Механизмы реализации путей гибели клетки

Размещено на http://www.allbest.ru/

Механизмы гибели клетки

Клеточная смерть известна с момента открытия самой клетки, еще с 1665 г.: Р. Гук описал формации коры дуба из погибших клеток. Однако долгое время это наблюдение оставалось без внимания. Первые гистологические описания клеточной смерти опубликовали К.Фогт (C.Vogt) в 1842 г. И Р. Вирхов (R.Virchow) в 1859 г. В формировании современных представлений о ПКС важное место занимает работа Кerr et a. . о существовании двух различных видов клеточной смерти у животных - апоптоза и некроза.

В 1966 году в журнале "Science" появилась статья Р. Сандерса, в которой автор высказал предположение, что старение и гибель клеток в эмбрио- и морфогенезе является результатом активации особой генетической программы, запускаемой специфическими внутриклеточными и внешними сигналами.

Процесс гибели клетки, в виде цитологических картин был описан несколькими учеными еще в начале века. Один из известных цитологов того периода француз Бонне различал следующие четыре типа ядерной дегенерации:

1. Кариорексис - хроматин распадается на бесформенные скопления обломков и гранул, которые после разрыва ядерной оболочки попадают в цитоплазму и там дегенерируют.

2. Кариопикноз - "хроматиновая сеть" отстает полностью или почти полность ядерной оболочки и слипается в гомогенную массу. Ядерная оболочка сморщивается, ядро теряет тургор, хроматин распыляется и отдельные его гранулы растворяются в цитоплазме.

3. Кариолизис или хроматолиз - хроматин постепенно растворяется. Ядро и цитоплазма в начале окрашиваются основными красителями весьма интенсивно, но затем хроматин теряет свои морфологические и химические особенности и ядерное вещество переходит в цитоплазму и там растворяется.

4. Вакуолизированная ядерная дегенерация - в ядре появляется одна или несколько вакуолей, которые постепенно увеличиваются, оттесняя хроматин к периферии ядра и здесь он образует отдельные скопления.

В последние годы были выделены в качестве самостоятельных форм гибели клетки аутофагия, митотическая катастрофа и сенессенс, информация о механизмах и особенно о биологическом значении которых достаточно противоречива.

«Апоптоз», что в переводе с греческого означает "опадание листьев, это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные дефектные клетки организма. Форма клеточной гибели - по пути апоптоза или некроза во многом определяется внутриклеточной концентрацией NAD+ и АТР. Снижение уровня NAD+ и АТР ведет к индукции некроза.

Рис. 1. Электронная микрофотография

а- контрольная клетка

б- клетка в состоянии апоптоза

Программированная гибель клеток привлекает к себе внимание многочисленных исследователей уже более тридцати лет, прежде всего, по двум причинам. Во-первых, она играет важную роль в морфогенетических процессах и в регуляции численности клеток на протяжении всего онтогенетического развития многоклеточного организма. Во-вторых, обнаружено, что возникновение многих тяжелых заболеваний связано с такими нарушениями программы клеточной гибели, при которых клетки либо перестают погибать, и тогда возможно возникновение опухолей, либо гибель захватывает избыточное число клеток, что в свою очередь приводит к патологической дегенерации тканей и органов.

По другим данным в составе программированной клеточной гибели (ПКГ) выделяют несколько типов: апоптоз, аутофагическую гибель и программированный некроз (Ogier Denis, Codagno, 2003; Edinger, Thompson, 2004). В свою очередь, апоптоз может быть подразделен на апоптоз одноядерных клеток и митотическую катастрофу. Последняя при этом подразделяется на апоптоз собственно в митозе и апоптоз полиплоидных клеток, образовавшихся в результате патологического митоза.

Апоптоз

Апоптоз -- программируемая гибель клеток -- естественный процесс, предназначенный для элиминации поврежденных клеток либо клеток, «не нужных» по программе морфогенеза и индивидуального развития организма.

Важной особенностью апоптоза, отличающей его от некроза, является отсутствие воспалительной реакции соседних клеток на продукты распада, так как деградирующая клетка сохраняет целостность мембраны до конечных стадий процесса, а затем подвергается фагоцитозу.

К характерным признакам апоптоза принято относить: дегидратационное сжатие клеток, утрату межклеточных контактов, блеббинг, разрушение цитоскелета, конденсацию хроматина, фрагментацию ядер и деградацию ДНК .

Чаще всего идентификацию апоптоза проводят по морфологическим признакам, а также регистрируя интернуклеосомные разрывы ДНК на электрофореграммах и определяя активность каспаз. При работе с живыми клетками широко используется мечение аннексином V, выявляющим появление фосфатидилсерина на внешней стороне плазматической мембраны в процессе апоптоза.

В зависимости от типа клеток, их состояния и вида индуктора основные признаки апоптоза могут варьировать, а некоторые могут вовсе отсутствовать, как это происходит, например, при апоптозе безъядерных эритроцитов.

При более строгом подходе необходимо учитывать, что критерием апоптоза может быть только комплекс признаков.

Сигнальные пути при апоптозе

Общая схема запуска и развития апоптоза представлена на рис. 1. Апоптоз может быть вызван как внешними, так и эндогенными сигналами, к важнейшим из которых относится повреждение ДНК. Апоптоз -- сложный многостадийный процесс, в котором существенную роль играют каспазы -- семейство эволюционно консервативных протеаз. В нормальном состоянии каспазы присутствуют в клетке в неактивной форме, как проензимы. Различают два вида каспаз -- «инициирующие» и «эффекторные». К первым относятся каспазы 8, 9, 10 и 12, которые после активации действуют на эффекторные каспазы 3, 6, 7 и 14. Каспаза 2 обладает как инициирующими, так и эффекторными функциями. Мишени эффекторных каспаз многообразны: например, для каспазы 3 это могут быть фактор фрагментации ДНК DFF-45, гельзолин, PARP-полимераза или PAK2-киназа (Janicke et al., 1998). Только на этапе активации инициирующих каспаз апоптоз обратим.

Механизмы активации инициирующих каспаз могут быть различными. Рцепторный путь запуска каспазного каскада начинается с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал, например Fas/CD95, TNF, DR-4, DR-5 и т. п.

В случае рецептора Fas его активация одноименным лигандом либо антителами ведет к присоединению к рецептору адаптора FADD (Fas-associated protein with death domain). FADD в свою очередь связывается с прокаспазой 8, что приводит к активации каспазы 8, которая затем активирует прокаспазу 3 (рис. 3). Такой тип передачи сигнала имеет место, например, у лимфоидных клеток.У других клеток активации каспазы 8 недостаточно для активации прокаспазы 3.

В случае митохондриального пути запуска каспазного каскада ключевым звеном является изменение состояния митохондрий, при котором снижается мембранный потенциал на внутренней мембране, в ней образуются гигантские поры, матрикс набухает, разрывается наружная мембрана, из митохондрий выходит ряд белков, в частности цитохром c. Последний в комбинации с фактором Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1) и прокаспазой 9 образует так называемый апоптосомный комплекс, в котором прокаспаза превращается в каспазу 9. Далее каспаза 9 активирует каспазу 3. Рецепторный и митохондриальный пути активации каспазного каскада сходятся на стадии активации какой-либо эффекторной каспазы. Так, например, каспаза 3 или 7, действуя на комплекс ДНКазы CAD (caspase activated DNase) с ингибитором DFF-45/ICAD, отщепляет и инактивирует последний.



Рис. 3. Схема передачи сигналов при апоптозе (по: Hengartner, 2000, с дополнениями). CD95--рецептор, расположенный на клеточной мембране; FADD--(Fas-associated protein with death domain)--адаптер; Bid, Bcl-XL, Bcl-2, Bax-- белки семейства Bcl-2; p53--белок-супрессор развития опухолей; Apaf-1--фактор активации протеаз; AIF--фактор индукции апоптоза; цитохром c -- белок митохондриальной электрон-транспортной цепи.

Свободная CAD вызывает межнуклеосомные разрывы ДНК и образование фрагментов в 180--200 пар оснований. Один из белков семейства Bcl-2 -- промотор апоптоза Bid -- также может связывать рецепторный и митохондриальный пути.

Митохондрии являются ключевым звеном в передаче сигнала во время апоптоза, связанного с повреждением ДНК при действии на клетку разного рода факторов, в частности радиации, активных форм кислорода, высокой температуры (Beere, 2004) и др.

Важную роль при этом играет белок p53. Отсутствие или мутация гена p53 приводит к блокированию апоптоза и способствует развитию злокачественных новообразований из-за прекращения элиминации злокачественных клеток. При действии ультрафиолетового излучения, радиации, химиопрепаратов и других факторов, приводящих к нарушениям структуры ДНК, уровень p53 повышается.

Помимо передачи сигнала в митохондрии p53 может участвовать в активации экспрессии проапоптозных генов и подавлении экспрессии антиапоптозных генов.

На наружной мембране митохондрий локализована большая часть белков семейства Bcl-2, в состав которого входят промоторы (Bax, Bid и Bik) и ингибиторы (собственно Bcl-2 и Bcl-XL) апоптоза. От соотношения активности этих белков зависит, состоится апоптоз или нет Открытие AIF (apoptosis inducing factor) является важным этапом в развитии представлений о существующих в клетке сигнальных апоптозных каскадах. Этот митохондриальный флавопротеин перемещается от митохондрий к ядру, где вызывает конденсацию хроматина на периферии ядра и разрыв ДНК с образованием крупных фрагментов. В этом случае действует каспазонезависимый механизм. Таким образом, AIF и цитохром c выполняют важную роль проапоптозных факторов.

Дегидратация клеток при апоптозе

Уменьшение объема клетки исторически принято считать одним из важнейших признаков, отличающим апоптоз от некроза (Kerr, 1971). Первоначально заключение об уменьшении объема делали на основании микроскопии фиксированных гистологических препаратов. В настоящее время объектами исследований являются преимущественно живые клетки, и вывод о сокращении размеров клеток при индукции апоптоза чаще всего основан на измерениях малоуглового светорассеяния при проточной цитометрии, хотя этот метод нельзя считать строгим.

В настоящее время апоптозное снижение объема клеток (apoptotic volume decrease, AVD) связывают с их дегидратацией (Okada et al., 2001).

Различие клеток по плавучей плотности, которая определяется содержанием в клетках воды, давно используется для выделения апоптозных тимоцитов и других клеток.

Именно измерениями плавучей плотности показано, что апоптоз не всегда сопровождается дегидратацией клеток (Веренинов и др., 2003, 2004; Yurinskaya et al., 2005a, 2005b). Полагают, что механизм AVD аналогичен механизму реакции регуляторного снижения объема клеток после их первичного набухания в гипоосмотической среде (regulatory volume decrease, RVD). Считается, что дегидратация клеток -- не только следствие апоптоза, но может быть и индуктором апоптоза. Показано, что апоптоз вызывается гипертоническим шоком (Morales et al., 2000; Michea et al., 2002; Rao et al., 2004; Friis et al., 2005). Апоптозное сжатие клеток может наблюдаться как в течение первых десятков минут, так и в течение десятков часов (Benson et al., 1996; Chang et al., 2000). На клетках HL60, HeLa и U937 показано, что уменьшение клеточного объема опережает такие проявления апоптоза, как выход фосфатидилсерина на поверхность плазматической мембраны, выявляемый по связыванию аннексина V (McCarthy, Cotter, 1997), выход цитохрома c из митохондрий, активация каспазы 3 и фрагментация ДНК (Maeno et al., 2000).

Каким образом уменьшение объема клеток при апоптозе связано с каспазным каскадом? На клетках Jurkat показано, что каспазный ингибитор широкого спектра действия z-VAD блокирует все основные проявления апоптоза, вызванного через Fas-рецептор, включая уменьшения объема, а при индукции апоптоза кальциевым ионофором A23187 или тапсигаргином этот ингибитор не отменяет уменьшения объема, что предполагает каспазный механизм в первом случае и некаспазный механизм -- во втором (Bortner, Cidlowski, 1999). Уменьшение клеточного объема и конденсацию хроматина при апоптозе активированных T-лимфоцитов отмечали при каспазонезависимом механизме с участием AIF (Dumont et al., 2000). При апоптозе клеток Jurkat, индуцированном радиацией или через Fas-рецептор, уменьшение объема, регистрируемое по малоугловому светорассеянию при проточной цитометрии, имело место в обоих случаях, хотя и регулировалось различными инициирующими каспазами -- 8 и 9 (Vu et al., 2001). Из вышесказанного можно сделать вывод о том, что AVD может наблюдаться как при каспазозависимой (рецепторной, митохондриальной), так и при каспазонезависимой индукции апоптоза.

На клетках Jurkat, апоптоз которых вызывали через Fas-рецептор, обнаружено, что стимуляция протеинкиназы C форболовым эфиром (PMA) и бриостатином-1 отменяет апоптозное снижение объема, а ингибирование протеинкиназы C индолкарбазолом Gц6976 способствует AVD (Gуmez-Angelats et al., 2000).

Изменение внутриклеточного содержания и концентрации K+ при апоптозе

Широко распространено представление о том, что выход внутриклеточного K+ является важным процессом, сопровождающим, а по мнению многих исследователей, и обусловливающим AVD. Необходимо различать изменение концентрации катионов во внутриклеточной воде и изменение содержания катионов на единицу сухой массы клеток. Показано, что вызванный дексаметазоном апоптоз лимфоидных клеток CEM не сопровождается существенным снижением концентрации K+, в то время как содержание K+, измеренное методом пламенной фотометрии, уменьшается на 15 % (Benson et al., 1996). О снижении внутриклеточной концентрации K+ в клетках HL60 при апоптозе, вызванном ультрафиолетовым облучением, сообщают Мак-Карти и Коттер (McCarthy, Cotter, 1997). По другим данным, полученным на фибробластах мыши с помощью флуоресцентных зондов, концентрация K+ при апоптозе уменьшалась от 110 до 50 мМ (Barbiero et al., 1995). По данным рентгеновского микроанализа, при апоптозе, вызванном ультрафиолетовым облучением, содержание K+ в клетках U937 снижается с 391 до 196 мкмоль на 1 г сухой массы. Аналогичные данные получены на моноцитах человека при апоптозе, вызванном окисленными липопротеидами. В этом случае содержание K+ снижалось с 616 до 291 мкмоль на 1 г сухой массы. Снижение содержания K+ от 416 до 216 мкмоль на 1 г сухой массы показано методом рентгеновского микроанализа при апоптозе клеток U937, вызванном стауроспорином (Arrebola et al., 2005b).

Ряд исследователей считают, что изменение концентрации K+ во внутриклеточной воде изменяет при апоптозе состояние каспаз.

Следует отметить, что при апоптозе, не сопровождающемся дегидратационным сжатием, как это происходит при апоптозе клеток U937, вызванном этопозидом, тоже наблюдаются существенные изменения соотношения K+/Na+ в клетке, но при неизменном суммарном содержании K+ и Na+ (Yurinskaya et al., 2005a). Показано, что изменение ионного состава клеток с помощью ионофоров (валиномицина, нигерицина и амфотерицина B) может индуцировать апоптоз у клеток разного типа.

Изменение внутриклеточного содержания и концентрации Na+

Рост концентрации Na+ во внутриклеточной воде от 15 до 30 мМ отмечали при апоптозе фибробластов мыши, индуцированном этопозидом. Измерения флуоресценции натриевого зонда (SBFI) в этой работе проводили в монослое клеток (Barbiero et al., 1995). Аналогичные данные получены тоже по флуоресценции SBFI, но методом проточной цитометрии на клетках Jurkat при апоптозе, индуцированном через Fas-рецептор (Bortner et al., 2001).

Увеличение содержания Na+ от 52 до 197 мкмоль на 1 г сухой массы при апоптозе клеток U937, вызванном ультрафиолетовым облучением, показано с помощью рентгеновского микроанализа (Fernбndez-Segura et al., 1999). Тем же методом нашли, что у моноцитов человека при апоптозе, вызванном окисленными липопротеидами, содержание натрия увеличивается от 42 до 103 мкмоль на 1 г сухой массы (Skepper et al., 1999). Увеличение внутриклеточного содержания Na+ от 63 до 143 параллельно с уменьшением содержания K+ с 416 до 216 мкмоль на 1 г сухой массы показано с помощью рентгеновского микроанализа на клетках U937, апоптоз которых индуцировали стауроспорином (Arrebola et al., 2005b).

При анализе связи между изменением ионного состава и изменением водного баланса клетки существенны изменения не концентраций K+ и Na+ во внутриклеточной воде, а изменение их содержания. Решающую роль в том, состоится AVD или нет, играет соотношение между убылью содержания K+ и ростом содержания Na+. Если уменьшение внутриклеточного содержания K+ при апоптозе не покрывается увеличением содержания Na+, то суммарное содержание K+ и Na+ уменьшается и можно ожидать уменьшения объема клетки. При апоптозе тимоцитов крысы, вызванном дексаметазоном, снижение внутриклеточного содержания K+ составляло 0.49 ммоль на 1 г белка, а увеличение внутриклеточного содержания Na+ -- 0.25 ммоль на 1 г белка (Yurinskaya et al., 2005b). Апоптоз клеток U937 при 4-часовом действии стауроспорина также сопровождался снижением внутриклеточного содержания K+ от 1.10 до 0.78 ммоль на 1 г белка и ростом содержания Na+ от 0.30 до 0.34 ммоль на 1 г белка (Yurinskaya et al., 2005a). Во всех перечисленных случаях наблюдали AVD.

Изменение внутриклеточного содержания и концентрации Cl и P

Снижение содержания в клетке катионов должно сопровождаться снижением содержания анионов.

На клетках U937, апоптоз которых был вызван стауроспорином, по данным рентгеновского микроанализа содержание Cl снижается от 143 до 103 ммоль на 1 кг сухой массы, а содержание P не изменяется (Arrebola et al., 2005b). При апоптозе этих клеток, вызванных ультрафиолетовым облучением, по данным той же группы исследователей, содержание Cl уменьшалось от 156 до 115 мкмоль, а содержание P составляло 299 и 314 мкмоль на 1 г сухой массы (Fernбndez-Segura et al., 1999). При апоптозе, вызванном окисленными липопротеидами, на моноцитах человека методом рентгеновского микроанализа показано снижение содержания Cl от 152 до 58, а P -- от 672 до 465 мкмоль на 1 г сухой массы (Skepper et al., 1999). Содержание «не проникающих через клеточную мембрану» анионов, которое можно оценить по разности содержания в клетках катионов K+ и Na+, и «проникающих» анионов Cl- и H PO 3 4 - при апоптозе либо не изменяется (Fernбndez-Segura et al., 1999), либо уменьшается (Skepper et al., 1999; Arrebola et al., 2005b).

Изменение внутриклеточного pH

Большинство исследователей отмечают подкисление цитоплазмы при апоптозе примерно на 0.3--0.4 ед. pH.

Впервые это было показано на клетках HL60 (Barry, Eastman, 1992)

По данным Ланга с сотрудниками (Lang et al., 2000), в случае CD95-индуцированного апоптоза клеток Jurkat закисление внутриклеточной среды связано с ингибированием Na+/H+-обмена. Аналогичные результаты получены для клеток Molt4, CEM и K562 (Rich et al., 2000).

Подкисление цитоплазмы наблюдали при рецепторной, митохондриальной и каспазонезависимой индукции апоптоза. При рецепторном запуске апоптоза снижение pH наблюдали после активации каспаз. При митохондриальном запуске апоптоза закисление, по данным некоторых авторов, предшествует активации каспаз (Furlong et al., 1998; Matsuyama, Reed, 2000). Обнаружена pH-чувствительная эндонуклеаза, играющая, как полагают, важную роль во фрагментации ДНК (Barry, Eastman, 1993). С другой стороны, на клетках CEM было показано, что при апоптозе, вызванном дексаметазоном и этопозидом, подкисление несущественно для эффекторной стадии развития апоптоза. Максимум активности каспазы 3 достигался в этом случае при нейтральном pH (Benson et al., 1999).



Изменение разности электрических потенциалов на клеточной мембране

Снижение мембранного потенциала при апоптозе тимоцитов, окрашенных потенциал-чувствительным красителем DiOC6, наблюдали после изменения митохондриального мембранного потенциала; деполяризация наступала в присутствии тетрапентиламмония -- блокатора K+-каналов (Dallaporta et al., 1999). Сообщалось об уменьшении разности потенциалов на плазматической мембране клеток Jurkat при Fas-индуцированном апоптозе и апоптозе, вызванном тапсигаргином (Bortner et al., 2001). Деполяризация, выявленная в этой работе по изменению флуоресценции DiBAC4 с помощью проточной цитометрии клеток, предшествовала уменьшению объема клеток, которое определяли по малоугловому светорассеянию. Деполяризация мембраны, связанная, как полагают, с деградацией натриевого насоса, обнаружена путем электрических измерений на тимоцитах крысы, апоптоз которых вызывали глюкокортикоидами (Mann et al., 2001). Деполяризация в этом случае наступала одновременно с клеточным сжатием. Описана каспазозависимая деполяризация клеток MCF7 при апоптозе, индуцированном стауроспорином, которую авторы связывают с нарушением работы натриевого насоса (Dьssmann et al., 2003). На клетках U937 при Fas- и As2O3-индуцированном апоптозе также наблюдали деполяризацию плазматической мембраны, причем в случае Fas-индукции деполяризация была каспазозависимой. клетка апоптоз мембрана митохондрия

Механизмы изменения внутриклеточного ионного состава при апоптозе

Два фактора обусловливают характерное для всех клеток асимметричное распределение однозарядных ионов между цитоплазмой и средой: 1) наличие в плазматической мембране транспортеров, способных переносить ионы через мембрану против градиента их электрохимического потенциала за счет гидролиза АТФ или за счет движения через мембрану по градиенту каких-либо других ионов или незаряженных молекул (рис.4); 2) наличие внутри клетки анионов, которые не способны выходить из нее в среду. На K+ приходится около 1/3 общей осмотической активности внутриклеточных компонентов.

Рис. 4. Основные пути переноса однозарядных ионов через плазматическую мембрану (по: Hoffmann, 1987, с изменениями). 1--Na+-H+-обменник, 2--Cl-/HCO3 --обменник, 3--Na+,K+-АТФазный насос, 4--Na+-Cl--котранспортер, 5--Na+,K+-2Cl-котранспортер, 6-- натриевые каналы, 7--калиевые каналы, 8--хлорные каналы.A--анионы, не проникающие через мембрану. Стрелки вверх указывают на движение ионов против градиента, стрелки вниз--на движение по градиенту электрохимического потенциала

Содержание K+ в клетке зависит от содержания в ней непроникающих анионов и от состояния соответствующих трактов переноса K+ через клеточную мембрану. На распределение K+ влияет распределение других ионов, в частности Na+ и Cl-, которое в свою очередь зависит от состояния путей их переноса через мембрану.

Na+, K+-АТФаза играет ключевую роль в поддержании низкой концентрации в клетке Na+ и высокой концентрации K+. Ряд данных указывает на снижение активности насоса при апоптозе (см. обзор: Yu, 2003b). Деградация обеих субъединиц натриевого насоса при апоптозе тимоцитов, вызванном дексаметазоном, показана методом иммуноблотинга (Mann et al., 2001). Деградация каталитической и регуляторной субъединиц Na+, K+-АТФазы, уменьшение входного уабаин-чувствительного потока Rb+ и проапоптозное действие уабаина (ингибитора Na+, K+-АТФазы) при Fas-индукции показаны на клетках Jurkat (Bortner et al., 2001). Деградация регуляторной субъединицы Na+, K+-АТФазного насоса показана при апоптозе клеток MCF7, индуцированном стауроспорином (Dьssmann et al., 2003). Существенное уменьшение уабаин-чувствительного входного потока Rb+ наблюдали при апоптозе клеток P31, вызванном амфотерицином B (Marklund et al., 2001). Рентгеновский микроанализ показал, что апоптоз клеток U937, вызванный стауроспорином, сопровождается снижением входного потока рубидия через натриевый насос (Arrebola et al., 2005a, 2005b).

При CD95-индуцированном апоптозе клеток Jurkat были отмечены уменьшение числа сайтов связывания уабаина и изменение константы связывания, что, по мнению авторов, указывает на конформационные изменения соответствующей субъединицы натриевого насоса (Nobel et al., 2000). Описано уменьшение общего уровня АТФ в апоптозных клетках, которое, по мнению некоторых авторов, может быть причиной снижения активности насоса. В связи с этим необходимо отметить, что, по другим данным, на клетках HeLa, PC12 и U937 при апоптозе, вызванном стауроспорином, фактором TNF или этопозидом, уровень АТФ в цитозоле возрастает (Zamaraeva et al., 2005).

Большая группа работ посвящена исследованию влияния уабаина на апоптоз.

На трансфицированных клетках PW с повышенной экспрессией Bcl-2 показано увеличение активности Na+,K+-АТФазы, сопряженное с увеличением устойчивости к апоптозу. Эффект снимался ингибитором натриевого насоса уабаином (Gilbert, Knox, 1997).

Увеличение клеточного сжатия при действии уабаина наблюдали при CD95-индуцированном апоптозе клеток Jurkat. Авторы пришли к выводу о том, что ингибирование Na+,K+-АТФазы способствует апоптозному уменьшению объема клетки (Nobel et al., 2000). Усиление апоптоза активированных лимфоцитов уабаином наблюдали при Fas-индуцированном апоптозе (Esteves et al., 2005). Противоположный результат был получен при исследовании апоптоза, вызванного ультрафиолетовым облучением, на клетках HL60, у которых изменения содержания субъединиц Na+,K+-АТФазы не было. Инкубация клеток с уабаином приводила к снижению числа клеток с уменьшенным объемом и уменьшению числа апоптозных тел по результатам проточной цитометрии (McCarty, Cotter, 1997). Эти различия, возможно, обусловлены тем, что в одном случае имел место рецепторный, а в другом -- митохондриальный механизм индукции апоптоза.

По данным Орлова с сотрудниками (Orlov et al., 1999), при апоптозе гладкомышечных клеток уабаин подавляет каспазную активность независимо от типа индуктора.

K+-каналы. Насчитывают по крайней мере 14 разновидностей K+-каналов, так или иначе причастных к апоптозу. Показано, что апоптоз может быть предотвращен блокированием K+-каналов. Так например, при апоптозе эозинофилов уменьшение размеров клеток ингибируется блокатором K+-каналов 4-аминопиридином (Beauvais et al., 1995).

При апоптозе, индуцированном через рецептор или действием стауроспорина, в клетках HeLa и U937 не наблюдали уменьшения клеточного объема в присутствии хинина и бария (Maeno et al., 2000). AVD лимфоцитов предотвращалось при блокировании кальций-чувствительных калиевых каналов хинином, клотримазолом или харибдотоксином (Elliot, Higgins, 2003).

Показано, что при апоптозе изменяется состояние K+-каналов (Lang et al., 2006). Увеличение интегральной проводимости калиевых каналов KV наблюдали при индукции стауроспорином апоптоза гладкомышечных клеток (Ekhterae et al., 2001). Увеличение проводимости калиевых каналов maxi-K показано при апоптозе гладкомышечных клеток (Krick et al., 2001). На клетках Jurkat при Fas-индуцированном апоптозе наблюдали увеличение активности каналов KV 1.3 (Storey et al., 2003). Противоположный результат был получен при исследовании Fas- и керамидиндуцированного апоптоза на клетках Jurkat, у которых было обнаружено уменьшение интегральной проводимости каналов KV 1.3 (Szabт et al., 1996;Gulbins et al., 1997). На основании компьютерного моделирования ионного и водного баланса клеток при апоптозе Верениновым с сотрудниками (2004б) было сделано заключение о том, что существенное уменьшение объема вследствие изменения интегральной проводимости K+-каналов возможно лишь в ограниченных условиях и только у клеток определенного типа.

Активацию потенциалзависимых Na+-к а н а л о в отмечали при апоптозе нейронов, вызванном кислородным голоданием (Banasiak et al., 2004). Ингибитор Na+-каналов сакситоксин предотвращал индуцированный через Fas-рецептор апоптоз клеток Jurkat (Bortner, Cidlowski, 2003). Показано влияние на уменьшение объема клеток при апоптозе активности Cl--к а н а л, играющих важную роль в реакции регуляторного изменения объема при гипотонии (Maeno et al., 2000). Выход Cl- через каналы ORCC наблюдали при Fas-индуцированном апоптозе клеток Jurkat (Szabт et al., 1998). Активацию Cl--каналов VSOR наблюдали при апоптозе клеток HeLa, индуцированном стауроспорином, Fas или TNF (Shimizu et al., 2004). Активация тех же каналов отмечена при апоптозе кардиомиоцитов мыши (Wang et al., 2005; Okada et al., 2006).

Другие тракты. Имеются указания на то, что спонтанный апоптоз тимоцитов сопровождается активацией Na+/H+-обменника, Na+/HCO3 - /CO3 2- -к о т р а н спо р т е р а и Cl-/HCO3 - -обменника (Tsao, Lei, 1996).

Ингибирование Na+/H+-обменника отмечено при апоптозе клеток Jurkat, Molt4, CEM и K562 (Lang et al., 2000; Rich et al., 2000). Ингибирование Na+/K+/2Cl--котранспо р т е р а показано на клетках P31, апоптоз которых индуцировали амфотерицином B (Marklund et al., 2001).

Биологическое значение апоптоза

Апоптоз принимает участие:

1. В ряде физиологических и патологических процессах, в т.ч. в запрограммированном разрушении клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением "запрограммированной смерти клетки", это определение апоптоза широко используют различные исследователи. В настоящее время становится очевидным, что в нормальных клетках организма имеется четкая информация о естественной продолжительности жизни. Есть клетки-долгожители, которые, возникнув на первых этапах деления зародыша, существуют практически до конца жизни данного организма, выполняя сугубо специфическую функцию. Однако в эмбриональный период жизни организма многие клетки возникают для того, чтобы выполнить определенную задачу и затем быстро исчезнуть. Очень демонстративны этом отношении организмы, жизненный цикл которых происходит с метаморфозом. Например, головастик лягушки, при переходе во взрослое состояние теряет наружные жабры и хвост. Совершенно очевидно, что продолжительность жизни клеток этих органов должна быть строго запрограммирована. У бабочки на стадии куколки происходит апоптоз практически 90% клеток гусеницы и возникают новые ткани и органы.

В эмбриогенезе у высших животных и человека функционируют особые гены, в норме контролирующие снижение функций и гибель клеток, происходящую в массовом масштабе в процессе зародышевого развития. Например, формирование конечностей у позвоночных связано не только с возникновением миллионов клеток, но и с гибелью и резорбцией миллионов других клеток. Судьба этих последних, по мнению Л. Хейфлик, определяется "часами смерти", которые действуют весьма точно.

2. В гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации, патологической атрофии гормон-зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами. В настоящее время с наибольшей определенностью можно говорить о морфогенетической роли гормонов.

Проблема гормональной регуляции апоптоза особенно хорошо изложена в отношении ювенильного гормона насекомых, играющего колоссальную роль в морфогенезе, кроме того, имеются данные о гормоне щитовидной железы - тироксине. Известна история с открытием в горных озерах Мексики аксолотля - амфибии, которая как бы не прошла полный морфогенез и имеет наружные жабры, внешне напоминая большого головастика.

Причем аксолотль, не завершив положенных превращений, по существу, не перейдя во взрослое состояние, отлично размножается. В переводе аксолотль означает водяная игрушка. Местные индейцы видели в этом неповоротливом забавном существе - игрушку озерных богов, культ которых сохранился среди горных племен до сих пор. Известно, что в горной воде имеется недостаток йода, без которого не может синтезироваться тироксин - гормон щитовидной железы. Оказалось, что аксолотль имеет генетически детерминированную недостаточность функционирования щитовидной железы, и если ему ввести тироксин - гормон щитовидной железы, то морфогенез закончится превращением в качественно новый организм - амбистому - амфибию, давно известную зоологам. Тироксин как бы включает механизм апоптоза клеток временных личиночных тканей и органов, и это завершает морфогенез и превращение личинки во взрослый организм. Совершенно очевидно, что в морфогенезе в процессе запуска механизма апоптоза необходима очень высокая точность. При действии гормонов отмечается специфичность их действия, проявляемая не только на органном уровне, но даже в пределах различных участков одной и той же ткани.

3. В удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции. В живом организме постоянно действуют механизмы поддержания гомеостаза (баланса между количеством появляющихся и гибнущих клеток, между синтезом и утилизацией различных медиаторов, компонентов внеклеточного матрикса и т.д.). Численность популяции клеток связана с двумя противоположно направленными процессами: митотическим размножением и гибелью клеток (апоптозом и некрозом). Апоптоз может быть определен как физиологический процесс освобождения от ненужных организму клеток. Апоптотическая гибель клеток наблюдается при дифференцировке и формировании тканей и органов. Во взрослом организме биологическая роль апоптоза сводится к регулированию численности популяции и к элиминации клеток, вредных для организма - мутантных или пораженных вирусом. Регулирование численности клеток путем апоптоза наиболее распространено в быстропролиферирующих популяциях (гемопоэтические клетки, половые клетки). Таким образом, апоптоз - широко распространенный общебиологический процесс, ответственный за поддержание постоянства численности и выбраковку дефектных клеток. Результатом апоптоза является постепенное и медленное избавление от «ненужных» в функциональном отношении на данный момент клеток. При этом не развивается воспаление и не нарушается нормальное функционирование соседних клеток, а также не происходит соединительнотканного замещения, что позволяет сохранить структуру органа. Функциональные элементы клетки, находящейся в состоянии апоптоза, не разрушаются, а поглощаются другими клетками и могут использоваться дальше. Особенно большую роль апоптоз играет в эмбриогенезе, когда важно постепенно избавляться от выполнивших свою функцию клеток. Другая важная функция клеточного самопожертвования - удаление клеток-инвалидов и клеток-диссидентов с серьезными нарушениями структуры или функции генетического аппарата. В частности, апоптоз - один из основных механизмов самопрофилактики онкологических заболеваний. Представляется естественным, что мутантно измененная клетка в случае неспособности к нормальной жизнедеятельности подвергается апоптозу и разрушается. По-видимому это древнейший механизм очищения организма от генетически дефектных клеток, возникший еще у первых форм примитивных многоклеточных эукариот.

4. В гибели отдельных клеток в опухолях, в основном, при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли. Существование программы клеточной гибели может быть эффективно использовано в медицине. В частности, стимуляция апоптозной системы - одно из направлений противораковой терапии. С другой стороны, избыточный апоптоз может сам по себе быть причиной некоторых заболеваний, в частности дегенеративных повреждений нервной системы. В этом случае задача врача - наоборот, предотвратить вредное для организма клеточное самоубийство.

5. В гибели клеток иммунной системы, как В-, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе. Апоптоз активно включается в развитие той или иной морфофункциональной системы организма. Наиболее ярко это можно увидеть на примере созревания иммунной системы. На начальном этапе все иммунокомпетентные клетки проходят "обучение" в тимусе и лимфатических узлах, при этом каждый клон клеток приобретает способность распознавать определенный антиген. В ходе этого процесса возможно "патологическое научение" с последующим распознаванием как чужеродных антигенов своего организма и формированием иммунного ответа на них. В данном случае апоптоз является защитным механизмом, уничтожающим ставшие опасными клетки. В то же время лимфоцитарные клоны, распознающие антигены, не встречающиеся в течение жизни человека, не имеют функционального значения и апоптозируют.

6. В гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни "трансплантат против хозяина".

7. В повреждении клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени как тельца Каунсильмана. Хорошо установленный факт, что в инфицированной клетке начинают продуцироваться вещества, направленные против паразита. Например, вирусная инфекция приводит к стимуляции интерфероногенеза в эукариотических клетках. В прокариотах против бактериофагов сложилась система, продуцирующая специфические нуклеазы, способные разрезать ДНК фага и модифицировать ее, после чего фаг становится неопасным для клетки хозяина. Возможно, что апоптотическая гибель клетки наступает врезультате возникновения неконтролируемой продукции нуклеаз зараженной клеткой. Т.е.как бы происходит самодеструкция.

Известно, что при инфекционном процессе в клетках человека и животных наблюдается образование самых разнообразных изменений в хромосомном аппарате делящихся клеток. Вирусы, бактерии, риккетсии и другие микроорганизмы способны вызвать поражение аппарата деления клетки, нарушая процесс расхождения хромосом. Но особенно часто при инфекциях наблюдаются клетки с хромосомными аберрациями, многие из которых резко снижают жизнедеятельность. Если относительно вирусов возможно было сказать, что они могут непосредственно проникать в ядерный аппарат и даже ассоциироваться с ДНК клетки хозяина, то относительно бактерий такое предположение неправомерно.

Высказано предположение, что бактерии, в частности стрептококки, выделяют ферменты, обладающие нуклеазной активностью, и атака нуклеаз бактерий способствует возникновению хромосомных аберраций в пораженной клетке. При добавлении токсина стрептококка - стрептолизина-О, к культурам фибробластов человека отчетливо наблюдается увеличение числа клеток с цитогенетическими нарушениями, что в дальнейшем вызывало кариорексис и кариолизис пораженных клеток. Дальнейшие исследования показали, что стрептолизин-О содержал различные типы нуклеаз. Было сделано предположение, что именно эти нуклеазы и являются первопричиной возникших цитогенетических изменений фибробластов.

8. В гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов.

Индукторы и ингибиторы апоптоза

Апоптоз - это биохимически специфический тип гибели клетки. В зависимости от пути, по которому осуществляется активация каспаз, различают разные типы клеток.

1. Клетки типа I (в частности, линия лимфобластоидных В-клеток SKW и Т-клетки линии Н9) подвергаются ПКС по пути, зависимому от апоптозных рецепторов плазматической мембраны без участия митохондриальных белков.

2. Клетки типа II (например, линии Т-клеток Jurkat и СЕМ) погибают по пути апоптоза, зависимому от митохондриального цитохрома с. ПКС, вызванная химиотерапевтическими соединениями, УФ- или i-облучением, по-видимому, напрямую связана с апоптозной функцией митохондрий: клетки, лишенные генов белка APAF-1 или каспазы-9, устойчивы к химио- и радиационной обработке, но погибают при индукции Fаs-рецептора.

Апоптоз могут вызывать как внутриклеточные сигналы, так и внешние, опосредующие свое действие через рецепторные системы.

1 - физиологические активаторы апоптоза:

* цитокины (интерлейкины, фактор некроза опухоли, интерфероны, колониестимулирующие факторы, пептидные ростовые факторы) и гормоны (глюкокортикоиды, половые гормоны, гормоны гипофиза). Их влияние на клетки неоднозначно: для одних клеток они выступают в роли индуктора, для других - ингибитора апоптоза. Это зависит от типа клетки, стадии ее дифференцировки и функционального состояния:

* недостаток факторов роста,

* потеря связи с матриксом,

* глюкокортикоиды,

* некоторые вирусы,

* свободные радикалы,

* ионизирующая радиация.

При воздействии активаторов или отсутствии ингибиторов происходит активация эндогенных протеаз и эндонуклеаз. Это приводит к разрушению цитоскелета, фрагментации ДНК и нарушению функционирования митохондрий. Клетка сморщивается, но клеточная мембрана остается интактной, однако повреждение ее приводит к активации фагоцитоза. Погибшие клетки распадаются на небольшие, окруженные мембраной, фрагменты, которые обозначаются как апоптотические тельца. Воспалительная реакция на апоптотические клетки не возникает.

* Наиболее часто внещняя активация апоптоза осуществляется в результате развития эксайтотоксичности (англ. excite - возбуждать). Основой этого феномена является нарушение проницаемости ионотрофных рецепторов, регулирующих содержание калия, натрия, хлора и кальция во вне- и внутриклеточном пространстве в результате воздействия возбуждающих нейротрансмиттеров - аминокислот аспартата и глутамата. Результатом активации ионотрофных рецепторов является повышенный вход кальция в клетку с последующей стимуляцией протеаз и разрушением клеточных структур. Этот процесс сопровождается также возрастанием перекисного окисления липидов и последующим развитием окислительного стресса.

В настоящее время принято считать, что гены, участвующие в регуляции роста и развития опухолей (онкогены и гены-супрессоры опухолей), играют регулирующую роль в индукции апоптоза. К ним относятся:

1 - bсl-2 онкоген, который ингибирует апоптоз, вызванный гормонами и цитокинами, что приводит к повышению жизнеспособности клетки;

2 - белок bах (также из семейства bсl-2) формирует димеры bах-bах, которые усиливают действие активаторов апоптоза. Отношение bcl - 2 и bах определяет чувствительность клеток к aпоптотическим факторам и является ''молекулярным переключателем", который определяет, будет ли происходить рост или атрофия ткани;

3 - с-mус онкоген, чей белковый продукт может стимулировать либо апоптоз, либо рост клеток (при наличии других сигналов выживания, например, bcl-2);

4 - ген р53, который в норме активирует апоптоз, но при мутации или отсутствии (что обнаружено в некоторых опухолях) повышает выживаемостъ клеток. Установлено, что р53 необходим для апоптоза при повреждении клетки ионизирующим излучением, однако при апоптозе, вызванном глюкокортикоидами и при старении, он не требуется .

К генам-активаторам также относятся bak, Nbk/Вikl, Bad, bcl-хS, Bcl-Xs, Bik, Bid, Bak. Выяснение роли белков семейства Bcl-2 занимает центральное место в изучении регуляции процесса апоптоза.

Ингибиторы апоптоза:

* факторы роста,

* клеточный матрикс,

* половые стероиды,

* некоторые вирусные белки;

*к ингибиторам относятся гены: bcl-2, bcl-хL, Mcl-l, bcl-w, аденовирусный EIB 19K, Эпштейн-Барр-вирусный BHRFl, Bcl-XL.

Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что в конечном счете влияет на развитие апоптоза клеток. Поэтому считается, что соотношение активных форм этих белков определяет реостат жизни и смерти клетки. Члены этого семейства взаимодействуют друг с другом. Одним из уровней регуляции апоптоза является взаимодействие белок-белок. Белки семейства bcl-2 формируют как гомо- так и гетеродимеры. Например, bcl -2-ингибиторы могут образовать димеры bcl - 2-активаторами. Таким образом, жизнеспособность клеток зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза. Например, bcl-2 взаимодействует с bах; при преобладании первого жизнеспособность клетки повышается, при избытке второго - уменьшается. К тому же белки семейства bcl-2 могут взаимодействовать с белками, не относящимися к этой системе. Например, bcl-2 может соединяться с R-ras, который активирует апоптоз. Другой белок, Bag- 1, усиливает способность bcl-2 ингибировать апоптоз. Продукт р53 гена следит за целостностью генома при митозе. При нарушении целостности генома клетка переключается на апоптоз. Наоборот, белок bcl-2 ингибирует апоптоз. Таким образом, недостаток р53 или избыток bcl-2 при водит к накоплению клеток: эти нарушения наблюдаются в различных опухолях. Изучение факторов, регулирующих апоптоз имеет важное значение в разработке лекарственных препаратов, усиливающих гибель клеток злокачественных новообразований.

Апоптоз может регулироваться:

* внешними факторами,

* автономными механизмами.

Воздействие внешних факторов. Апоптоз может регулироваться действием многих внешних факторов, которые ведут к повреждению ДНК. При невосстановимом повреждении ДНК путем апоптоза происходит элиминация потенциально опасных для организма клеток. В данном процессе большую роль играет ген супрессии опухолей р53. К активации апоптоза также приводят вирусные инфекции, нарушение регуляции клеточного роста, повреждение клетки и потеря контакта с окружающими или основным веществом ткани. Апоптоз - это защита организма от персистенции поврежденных клеток, которые могут оказаться потенциально опасными для многоклеточного организма.

При стимуляции тканей каким-либо митогеном ее клетки переходят в состояние повышенной митотической активности, которая обязательно сопровождается некоторой активацией апоптоза. Судьба дочерних клеток (выживут они или подвергнутся апоптозу) зависит от соотношения активаторов и ингибиторов апоптоза:.

Автономный механизм апоптоза. При развитии эмбриона различают три категории автономного апоптоза: морфогенетический, гистогенетический и филогенетический.

Морфогенетический апоптоз участвует в разрушении различных тканевых зачатков. Примерами являются:

* разрушение клеток в межпальцевых промежутках;

* гибель клеток приводит к разрушению избыточного эпителия при слиянии небных отростков, когда формируется твердое небо.

* гибель клеток в дорсальной части нервной трубки во время смыкания, что необходимо для достижения единства эпителия двух сторон нервной трубки и связанной с ними мезодермы.

Нарушение морфогенетического апоптоза в этих трех локализациях приводят к развитию синдактилии, расщеплению твердого неба и spina bifida соответственно.

Гистогенетический апоптоз наблюдается при дифференцировке тканей и органов, что наблюдается, например, при гормональнозависимой дифференцировке половых органов из тканевых зачатков. Так, у мужчин клетками Сертоли в яичках плода синтезируется гормон, который вызывает регрессию протоков Мюллера (из которых у женщин формируются маточные трубы, матка и верхняя часть влагалища) путем апоптоза.

Филогенетический апоптоз участвует в удалении рудиментарных структур у эмбриона, например, пронефроса.

При различных состояниях может наблюдаться как ускорение, так и замедление апоптоза. Несмотря на то, что апоптоз могут активировать различные факторы, характерные для определенных типов клеток, однако конечный путь апоптоза регулируется точно установленными генами и является общим, независимо от причины активации апоптоза.

Все факторы, усиливающие или ослабляющие апоптоз, могут действовать:

* прямо на механизм гибели клетки,

* опосредованно, путем влияния на регуляцию транскрипции.

В геноме любой клетки присутствуют гены, реагирующие на действие индукторов и ингибиторов апоптоза и соответственно являющиеся активаторами и блокаторами этого процесса. Геном, стимулирующим синтез внутриклеточных протеаз и вследствие этого индуцирующим апоптоз, является р53. Действие протеаз основано на медленном расщеплении субмембранных и цитоплазматических микрофиламентных и микротрубочных структур, а также на фрагментации ДНК. Это приводит к формированию мембранных везикул, включающих в себя элементы внутриклеточного содержимого (митохондрии, рибосомы). Данный процесс осуществляется довольно медленно и отличается от неспецифического действия кальций зависимых протеаз, заключающегося в тотальном разрушении белковых клеточных структур. При этом реализуется следующий механизм умирания клетки:

1) поступление индукторного сигнала;

2)активация определенных генов (в первую очередь р53) и синтез специфических протеаз;

5) фрагментация ДНК, затем сморщивание ядра;

3) разрушение цитоскелета (блеббинг);

4) формирование и отпочковывание везикул, окруженных мембраной;

6) поглощение везикул и остатков клетки (апоптозные тела) соседними клетками и тканевыми макрофагами без развития воспаления и соединительнотканного замещения.

Казнящие каспазы

Протеазы играют ведущую роль в запуске и развитии процесса апоптоза. При апоптозе, в отличие от физиологического ответа клетки, действуют свои, характерные только для апоптоза (в меньшей степени для некроза), специализированные необратимые реакции протеолиза, катализируемые специфическими протеазами, относящимися к классу цистеиновых протеаз. Эта группа протеаз, названных каспазами (caspases), существует обособленно. С - отражает механизм протеолиза (в активном центре находится цистеин). Asp - обозначает аспарагиновую кислоту, которая распознается как субстрат. Ase - окончание, свойственное ферментам. В настоящее время в различных клетках млекопитающих обнаружено 10 каспаз, образующих ферментативный каскад.

Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз - семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты. На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства:

а) каспазы-l (каспазы 1, 4, 5),

б) каспазы-2 (каспаза-2)

в) каспазы-3 (каспазы 3, 6-10).

Каспазы имеют высокую степень гомологии по своей аминокислотной последовательности, схожи по структуре и по субстратной специфичности. Они синтезируются в виде проферментов (30-50 кД), которые содержат 3 домена: N-концевой домен, большую субъединицу (20 кДа) и малую субъединицу (10 кДа). Во время активации каспазы подвергаются протеолитическому отщеплению N-концевого домена, отличающегося наибольшей вариабельностью как по размерам, так и по аминокислотной гомологии. Этот процессинг между доменами сопровождается ассоциацией большой и малой субъединицы в гетеродимер с формированием активного центра. Кристаллическая структура двух каспаз (caspas-1 и caspase-3) определена: в обоих случаях гетеродимер ассоциирован в тетрамер с формированием 2 каталитических сайтов (рис.3).