Цитологические, цитохимические и физиолого-биохимические исследования формирования мужского гаметофита

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Цитологические, цитохимические и физиолого-биохимические исследования формирования мужского гаметофита

гаметоцид тетрада тапетум цитологический

Мужской гаметофит покрытосеменных растений - микроскопическая структура, которая в период ранних стадий развития окружена тканями пыльника и непосредственно контактирует с клетками тапетума, метаболизм которых тесно связан с развитием пыльцевьгх зерен, особенно в критические периоды преобразования материнских клеток пыльцы в гаплоидные микроспоры. Так как наибольшая эффективность действия гаметоцидов приходится на период формирования тетрад и связана с биохимизмом их развития, возникает необходимость в детальной информации о ранних фазах развития пыльцевого зерна в материнской клетке пыльцы.

С помощью электронной микроскопии установлено, что до мейоза материнские клетки пыльцы в пыльниках связаны между собой и с клетками тапетума цитоплазматлческими мостиками. Перед стадией лептотены профазы 1 начинаются преобразовательные процессы в оболочках и мембранах микроспороцитов, которые быстро обволакиваются слоем каллозы, представляющей собой, и каждая спора становится полностью изолированной от других. Предполагают, что в формирование каллозных оболочек вовлечен аппарат Гольджи.

Процесс формирования оболочки пыльцевого зерна начинается вскоре после завершения мейоза и протекает между клеточной мембраной я каллозной оболочкой в каждой споре тетрады. Первичным материалом для построения оболочки является примэкзина. После развития синтезируется предшественник зрелой экзины, морфология которого. зависит от его химического состава. По своим свойствам это вещество сходно с протоспоруллином. На данном этапе каллозная оболочка исчезает, споры быстро увеличиваются в размерах и интенсивно синтезируют спорополленин. После освобождения из тетрад в микроспорах формируется интина, содержащая микрофибряллы целлюлозы, которые образуют матрикс с пектиновым материалом, гемицеллюлозой и незначительным количеством белка. До полного созревания пыльцевое зерно покрывается различными производными распадающегося тапетума - каротиноидами, липидами, белками и другими соединениями. При дальнейших фазах развития пыльцы эффективность действия гаметоцидов снижается.

Ранние этапы развития пыльцы тесно связаны с функциональной активностью тапетума. Цитохимические и ультраструктурные исследования свидетельствуют, что тапетум функционирует как источник питательного материала при развитии пыльцевого зерна. У покрытосеменных установлено два основных типа тапетума: гландулярный, при котором клетки по мере развития пыльцевых зерен дегенерируют до полного автолиза, и амебоидный. В последнем клетки теряют свою оболочку, и протопласт тапетума распределяется между развивающимися пыльцевыми зернами, образуя тапетальный периплазмодий. Мембраны такого тапетума могут проникать в экзину пыльцы. Питательный материал транспортируется из клеток тапетума к пыльцевым зернам. Взаимодействие тапетума и развивающихся микроопор максимально проявляется при растворении каллозных оболочек микроспор. Исчезновение каллозы сопровождается развитием каллазной активности. Энзим локализован в везикулах цитоплазмы тапетума.

Исследование деградация микроспор приходилась на период, начиная с мейоза 1 и включая интерфазу микроспор.

Одной из причин, вызывающих ЦМС растений, являются функциональные нарушения в метаболизме тапетума. Тщательное изучение этой ткани у фертильных и стерильных линий, а также у восстановителей фертильности сорго показало, что у фертильных линий после мейотической профазы I тапетум быстро уменьшался в радиальной протяженности. В стерильных пыльниках радиально расширенный тапетум обусловливает абортивность микроспор, и период его разрастания приходится на стадию вакуолизации микроспоры. Тапетум стерильных пыльников по протяженности и морфологии имеет более широкую шкалу изменчивости, чем у фертильных линий. 'Размеры ширины тапетума стерильных пыльников связывают с дегенеративными процессами в микроспорах.

При цитологических исследованиях клонов ежи сборной с ЦМС не было отмечено отклонений в развитии пыльника в течение архиспориальной стадии и стадии материнской клетки пыльцы по сравнению с нормальными растениями. Первые признаки различий в развитии появлялись в начальные фазы мейоза, что выражалось в разрушении некоторых микроспороцитов, в результате чего образовывалось малое количество тетрад у растений с ЦМС. Одновременно у стерильных растений наблюдалось более быстрое дегенерирование тапетума, чем у фертильных. При сравнительном исследовании микроспорогенеза и развития пыльцы у фертильных и стерильных растений льна установлено, что стерильность пыльцы у этого растения достигалась анормальным разрастанием клеток тапетума, которые медленно дегенерировали по сравнению с тапетумом фертильных растений, у которых величина этой ткани быстро уменьшалась, особенно после стадии тетрад. Очевидно, преждевременное или позднее включение деградативньгх механизмов тапетума может быть причиной функциональной мужской стерильности. У разных видов растений эти механизмы имеют свой специфический характер, что необходимо учитывать при подборе гаметоцидов, их доз и сроков обработки.

Цитологические исследования пшеницы показали, что на клеточном уровне ЦМС выражается в уменьшении размеров и числа органелл, характеризующихся низкой физиологической активностью и довольно быстрым дегенерированием. У фертильных пыльцевых зерен органеллы клеток обильны.

Различный уровень метаболической активности тапетума в нормальных и стерильных пыльниках и продолжительность его функционирования контролируется цитологами реакцией Фёльгена. Ядра клеток тапетума нормальных пыльников интенсивно окрашиваются до формирования материнской микроспоры, после чего окраска прогрессивно уменьшается по мере коллапсирования тапетума. В тканях тапетума стерильных пыльников окрашивание ядер продолжает осуществляться интенсивно после формирования тетрад и незначительно снижается в процессе развития микроспор. Следовательно, функция тапетума неразрывно связана с его определенной ролью при абортивности микроспор. У нормальных пыльников тапетум получает необходимый питательный материал, поставляемый растением, и преобразует его для формирующихся микроспор, что подтверждается поступлением Фёльген-положительных веществ в материнскую микроспору во время мейоза. Тапетум стерильных пыльников имеет более низкий уровень метаболической активности, о чем свидетельствует как низкая энзиматическая активность, так и изменение поступления Фёльген-положительного материала в спорогенные клетки в критические периоды их формирования.

В процессе химической индукции мужской стерильности может происходить включение тех же механизмов, что и пр. и абортивности мужского гаметофита стерильных аналогов, где стерильность обусловлена ЦМС. Обработка растений кориандра, вики и лука 0,01%-ным раствором ГМК вызывала 100%-ную стерильность у всех трех растений. После нанесения гаметоцида на растения кориандра тапетум увеличивался и существовал вплоть до стадии вакуолизации микроспор. У контрольных растений тапетум дегенерировал после мейоза. У лука Г1МК, включался в процессы формирования пыльцы, способствуя преждевременному дегенерированию спорогенной ткани и материнских клеток пыльцы. У кориандра химическое индуцирование мужской стерильности проявлялось цитологически - размер ядер не изменялся, а клетки тапетума значительно удлинялись.

Предполагают, что вмешательство различных факторов в метаболизм клеток тапетума приводит к деградации их содержимого и, в первую очередь, дезокоирибозидов - основного синтетического пула ДйК, необходимого для нормального развития материнской клетки пыльцы и микроспор. Нарушение деятельности тапетума при снабжении питательным материалом спорогенной ткани, вызванное различными причинами, обусловливает начало процессов деградации материнской клетки пыльцы.

Цитологические исследования пыльников растений с ауксин-индуцированной стерильностью, выращенных при продолжительном освещении, показали, что химические и физические факторы могут способствовать преждевременному дегенерированию тапетума с последующим снижением нормального передвижения питательного материала к спорогенной ткани. В процессе нормального развития пыльцы в начальных этапах микроспорогенеза ткани тапетума разрастаются и только после завершения формирования микроспор в материнской клетке пыльцы дегенерируют. При гормональной индукции мужской стерильности гиббереллином и в условиях длительного естественного освещения отмечена обратная корреляция во взаимодействии микроспор и тапетума. Большинство микроспор становятся крупными, сильно вакуолизированньши, с ядром, прижатым к клеточной стенке. Клетки тапетума образуют плотную оболочку вокруг полости пыльцевого мешка. Часть микроспор дегенерирует до вакуолизации, но большее их количество абортируется при цветении.

Аберрация микроспорогенеза в результате продленного дня, по-видимому, связана с ранним распадом клеток тапетума. Подобный эффект может быть достигнут путем обработки ауксином, высокая концентрация которого обнаружена в тканях растений при длительном фотопериоде. Это подтверждает гипотезу о влиянии фотопериода на пол путем регуляции метаболизма ауксинов в растительных тканях.

Считают также, что нарушение функций тапетума в питании развивающихся микроспор не является непосредственной и единственной причиной абортивности пыльцы.

При сравнительных исследованиях пыльцы и развития пыльников линий пшеницы с ЦМС и нормальных растений установлено, что деградативные процессы в развивающихся пыльцевых зернах начинаются с несбалансированного поступления питательных веществ в тапетум в результате нарушений функциональной активности васкулярной системы тычиночных нитей. Последние у стерильных растений имели слабо дифференцированные васкулярные тяжи, в то время как у нормальных тычинок сосудистые элементы были хорошо дифференцированы на ксилему и флоему. Наблюдаемое снижение аккумулирования крахмала в тканях тапетума и отсутствие запасного крахмала в зрелых микроспорах является следствием редукции передвижения растворов в тычинки стерильных растений. Нарушение структуры васкулярных элементов при воздействии веществ с гаметоцидной активностью может быть одним из аспектов их действия, тем более, что обработка гаметоцидами, как правило, сопровождается уменьшением размеров пыльников и длины тычиночных нитей.

Преждевременное деградирование тапетума или более длительное существование интактных клеток тапетума в пыльниках с мужской стерильностью, индуцированной химическими препаратами, по-видимому, является результатом взаимосвязи химически активных веществ с деградативными энзимами.

При исследовании причин абортивности пыльцы установлено повышение активности кислых фосфатаз в тканях нормальных пыльников до стадии тетрад, после которой активность резко снижалась с последующим дегенерированием тапетума. В тканях стерильных пыльников активность энзимов была гораздо ниже, и набухший тапетум раздавливал микроспоры.

Подобный дисбаланс в энзиматической системе стерильных пыльников был отмечен S. Izhar и R. Frankel при сравнительном изучении каллазной активности. В связи с тем, что период развития каллазной активности четко установлен во времени и имеет определенный оптимум кислотности, авторы измерили in vivo pH различных стадий микроспорогенеза. У фертильных пыльников вплоть до поздней стадии тетрад рН составляла около 7, затем снижалась до 6, что сопровождалось растворением каллозы. В пыльниках растений линий с ЦМС pH обычно или низкая - тогда энзиматический распад каллозы материнской клетки пыльцы начинается раньше нормальных сроков, или высокая - тогда наблюдается сильная активность энзима, начиная с профазы 1 в течение всего мейоза, вызывая цитологические нарушения. Преждевременное повышение каллазной активности может быть причиной немедленного разрушения материнской клетки пыльцы. Торможение энэиматической активности кал-лазы блокирует распад каллозной оболочки материнских клеток пыльцы, в результате микроспоры теряют свои нормальные очертания и деградируют.

Эти исследования позволили выявить новые причины абортивности пыльцы и показали, что в основе индукции мужской стерильности лежит дисбаланс в четко скоординированные биохимических реакциях и нарушения в последовательности - энзиматических циклов. Изменение четкого ритма энзиматической активности каллазы приводит к деградации развивающихся микроспор. Экспериментально установлено, что период формирования тетрад является наиболее эффективным для применения препаратов с гаметоцидной активностью.

Возможное участие гаметоцидов в процессах, обусловливающих торможение или преждевременное освобождение микроспор из материнской клетки пыльцы, вероятно, связано с влиянием соединений с гаметоцидными свойствами на уровни энзиматической активности каллазы. Своевременная индукция и развитие каллазной активности - критический период для нормального развития мужского гаметофита.

Для успешных поисков новых веществ, обладающих гаметоцидной активностью, необходимо располагать достаточной информацией о метаболизме спорогенной ткани и тапетума, а также о взаимосвязи вх обмена. Электронно-микроскопические наблюдения показали, что при нормальной метаболической взаимосвязи между клетками тапетума и развивающимися пыльцевыми зернами не наблюдается никаких аномалий. Согласно имеющимся данным трудно определить, тапетум или спороциты являются инициатором - в нарушении взаимосвязи.

Одним из возможных путей выяснения механизма индукции мужской стерильности является исследование биохимической активности тканей. При исследовании пыльников и экстрактов листьев пшеницы установлено, что мужская стерильность пыльцы сопровождается репрессией активности терминальных оксидаз. Уровень активности цитохромоксидазы в тканях фертильных растений по сравнению со стерильными гораздо выше. Подобное явление отмечено в тканях растений с генетической мужской стерильностью. Цитохромоксидаза - неотъемлемый компонент митохондрий, поэтому низкую активность дыхательных энзимов растений с ЦМС можно объяснить дисбалансом митохондриальных энзиматических систем.

Митохондрии, выделенные из стерильного материала, характеризовались более высокой окислительной фосфорилазной активностью, чем митохондрии из проростков с нормальной цитоплазмой. Биохимические исследования и наблюдения электронной микроскопии подтвердили, что мужская стерильность тесно связана с изменением функционального состояния этих структур клетки. Восстановление фертильности в линиях с ЦМС сопровождается одновременным устранением отклонений в структуре цитоплазматических органелл и различных нарушений в метаболических процессах. Получены дополнительные доказательства в подтверждение гипотезы, что изменения в метаболизме митохондрий связаны с механизмами индукции мужской стерильности. Предполагается, что включение последних вызывает репрессию синтеза белков внутренней мембраны митохондрий.

Однако было бы ошибочным считать, что только функциональная активность митохондрий является основой возникновения цитоплазматической мужской стерильности. Ее индукция базируется на изменениях в широком диапазоне биохимических реакций, обусловливающих нарушения в молекулярных компонентах различных клеточных структур и цитоплазмы, что сопровождается появлением белков с анормальной энзиматической активностью. В результате этих изменений возникает дисбаланс в энзиматических системах или же полное их блокирование.

Для получения ЦМС путем химической индукции у сельскохозяйственных культур необходимо детальное изучение метаболизма ДНК, РНОК и белка в стерильном и фертильном материале с цитологическим и цитохимическим сопоставлением полученной информации. Изменения в содержании ДНК, РНК и белка в пыльниках кукурузы изучали методами цитохимии и микроденситометрии. В процессе спорогенеза различали три пика интенсивного синтеза нуклеиновых кислот. Первый пик соответствует премейотическому периоду и ранней профазе, второй - приходится на интервал между поздним мейозом и стадией тетрад, третий - соответствует периоду, предшествующему митозу микроспор. В течение первого пика установлена самая высокая скорость роста спорогенной ткани и тапетума при активном синтезе молекулярных компонентов в обеих тканях. Во втором пике активный синтез ДНК, PlHiK и белка осуществляется в основном в тканях тапетума. Торможение роста и параллельно синтеза этих молекулярных структур в спорах начинается в период третьего пика, при дегенерировании тапетума. В настоящее время тапетум рассматривают как возможный источник предшественников нуклеиновых кислот для формирующихся микроспор, которые получают материал для синтеза в форме растворимых предшественников или в форме ДНК с низким молекулярным весом.

Основная аккумуляция PlHiK в спорогенной ткани происходит в течение мейотической профазы, включая стадию пахитены материнской клетки пыльцы. В тканях тапетума накопление РНК приходится на тот же период. Таким образом, сразу после синтеза ДНК на ранних этапах спорогенеза до митоза в микроспорах продуцируется РНК спорогенной ткани, причем 75% пригодится на рибосомальную РНК - на формы 16S и 28S. Аккумулирование форм p:PHK 4S и 5S осуществляется иначе, чем основных форм pРHK, и пик их аккумуляций наблюдается в конце интерфазы микроспор.

В пыльцевом зерне основной синтез PHK, ДНК и белка происходит на более поздней стадии - после митоза в микроспорах. В цитоплазме пыльцевого зерна синтез всех форм РНК полностью прекращается в последние 48 ч формирования пыльцы. Биосинтез нуклеиновых кислот и процессы, связанные с их обменом, претерпевают определенные изменения под влиянием соединений с гаметоцидными свойствами.

Установлено, что у фертильных соцветий кукурузы интенсивный синтез ДНК осуществляется на ранних этапах микроспорогенеза, но по мере завершения формирования пыльцы наступает торможение синтетических процессов. При обработке растений гаметоцидами, комбинированно 0,8%-ным раствором FW-450 и 0,1%-ным раствором гнббереллина) содержание ДНК на всех этапах формирования пыльцы несколько увеличилось независимо от применяемого гаметоцида. Это объясняется торможением клеточного растяжения под влиянием обработки гаметоцидами, в результате чего уменьшаются размеры клеток в спорогенной ткани и пересчет на взятую навеску дает завышенное содержание ДНК, не связанное с процессами аккумуляции нуклеиновых кислот.

Комбинированная обработка с гиббереллином вызывает качественные изменения в молекулах ДНК, что приводит к нарушениям митозов и деградации ядра. Отмечено, что растворы ГМК и FW-450 по-разному влияют на интенсивность биосинтеза РНК в мужских репродуктивных органах кукурузы. Параллельно было установлено, что формы проявления стерильности находились в зависимости от применяемого вещества. Применение ГМК на кукурузе вызывало торможение образования РНК, и гаметоцид выступал здесь как ингибитор синтеза РН.К, обусловливая торможение клеточного удлинения. Морфологически это выражалось в уменьшении размеров соцветий, отсутствии в большинстве случаев колосков на латеральных веточках и в редукции листьев. Споро-генные ткани или совсем не формировали пыльцы, или она была нежизнеспособна. Действие FW-450 при данной концентрации не вызывала значительных изменений в синтезе ДНК и PiHK, процессы спорогенеза у кукурузы протекали нормально.

У фертильных растений высокое содержание PiHIK отмечено на более ранних этапах формирования пыльцы я дальнейший синтез РНК осуществлялся более активно.

Специфичность действия гаметоцида обусловлена различными факторам. и: близостью его химических характеристик к аналогам синтетических пулов клетки; возможностью энзиматического преобразования в клеточной системе в субстрат-подобный продукт ил; и в активный промежуточный метаболит определенных энзиматических систем; наличием гормональных свойств или конформационного подобия с молекулами индукторов 'или репрессоров. Воздействие препаратов с гаметоцидными свойствами связано с физико-химическими характеристиками соединений, в результате которых могут изменяться р1Н клетки и ионная сила в критические стадии развития спорогенной ткани.

Исследования влияния этрела на мейотические процессы в спорогенной ткани пыльников пшеницы Triticum aestivum L. показали, что индукция мужской стерильности связана с распадом этрела в растительных тканях с выделением этилена, молекулы которого обладают гормональными свойствами. Предполагают, что этилен, как и многие гормоны, влияет на функциональное состояние мембран, изменяя активность РНК полимеразы. Таким образом, он может воздействовать на процессы транскрипции, особенно участков ДНК, ответственных за синтез долгоживущих мРНК, транскрибирующихся до мейоза, но необходимых для нормального течения мейотических процессов.

В результате возможных нарушений в синтезе различных форм PlHiK при включении гаметоцида в метаболизм клетки неизбежно возникают анормальности в синтезе белка. В нормально развивающейся спорогенной ткани и в микроспорах активный синтез белка приходится на раннюю мейотическую профазу, его активность несколько снижается в зиготене - пахитене и совсем незначительна в период формирования тетрад. Тапетум как ткань проявляет очень высокую метаболическую активность в течение всего периода микроспорогенеза вплоть до полного автолиза, поэтому отводить тапетуму только секреторную роль - значит ограничить его многообразные физиологические функции. Отмечено, что пул ДНК тапетума недостаточен, чтобы служить источником для формирующихся микроспор. Возможно, тапетум снабжает микроспоры растворимыми ДНК предшественниками, как это было показано с экзогенно добавленным меченым тимидином, который быстро проникал в ткани тапетума и включался в ДНК микроспор. Наиболее вероятно, что синтез РНК в тапетуме и микроспорах материнской клетки пыльцы независим. Однако это не исключает, что тапетум, особенно в ранний период формирования микроспор, частично поставляет предшественников РНК в спорогенную ткань. В тапетуме имеется довольно большой рибосомальный пул, который, по-видимому, полностью деградирует вместе с ним или может поставлять предшественников РНК для последнего периода синтеза РНК в развивающихся спорах.

Литература

1. Анащенко А.В. Достижения и перспективы селекции подсолнечника. М., ВНИИТЭИСХ, 1977, 53 с.

2. Балина Н.В. Действие повышенных температур на рост пыльце - вых трубок. - Физиология растении, 1976, т. 23, №4, с. 805

3. Барская Е.И., Балина Н.В. О роли каллозы в пыльниках растении. - Физиология растении, 1977, т. 18, №4, с. 716-721.

Размещено на Allbest.ru