом (10--20--30 секунд).

Окраска основным фуксином по Пфейферу. 1 г основного фуксина растворяют в 10--15 мл этилового спирта и смешивают со 100 мл 5 % раствора фенола. Затем 3 капли полученного раствора добавляют к 10 мл дистиллированной, воды и этой смесью окрашивают мазки в течение 30 -- 40 мин. После этого ополаскивают водой, дифференцируют 0,1 % раствором соляной кислоты в абсолютном спирте, ополаскивают в абсолютном спирте и заключают в бальзам.

Результат: бактерии окрашиваются в малиново-красный цвет.

Окраска генциановым или метиловым фиолетовым

Для ориентировочной окраски бактерий можно воспользоваться также карболовым генциановым фиолетовым или кристаллическим фиолетовым. Однако эти красители при дифференцировке 700 спиртом легче извлекаются из клеточных элементов и бактерий, чем фуксин, поэтому, пользуясь ими, рекомендуется сильно перекрашивать.

Смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (генцианвиолет) со 100 мл 2,5 % раствора фенола (смесь хранится долго). Мазки окрашивают в течение 2 -- 5 мин через фильтровальную бумагу, промывают в проточной воде, сушат и исследуют при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в густо-фиолетовый цвет.

Окраска карболовым тионином Николя

Смешивают 1 часть насыщенного спиртового раствора тионина с 10 частями 1 % водного раствора фенола, мазки окрашивают 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 30 секунд в 96 % спирте, снова ополаскивают в воде и высушивают. Препарат изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в темно-синий цвет.

Окраска акридиновым оранжевым по Дарту-Тернеру

1. Мазки фиксируют в смеси равных частей диэтилового эфира и 95 % этилового спирта в течение 1ч.

2. Проводят через спирты нисходящей концентрации (80 %, 70 %, 50 %) и дистиллированную воду, окуная мазок по 5 раз в каждую порцию.

3. Окунают 4 раза в 1 % уксусную кислоту.

4. Переносят в дистиллированную воду на 2 мин.

5. Помещают на 3 мин в ацетатный буфер (рН 3,8).

6. Переносят в 0,01 % забуференный раствор акридинового оранжевого на 3 мин.

7. Дифференцируют 4 мин в ацетатном буфере (рН 3,8).

8. Протирают концы предметных стекол, а затем осторожно удаляют избыток буферного раствора фильтровальной бумагой.

9. Заключают под покровное стекло в буферный раствор и оставляют на 2 мин. Препарат исследуют с помощью флюоресцентного микроскопа сразу либо, если мазок оставляют надолго, держат в темноте и парафинируют края покровного стекла. Флюоресценция сохраняется в течение 3 мес.

Результат: бактерии, дрожжи, грибы рода Candida окрашиваются в красный цвет, паразиты -- в красный с желтыми ядрами; лейкоциты -- ярко-зеленые.

Окраска по Граму

Красящие растворы.

Раствор кристаллического фиолетового по Эрлиху: 1,2 г кристаллического фиолетового растворяют в 12 мл 96 % спирта и добавляют 100 мл свежеприготовленной анилиновой воды, полученной при смешивании 2 мл анилина со 100 мл воды. Эта красящая смесь может храниться 2 нед. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать метиловый фиолетовый.

Красящие смеси для грамположительных бактерий:

1) 10 г кристаллического фиолетового + 100 мл спирта;

2) 10 г генцианового фиолетового +100 мл спирта;

3) 10 г метилового фиолетового + 100 мл спирта;

4) 1 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового + 10 мл дистиллированной воды;

5) 0,25 мл насыщенного спиртового раствора кристаллического фиолетового +100 мл 5 % раствора уксусной кислоты;

6) 8 - 9 г метиленового синего +100 мл спирта;

7) 30 мл насыщенного раствора метиленового синего в спирте + 1 г гидроксида калия + 99 мл дистиллированной воды.

Красящие смеси для грамотрицательных бактерий:

1) 8 -- 9 г основного фуксина + 100 мл 96 % спирта;

2) 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина + 10 мл дистиллированной воды;

3) 1 г основного фуксина +1 г фенола + 0,5 мл глицерина + 10 мл 96 % спирта +100 мл дистиллированной воды;

4) 0,2 -- 0,5 % водный раствор сафранина либо 0,25 % раствор сафранина в 10 % спирте.

Методика окраски.

1. Мазки крови, цереброспинальной жидкости, экссудатов фиксируют над пламенем горелки (быстро проводят 3 раза над пламенем, так чтобы мазок прогревался до 70-800С в течение 3-4 с), затем высушивают. Кроме фиксации над огнем, для мазков применима фиксация в метиловом спирте (5 мин) или в парах формалина (в сосуде Коплина) в течение 15 мин.

2. Наливают на фиксированный мазок карболовый или анилиновый генциановый фиолетовый (или кристаллический фиолетовый) на 2--3 минуты. Во избежании осадков окрашивают через фильтровальную бумагу. Очень удобно работать с полосками фильтровальной бумаги, предварительно пропитанной 1% спиртовым раствором одного из вышеуказанных красителей и затем высушенной. Такую окрашенную и высушенную бумагу накладывают на мазок и смачивают дистиллированной водой. Продолжительность окрашивания остается прежней (2--3 мин.).

3. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу и быстро споласкивают в водопроводной воде (15--30 секунд).

4. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя иди другим йодистым раствором, например по Граму (2 г йодида калия растворяют в 2-3 мл дистиллированной воды, добавляют 1 г кристаллического йода, доливают до 300 мл, а по Вейгерту до 100 мл дистиллированной воды).

5. Раствор сливают, мазок промывают водой (водопроводной или дистилированной).

6. Дифференцируют 96° спиртом, наливая и сливая его, пока отходит синяя краска и не обесцветится мазок (приблизительно 20-40-60 секунд). Во время дифференцировки препарат все время покачивают.

Если вместо спирта использовать ацетон, то промывание продолжается 30 с. Можно дифференцировать смесью спирта и ацетона (1:1) 30 с.

7. Промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1 -- 2 мин.

8. Дополнительно окрашивают (для выявления грамотрицательной группы бактерий) либо 0,5% водным раствором нейтрального красного (нейтральрот), либо разведенным (в 10 раз) карболфуксином Циля -- 1-2-3 минуты. Возможна докраска сафранином (0,2-0,5 % водный раствор или 0,25 % раствор в 10 % спирте) основным коричневым (бисмаркбраун) либо пиронином J или В (2-5 мин).

9. Промывают в проточной воде 5 с и высушивают фильтровальной бумагой.

Результат: Грамположительные бактерии окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, грамотрицательные - в красный или коричневый в зависимости от красителя; ядра клеток -- ярко-красные, цитоплазма -- розовая.

Следует заметить, что в классической прописи при окраске по Граму обычно не промывают мазки в воде ни после окраски генциановым фиолетовым (кристаллическим фиолетовым), ни после обработки раствором Люголя, ограничиваются лишь сливанием растворов. Предлагаемое промывание в воде имеет целью только чистоту в работе, тем более, что оно ни в какой мере не отражается на результатах окрашивания.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Приготовление красителя

Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии.

Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.

Методика окраски

1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40--120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга -- 5,8 -- 6,0, для мазка крови -- 6,4 -- 6,5, для выявления простейших -- 6,8, малярийного плазмодия -- 7,0 -- 7,2.

2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток -- в голубой, ядра -- в красный.

Окраска плазмодиев малярии в мазках по Романовскому-Гимза

Фиксация и методика окраски те же, что и для мазков крови. Для исследования на присутствие плазмоидиев, кроме мазков, берут обязательно и так называемую "толстую каплю". Последняя представляет собой каплю крови, размазанную по предметному стеклу углом другого стекла. "Толстую каплю" перед окраской не фиксируют.

Методика окраски "толстой капли".

1. На высохшую каплю наливают краску Романовского-Гимза, разведенную как обычно. Продолжительность окрашивания 30-50 минут.

Вариант: нефиксированную толстую каплю сушат в течение 1 ч на воздухе и окрашивают 2--10 мин смесью из 4 мл раствора Гимзы, 3 мл ацетона, 2 мл буферного раствора (рН 6,5) и 31 мл дистиллированной воды.

2. Осторожно споласкивают в дистиллированной воде и затем просушивают в вертикальном положении (фильтровальную бумагу применять нельзя).

Препарат исследуют при иммерсии. Для сохранения препаратов можно закрыть толстую каплю покровным стеклом, которое кладут на водный раствор поливинилового спирта или раствор желатина.

Ввиду того, что гемоглобин в водных растворах краски выщелачивается, эритроциты в окрашенной капле не видны. Морфология паразита в толстой капле менее ясна, чем в мазке.

Результат. В мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе, отчетливо видна голубая протоплазма паразитов с ядром, окрашенным в розовый или красный цвет. Форма паразитов в зависимости от стадии развития может быть различной. В зрелых плазмодиях определяются темно-коричневые пигментные включения. Паразиты находятся в эритроцитах, но могут располагаться и свободно.

Дифференцированная окраска кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза и лепры)

Кислотоустойчивыми называют бактерии, которые после окрашивания фуксином не обесцвечиваются под действием концентрированных минеральных кислот и спиртов. Особенностью этой группы бактерий является их невосприимчивость к красителям, поэтому для их окрашивания применяют подогретые концентрированные красители. Наиболее распространен метод Циля-Нильсена.

Окраска микобактерий туберкулеза карбол-фуксином по Цилю-Нильсену

Приготовление красителя

Для приготовления раствора карболового фуксина 1 г основного фуксина растворяют в 2 мл глицерина и доливают до 100 мл 5 % раствором фенола. Р. Лилли (1969) рекомендует следующую пропись: в 50 мл спирта растворить 25 г фенола, а затем 5 г основного фуксина и долить дистиллированной водой до 500 мл.

Методика окраски

1. Наливают на фиксированный мазок карбол-фуксин Циля (окрашивают через фильтровальную бумагу) и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Эту температуру поддерживают в течение 1--2 минуты, не доводя до кипения.

2. Сливают краску, удаляют фильтровальную бумагу и основательно промывают в водопроводной воде.

3. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (на 70° спирте) до тех пор, пока мазок не примет бледно-розовый или бледно-фиолетовый тон (примерно 30--60 секунд).

4. Промывают в воде 15-30 и более секунд.

5. Докрашивают метиленовым синим Лефлера 15-30 секунд.

6. Основательно споласкивают в воде и высушивают фильтровальной бумагой.

Мазки, перекрашенные метиленовым синим, можно дифференцировать 70° спиртом.

Такое простое окрашивание мазков на микобактерии туберкулеза практически имеет наибольшее значение. Наряду с ним, но значительно реже, применяются и другие способы: метод обогащения, посевы, прививки животным.

Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне.

Метод Френкеля

Окрашивают мазок с нагреванием на пламени горелки раствором фуксина иди генцианового фиолетового на анилиновой воде и затем обесцвечивают 1 --2 мин смесью (50 мл спирта + 20 мл 15 % азотной кислоты + 30 мл воды). В этой смеси растворяют до насыщения метиленовый синий или основной коричневый. Затем мазок промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.

Результат: микобактерии окрашиваются в красный цвет (при окраске фуксином) или в фиолетовый (при окраске генциановым фиолетовым).

Флюоресцентное окрашивание мазков мокроты (метод Хагеманна) ,

Фиксированные нагреванием мазки окрашивают в течение 8 -- 10 мин при комнатной температуре в растворе аурамина (1 г аурамина в 100 мл 5 % фенола). Тщательно промывают проточной водой, дифференцируют в 2 сменах 2 % солянокислого спирта по 2 мин. Затем снова хорошо промывают в проточной воде, обрабатывают 0,1 % раствором перманганата натрия 20 с, снова промывают в воде, сушат и исследуют при иммерсии (2 мл концентрированной соляной кислоты на 98 мл спирта).

Результат: микобактерий имеют вид ярко-жёлтых палочек.

Метод Киньуна (для срезов)

1. Депарафинированные срезы доводят до воды.

2. Окрашивают любым карбол-фуксином при 70 °С 10 мин, при 55 °С - 30 мин, при 37 °С - 2 мин или при 20-25 °С 4-16 мин.

3. Промывают в воде.

4. Обесцвечивают в смеси 2 мл концентрированной соляной кислоты и 98 мл 95 -- 70 % спирта от 20 с до нескольких минут (до обесцвечивания).

5. Докрашивают кислым квасцовым гематоксилином 2 --5 мин или 1 % раствором метиленового синего либо януса зеленого В в 1 % уксусной кислоте и 20 % спирте 3 мин (два последних красителя пригодны и для мазков).

6. Промывают в проточной воде.

7. Обезвоживают, просветляют (не следует пользоваться карбол-ксилолом, который обесцвечивает почти все микобактерии) и заключают в полистирол, капрат целлюлозы или депекс, но не в бальзам.

Результат: кислотоустойчивые микробы и цероид окрашиваются в красный цвет, ядра клеток -- в синий или зелёный, гранулы лаброцитов (тучных клеток) при окрашивании метиленовым синим приобретают синё-фиолетовый цвет, но не окрашиваются гематоксилином. В материале, фиксированном формалином, эритроциты часто окрашиваются в розовый цвет, а стержни волос и кератогиалин -- в красный различных оттенков.

Метод Файта (для срезов)

1. Депарафинированные срезы доводят до воды и окрашивают 30 -- 60 мин при комнатной температуре смесью, в состав которой входят 5 г фенола, 10 мл этилового или метилового спирта и 1 г основного фуксина (растворить и долить до 100 мл дистиллированной воды).

2. Переносят срезы в концентрированный раствор формалина на 5 мин.

3. Диференцируют почти до полного обесцвечивания в 2- % солянокислом спирте.

4. Переносят в концентрированный раствор формалина на несколько секунд и промывают в воде.

5. Докрашивают пикрофуксином Ван-Гизона и гематоксилином 10--15 мин, промывают в воде.

6. Дифференцируют и просветляют в спиртах возрастающей концентрации (от 95 % до 100 %), спирт-ксилоле и двух сменах ксилола, заключают в полистирол или пермаунт.

Результат: кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

Серебрение бактерий в мазках -- метод Фонтана

1. Мазки, фиксированные нагреванием (или в парах формалина, спирте, формоловых смесях, жидкости Карнуа), ополаскивают в воде.

2. Нагревают 10 мин в растворе Люголя до появления паров, просветляют 2 мин в 5 % растворе тиосульфата натрия.

3. Ополаскивают дистиллированной водой 30 с.

4. Нагревают до появления паров в растворе аммиачного серебра 30 с.

5. Промывают в дистиллированной воде, высушивают и заключают в бальзам.

Выявление жгутиков и ресничек

Метод Леффлера

1. Мазок кладут на 0,5--1 мин в слегка нагретую протраву (100 мл 12 % водного раствора танина + 50 мл насыщенного на холоде раствора сульфата железа + 50 мл спиртового раствора фуксина).

2. Хорошо промывают мазок водой и ополаскивают в спирте.

3. Окрашивают насыщенным раствором фуксина в анилиновой воде, к которому по каплям добавляют 1 % гидроксида нутрия до тех пор, пока раствор не станет мутным и не начнет выпадать, осадок красителя. Раствор красителя наливают на часовое стекло, мазок пускают плавать, подогревая краситель на спиртовке до появления паров. Окрашивают в течение 1--2 мин.

4. Промывают в воде, сушат и исследуют при иммерсии или заключают в бальзам.

Метод Лайфзона

Смешивают равные объемы 1,5 % хлорида натрия, 3 % таниновой кислоты и 0,9 г парарозанилина ацетата + 0,3 г парарозанилина гидрохлорида + 100 мл 96 % спирта. Хорошо размешивают, рН смеси должен быть от 4,8 до 5,2. При комнатной температуре краску можно хранить несколько дней, при 4 °С - до 2 мес., а при минус 10 °С -- неопределенно долго.

Мазки с культур или из жидкостей не фиксируют на огне, можно пользоваться другими методами фиксации.

Методика окраски

1. На мазок наливают светлую надосадочную жидкость красителя.

2. Окрашивают 8--15 мин до появления на стекле металлического оттенка.

3. Промывают в воде, высушивают и изучают при иммерсии.

Результат: бактерии и жгутики -- красные.

Выявление капсул бактерий

Метод Клетта

Мазки окрашивают разбавленным в 10 раз насыщенным спиртовым раствором метиленового синего, подогревая краску на огне до кипения. Затем промывают в воде и окрашивают в течение 5 с 10 % спиртовым раствором фуксина, разбавленным водой в 10 раз. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии окрашиваются в синий цвету а их капсулы -- в красный.

Метод Джоне

Фиксированные над огнем мазки окрашивают при подогревании до появления паров в течение 2 мин 20 % водным раствором генцианового фиолетового. Затем промывают в воде и окунают на 8--10 с в 2 % раствор уксусной кислоты. Далее снова промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии темно-синие, капсулы светло-синие.

Метод Фридлендера (для срезов)

Депарафинированные срезы окрашивают в течение нескольких часов смесью 5 частей насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового, 10 частей дистиллированной воды и 1 части ледяной уксусной кислоты (срезы можно оставить на ночь). Дифференцируют окраску 10--15 с 0,1 % растворе уксусной кислоты. Промывают срез водой, быстро обезвоживают в спиртах, проводят через ксилол и заключают в бальзам.

Результат: бактерии темно-синие, капсулы светло-синие.

Метод Бурри

На конец предметного стекла наносят каплю туши и петлёй -- исследуемый материал. Смесь тщательно перемешивают петлей, делают мазок и высушивают его, не фиксируя. Исследуют при масляной иммерсии.

Результат: фон препарата окрашен в дымчато-темный цвет, на котором хорошо видны бесцветные микробные тела и их капсулы.

Метод Гинса

Негативно окрашенный препарат, приготовленный по методу Бурри, фиксируют любым способом, промывают водой и окрашивают карболовым фуксином, разведенным в соотношении 1:3. Промывают водой, высушивают и изучают при иммерсии.

Выявление спор бактерий

Окрашивание спор удается только в мазках.

Метод Вайсера--Хьюппе

1. Мазки окрашивают в растворе карболового фуксина или фуксина на анилиновой воде в термостате при 37 °С в закрытой посуде в течение нескольких часов.

2. Обесцвечивают 2,5 % раствором серной кислоты в течение 3 -- 5 с и споласкивают 96 % спиртом, пока не перестанут отходить облачка красителя.

3. Докрашивают метиленовым синим 3 -- 5 мин.

4. Ополаскивают в проточной воде, сушат на воздухе и изучают при масляной иммерсии.

Можно окрашивать карболовым фуксином, подогревая на огне мазок с красителем до появления паров 5 -- 8 мин, но тогда дифференцировать следует 2,5 % серной кислотой в течение 10-20 сек.

Результат: споры окрашиваются в красный цвет, бактерии - в синий.

Метод Меллера

1. Фиксированные мазки помещают на 2 мин. в хлороформ.

2. Переносят в 5 % водный раствор хромовой кислоты на 2 -- 10 мин.

3. Промывают в проточной воде и окрашивают карболовым фуксином 1 мин (стекло при этом подогревают на горелке до появления паров).

4. Дифференцируют в 5 % серной кислоте 5 с.

5. Хорошо промывают в проточной воде и подкрашивают водным раствором метиленового синего 3 мин.

6. Промывают в проточной воде, сушат и изучают при иммерсии.

Результат: опоры окрашиваются в красный цвет, бактерии -- в синий.

Окраска малахитовым зеленым Шеффера-Фултона

1. Мазки, фиксированные над огнем, окрашивают 5 % водным раствором малахитового зеленого 5--10 мин.

2. Промывают в проточной воде.

3. Докрашивают 1 % водным раствором сафранина 30 с.

4. Промывают водой, сушат и изучают при масляной иммерсии.

Результат: споры окрашиваются в зеленый цвет, бактерии -- в красный.

Метод Ожешки

На нефиксированный мазок наливают 0,5 % раствор соляной кислоты и подогревают над огнем 1 -- 2 мин. С препарата сливают кислоту, тщательно промывают проточной водой, высушивают и после высыхания фиксируют на пламени. Фиксированный препарат окрашивают по методу Циля -- Нильсена.

Результат: тела бактерий окрашиваются в синий цвет, споры -- в красный.

Метод Битгера

Нефиксированный мазок обрабатывают 10 % формалином 10 мин, промывают проточной водой и высушивают. Окрашивают 3 мин аммиачным метиленовым синим (20 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего + 3 мл 98 % раствора аммиака + 80 мл дистиллированной воды), нагревая стекло над огнем до закипания красителя. Промывают проточной водой, докрашивают 0,5 % раствором сафранина 3--5 мин, промывают водой, высушивают и изучают при масляной иммерсии.

Результат: бактерии красные, споры синие.

Выявление возбудителей сыпного тифа и других риккетсий

Выявление риккетсий в мазках (метод Маккиавелло)

1. Тонкие мазки фиксируют над пламенем (3 раза).

2. Окрашивают в предварительно профильтрованной смеси, состоящей из 0,5 г основного фуксина (насыщенного), 3,6 мл 0,1 М гидроортофосфата натрия, 1,4 мл 0,1 М дигидроортофосфата натрия и 55 мл дистиллированной воды (рН 7,2) 5 мин.

3. Окунают на 5 с в 0,5 % водный раствор лимонной кислоты.

4. Тщательно промывают в водопроводной воде.

5. Докрашивают 0,1 % водным раствором метиленового синего 1--2 мин или 1% раствором 10 с.

6. Ополаскивают в воде, высушивают и исследуют при иммерсии.

Результат: риккетсий окрашиваются в красный цвет, клетки и бактерии -- в синий различных оттенков.

Часто используют также красящую смесь Гимзы. Ею можно окрашивать при рН 7,2-7,4, а затем дифференцировать в подкисленной воде до тех пор, пока эритроциты не станут розовыми, или при рН 6,5-6,0 с последующим промыванием и высушиванием мазков.

Выявление риккетсий в срезах (метод Ника)

Материал фиксируют 10 % нейтральным формалином, заливают в парафин, депарафинированные срезы доводят до воды.

1. Окрашивают водным раствором метилового фиолетового (1:10 000) 30-60 мин.

2. Дифференцируют в слабой уксусной кислоте (две капли ледяной уксусной кислоты на 100 мл дистиллированной воды) до тех пор, пока цитоплазма не обесцветится.

3. Докрашивают водным раствором метилового желтого (1:10 000) несколько секунд.

4. Обезвоживают и просветляют в ацетоне и ксилоле.

5. Заключают в синтетическую смолу.

Результат: риккетсий пурпурно-фиолетовые, ядра клеток желтые.

Выявление коринебактерий дифтерии

Лучше всего они выявляются в мазках из зева. Мазки фиксируют над пламенем горелки и окрашивают либо щелочным метиленовым синим Леффлера, либо ацетатом толуидинового синего, либо ацетатом кристаллического или метилового фиолетового. Коринебактерия грамотрицательна, ложнодифтерийные палочки при окраске по Граму обладают гораздо большей устойчивостью, чем возбудители дифтерии.

Возбудитель идентифицируют по характерным структурным особенностям: палочки имеют колбообразные вздутия на концах, что придает бактерии вид, булавы. В мазке наряду с длинными, тонкими, прямыми и слегка изогнутыми палочками можно обнаружить короткие и толстые. Характерным признаком бактерий дифтерии являются включения зерен волютина, находящихся на концах палочки. Ложнодифтерийные палочки значительно грубее, короче возбудителей дифтерии и не содержат зерен волютина. Зерна волютина окрашивают 10--15 с смесью, в состав которой входят 0,1 мл метиленового синего, 0,2 мл 96 % спирта, 5 мл ледяной уксусной кислоты, 100 мл дистиллированной воды. После окрашивания мазки ополаскивают водой, докрашивают 10--15 с в 0,2 % водном растворе основного коричневого; снова ополаскивают водой, высушивают и изучают при иммерсии.

Бактериоскопическая идентификация, возбудителя дифтерии является ориентировочной, поэтому требуется подтверждение с помощью классического бактериологического метода. Более быстрым и достаточно специфичным методом идентификации дифтерийной палочки является непрямая иммунофлюоресценция с препаратом антител против О- и К-антигенов коринебактерий дифтерии. Кроме того, разработана иммуноферментная тест-система для выявления дифтерийного токсина, которая пригодна для определения токсинообразующих коринебактерий в мазках. .

Выявление стрептококков

В мазках гноя и осадка жидкости, полученной при лаваже бронхов, в ткани эндокарда, взятой при биопсии или на вскрытии, стрептококки выявляются при окраске по Граму: они грамположительны. Однако более ярко стрептококки окрашиваются анилиновыми красителями -- синькой Леффлера и др. Характерна расположение стрептококков в виде цепочек, при этом делящиеся формы лежат перпендикулярно оси цепочки, что позволяет довольно точно идентифицировать эти микроорганизмы в мазках и срезах.

Выявление стафилококков

Так же как и стрептококки, стафилококки являются грамположительными микроорганизмами, но прекрасно воспринимают анилиновые красители типа метиленового синего, синьки Леффлера и др. Характер микроколоний стафилококков в тканях и выделениях морфологически хорошо идентифицируется это округлые образования со значительным количеством делящихся форм в виде тетрад.

Выявление пневмококков

В мазках цереброспинальной жидкости, мазках осадка промывных вод, в легочной ткани, полученной на вскрытии можно выявить грамположительные диплококки, располагающиеся цепочкой, или одиночные, покрытые капсулой. Эти микроорганизмы хорошо окрашиваются по Граму или анилиновыми красителями типа метиленового синего, в срезах -- с большим трудом. В связи с наличием капсулы требуется специальное окрашивание.

Выявление менингококков

Менингококки, представляющие собой диплококки без капсулы, грамотрицательны. Их выявляют в мазках цереброспинальной жидкости, нейтрофилах крови и свободно в крови, гное с оболочек мозга. Менингококки хорошо окрашиваются анилиновыми красителями типа метиленового синего. Мазки клинического материала нужно исследовать либо сразу, либо фиксировать и затем окрашивать спустя любое время. Для идентификации менингококков применяют также метод иммунофлюоресценции, но для этого необходимо наличие иммуноферментной тест-системы.

Выявление гонококков

Гонококки, имеющие вид диплококка с капсулой, грамотрицательные, окрашиваются метиленовым синим по Леффлеру. В срезах гонококки окрашиваются с трудом. Эти микроорганизмы можно идентифицировать с помощью коммерческих иммунофлюоресцентных наборов.

Выявление возбудителей чумы

Возбудитель чумы грамотрицателен. В. мазках патологического, материала он имеет характерный вид палочек оксидной формы, концы которых окрашиваются метиленовым синим более интенсивно, чем середина. Палочки часто собраны в цепочки. Созданы коммерческие иммунофлюоресцирующие препараты для идентификации возбудителей чумы и иммуноферментные тёст-системы на чумные антигены" пригодные для идентификации возбудителя в мазках и тканях.

Выявление анаэробных спорообразующих бактерий группы клостридии

Клостридии -- крупные грамположительные палочки, все они могут образовывать споры. У возбудителя столбняка спора располагается на конце палочки, что придает ему вид барабанной палочки. Иногда споры могут находиться в центре клетки. У большинства видов есть перитрихиальные жгутики. Окрашивают клостридии карбол-фуксином либо по методу Ожешки для выявления спор.

Возбудители ботулизма (Cl. botulinum). Их выявляют с помощью биологической пробы на присутствие ботулинического токсина. Бактериоскопию не проводят.

Возбудители газовой гангрены (Cl. perfringens) и другие клостридии. При окраске мазков гнойного отделяемого из ран по Граму выявляют крупные грамположительные палочки, окруженные капсулой. Для окрашивания капсул на стекло наносят каплю туши и рядом петлей размазывают исследуемый материал. Смесь материала и туши тщательно перемешивают, делают тонкий мазок, высушивают, фиксируют любым способом. После фиксации мазок промывают протонной водой, окрашивают карболфуксином Циля, разведенным в соотношении 1:3, в течение 3 -- 5 мин, промывают водой, высушивают и изучают при иммерсии. Выявление грубых или полиморфных палочек, имеющих капсулу, позволяет заподозрить наличие в исследуемом материале возбудителя газовой гангрены.

Выявление возбудителей сибирской язвы

Мазки из мокроты при подозрении на легочную форму сибирской язвы, мазки из содержимого карбункула (при кожной форме) или мазки из кала, фиксированные любым способом, окрашивают по Граму. Окраску капсул проводят так же как при выявлении возбудителей газовой гангрены. Обнаружение крупных грубых грамположительных палочек, имеющих капсулу и расположенных в виде коротких цепочек, является основанием для установления предварительного диагноза сибирской язвы.

Выявление возбудителей кишечной инфекции

Возбудители кишечных инфекций относятся к нескольким семействам, все представители которых являются грамотрицательными, неспорообразующими палочками, имеют сходную морфологию и с трудом различаются бактериоскопически, поэтому они хорошо окрашиваются анилиновыми красителями. Идентификацию этих возбудителей лучше всего проводить иммуноцитохимически либо с помощью иммунолюминесцентного или иммуноферментного метода. Холерные вибрионы выявляют как с помощью анилиновых красителей типа метиленового синего, так и иммунолюминесцентным способом с препаратами люминесцирующих антихолерных антител.

Выявление спирохет и других спиралевидных бактерий

Для выявления возбудителя сифилиса (Treponema pallidum) используют темное поле или иммунофлюоресцентную окраску. Они плохо окрашиваются анилиновыми красителями, но импрегнируются по методу Левадити в тканях. окраска бактерия цитологический мазок бактериоскопия

Выявление возбудителей возвратного тифа

Возбудители возвратного тифа (Borrelia recurrentis) хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красителями, а также по методу Гимзы и Райта. Фуксином они окрашиваются в розовый, краской Гимзы -- в фиолетово-розовый цвет.

Выявление лептоспир

Лептоспиры плохо окрашиваются анилиновыми красителями, поэтому их обычно выявляют в бактериологических лабораториях с помощью живых возбудителей в темном поле -- в толстой капле крови или в экссудатах из паренхиматозных органов.

Размещено на Allbest.ru