Аналіз протеому хлоропластів клітин обкладки та мезофілу кукурудзи

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Особливості будови С4 рослин

У більшої частини тропічних рослин, а також у рослин, що вирощуються у помірній зоні, але походять із тропіків, наприклад у кукурудзи, цукрової тростини або сорго, для фіксації СО2 використовується шлях, який називається С4-шляхом, або шляхом Хетча-Слека(9). Для листя цих рослин характерна анатомічна будова кранц-типу (від нім. Kranz - вінок). Хлоропласти знаходяться в клітинах листка, розміщених навколо судинного пучка двома концентричними шарами. Внутрішній шар називають клітинами обкладки (КО) судинного пучка, зовнішній шар - клітинами мезофілу (КМ)(8). Таким чином, С4 шлях фотосинтезу, при якому рослини здатні фіксувати СО2 як в циклі Кальвіна, так і в реакціях з утвореням малату, розподілений між двома функціонально та біохімічно різними типами пластид.(8) Цикл Кальвіна функціонує в хлоропластах обкладки. Первинним продуктом фіксації СО2 є тривуглецева сполука - фосфогліцеринова кислота. Цей шлях отримав назву С3-шляху. В хлоропластах мезофілу фіксація вуглецевої кислоти відбувається в результаті приєднання СО2 до фосфоенолпірувату, що веде до утворення кислот з чотирма атомами вуглецю - оксалоацетату та малату(8). Таким чином, у С4 рослин фіксація СО2 здійснюється в клітинах мезофілу по С4-шляху, а синтез глюкози йде в клітинах обкладки по С3-шляху (9).

Хлоропласти мезофілу в рослинах С4 типу розміщені в клітині невпорядковано, містять стопки гран і невелику кількість зерен крохмалю. Хлоропласти обкладки відрізняються відносно великим розміром, не мають, як правило, гран і містять багато зерен крохмалю. У листку хлоропласти обкладки та мезофілу лежать близько один до одного та можуть легко обмінюватись продуктами фотосинтезу(8). У КМ хлоропласти розміщені невпорядковано вздовж клітинної стінки, коли у КО вони зазвичай локалізуються ближче до стінки, яка межує з судиною (Рис.1)(10).

Рис.1 - Локалізація хлоропластів КМ та КО у кукурудзи (10)

2. Аналіз протеомів пластид КО та КМ

Диференційовані хлоропласти КО та КМ акумулюють різні набори фотосинтетичних ферментів та білків, що пристосовує їх до кооперативної взаємодії у фіксації СО2(7). Наприклад, рибулозо-1,5-дифосфат карбоксилаза/оксигеназа (Рубіско) (RBCL і RBCS) акумулюється виключно у пластидах КО, коли фосфопіруват дикіназа (PPDK) та фотосистема ІІ(ФСІІ) тільки в КМ(7). Біохімічні дослідження пластид двох типів показують, що в хлоропластах КМ суттєво переважає фотосинтетичний лінійний транспорт електронів, який постачає АТФ та NADPH для автотрофного росту, імпорту пірувату з КО для генерації фосфоенолпірувату та для перетворення С4 кислоту оксалоацетат у С4 кислоту малат. В свою чергу КО імпортують і декарбоксилюють малат в піруват, використовуючи вивільнений при цьому NADPH та СО2 для генерації карбогідратів у циклі Кальвіна та для перетворення їх надлишку у крохмаль(7). Додатковий NADPH імпортується з КМ через тріозофосфатну човникову систему. Різниця в багатьох інших хлоропласт них функціях, таких як синтез жирних кислот, нуклеотидів, гормонів та амінокислот, в більшості, не відома у С4 рослин(7).

3. Білкові комплекси тилакоїдних мембран

Хлоропласти клітин обкладки та клітин мезофілу відрізняються між собою за кількісним та якісним складом білків, складових мембранної та стромальної фракцій органел. Тилакоїдна мембрана хлоропластів містить білкові комплекси, що залучені до виконання основних функцій цих органел. До них відносяться ФСІ, ФСІІ, Cytb6f, АТФ-синтетазний комплекс та NDH-дегідрогеназний. Мембрани хлоропластів також включають білки транспортери, білки, залучені до підтримання гомеостазу.

Тилакоїдні мембрани хлоропластів КМ, подібно до хлоропластів С3 рослин, несуть усі складові для здійснення лінійного транспорту електронів: ФСІІ, Cytb6f, ФСІ. На відміну від них, диференційовані хлоропласти КО містять малофункціональну ФСІІ та нормальну або підвищену кількість ФСІ, тоді як Cytb6f та АТФ-синтетазний комплекси розподілені між тилакоїдами КМ та КО приблизно порівну (Табл..1).

Таблиця 1 - Співвідношення кількості білкових комплексів у хлоропластах двох типів (КМ та КО).

ФСІІ складається з реакційного центру, який оточує корові субодиниці та антенних білків (LНCII). 15 білків корових субодиниць та реакційного центру кодуються пластидним геномом, тоді як інші - ядерним. Відношення КО/КМ для корових субодиниць D1(б реакційного центру - 7), CP47, CP43, cytb559?, кодованих хлоропластним геномом, коливається в межах 0,25-0,72. Для субодиниць, кодованих ядром, воно в середньому нижче - 0,22-0,54. 2 білки родини LНCII мали співвідношення 1,03 та 1,23, порівняно з іншими 16-ма (Табл..1), що свідчить про їх функціонування у обох типах клітин(6). Виявлено фактори збірки та/або стабілізації ФСІІ, до яких належить LPA1 (накопичується в КМ) та HCF136 (рівномірно розподілений).(6) HCF136 присутній у КО, входить до комплексу з меншою молекулярною масою, ніж у КМ, що може бути пов'язано зі зниженим рівнем тут ФСІІ.(6)

Білки ФСІ та LНCI акумулюються більше в хлоропластах КО зі значенням співвідношення КО/КМ 1,57 та 1,72 відповідно, але виявлені винятки для PsaP(0,93) і LHCI-680B(0,60). Два фактори збірки та стабілізації ФСІ були виявлені: YCF3 та YCF4. Фактор YCF3 ідентифікувався тільки в хлоропластах КМ, тоді як YCF4 у КО із співвідношенням КО/КМ - 2,7.(6)

Cytb6f комплекс включає субодиниці сytf, Rieske Fe-S та субодиницю IV, в акумуляції яких між хлоропластами КО та КМ, суттєвої різниці не виявлено (1,03). Лише для субодиниці Rieske Fe-S встановлена наявність двох ізоформ білка (КО/КМ - 0,74 та 1,08).

9 субодиниць АТФ-синтетазний комплексу приблизно рівномірно розподіляються між хлоропластами обох типів із співвідношенням КО/КМ - 1,33.

Тилакоїдний NDH комплекс залучений в один з двох шляхів циклічного електронного потоку крізь ФСІ, а також у хлородихання. У С3 рослин NDH комплекс складає лише 0,2% від загальної кількості тилакоїдних білків. 11 NDH субодиниць кодуються хлоропластним геномом, решта - ядерним. Для усіх субодиниць комплексу виявлена їх стійка акумуляція у пластидах КО з КО/КМ - 3.0.

У мембранній фракції також виявлені білки з хлорофіл зв'язуючими доменами, функціонування яких пов'язано з відповіддю на світловий стрес. Це білки Ohp1, Ohp2, Lil3.2 та Lil4/Sep1, який був знайдений тільки в тилакоїдах КМ. Для Ohp1, Ohp2, Lil3.2 співвідношення КО/КМ становить 0,69, 0,18(0,32) і 1 відповідно.(6)

Цикл Кальвіна, гліколіз, С4 карбоновий човниковий механізм, окисний пентозофосфатний шлях, фотодихання і синтез крохмалю.

Цикл Кальвіна функціонує в пластидах КО, де накопичуються всі необхідні ферменти для цього процесу. Такі специфічні білки циклу Кальвіна як велика та мала субодиниці рубіско (RBCL та RBCS), рубіско активаза, фруктозо-дифосфат альдолаза-2, фосфорибулокіназа, седогептулозо-1,7-дифосфатаза стійко акумулюються в КО. Ферменти циклу Кальвіна (фосфогліцераткіназа, гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогеназа, тріозофосфатізомераза), залучені у редукцію тріозофосфатів ( ІІ стадія гліколізу), накопичуються переважно в КМ або рівномірно розподіляються між хлоропластами обох типів (6, 7).

Для малат-піруватного С4 човникового механізму описано стійку експресію піруватортофосфатдикінази (PPDK) та NADP-залежної малатдегідрогенази (MDH) у КМ, тоді як NADH-малік фермент ідентифікувався тільки в КО (6,7). (Рис.2) У кукурудзи для декарбоксилування діє саме фермент NADP-ME, тому кукурудза належить до типу - NADP-ME (оксалоацетат в мезофільних клітинах рослин цього типу перетворюється в малат за рахунок NADP-малатдегідрогенази).(11)

Ферменти нециклічного окисного та циклічного пентозофосфатних шляхів (рибулозо-5-фосфат-3-епімераза, транскетолаза, рибозо-5-фосфат ізомераза), головним чином, акумулюються в пластидах КМ. Такий розподіл може свідчити про імпорт карбогідратів з КО в КМ як ресурсу карбонвмісних проміжних сполук для різних метаболічних шляхів(5,7).

Виявлено один фермент фотодихання - фосфогліколат фосфатаза, що накопичується у пластидах КО(5, 7).

Для ферментів, що беруть участь у синтезі крохмалю, виявлено суттєве їх накопичення у пластидах КО, в 3 рази більше ніж у хлоропластах КМ (5). ADP-глюкозопірофосфорилаза, що складається з великої і малої субодиниць і каталізує перший крок біосинтезу крохмалю, в 1,7 раз більшій кількості акумулюється в КО. Виявлено, що велика субодиниця цього ферменту має дві ізоформи: APGL1 та APGL2. APGL1 приблизно в 10 раз більше ніж APGL2, і в хлоропластах КО він накопичується в двічі більшій кількості. Ізоформа APGL2 є специфічною для КМ, оскільки накопичується її там в 10 раз більше(5). Альдозо-1-епімераза та крохмаль синтетаза в 5 та 3,3 рази, відповідно, більшій кількості накопичуються в КО ніж в КМ (7).

Рис.2 - Схематичне зображення розподілу та функціональної участі ферментів та проміжних сполук циклу Кальвіна, фотодихання, окисного пентозофосфатного шляху, синтезу крохмалю, малатний човниковий механізм, так як і його С3 гомологи (малатдегідрогеназа та піруват-ортофосфат дикіназа) між двома типами пластид. Червоним позначено білки, що накопичуються переважно в КО, синім - в КМ(5).

4. Трансляційний апарат хлоропласту

Хлоропласти КО та КМ містять геном (з 104 генами), що кодує фотосинтетичні білки (RBCL та тилакоїдні білки), 4 рРНК, 30 тРНК, 70 білків, залучених у експресію генів пластид.(7) В експресію пластидних генів також залучені сотні білків, кодованих ядром(7). До основних складових пластидної трансляційної машинерії відносяться тРНК синтетази, фактори ініціації (IF2, IF3), фактори елонгації (BipA, Tu, G, P), пластид-специфічні рибосомальні білки (PSRP1, -2, -3), 30 S та 50 S рибосомальні частинки та ін(5). Переважаюча більшість вищезазначених білків акумулюється в основному в хлоропластах КМ, що свідчить про вищу трансляційну активність пластид КМ ніж КО, зокрема на поверхні тилакоїдів(5). Загальний рівень пластидних рибосом, що в основному локалізуються на поверхні тилакоїдних мембран, у КМ в 3 рази вищий ніж у КО.(5, 6) Крім того, для рибосомальних білків L12.1, L10, S1, S5 виявлена переважаюча або виключна їх акумуляція в хлоропластах КМ, що свідчить про різний склад рибосом 70 S у КО та КМ.(7) Асоційовані з рибосомами білки (пластид-специфічний рибосомальний білок PSRP-7, елонгаційний фактор Tu), тРНК синтетази також, головним чином, акумулюються у пластидах КМ(5, 6).Так, елонгаційний фактор G у 8 раз більшій кількості акумулюється в КМ пластидах ніж в КО, як і елонгаційний фактор Tu (від 2 до 6 раз більше).(7)(для елонгаційних ф - порівну розподіл - 5) Для тРНК-синтетаз співвідношення КО/КМ в середньому складає 0,14.(5) Мембранна фракція КМ містить в 20 раз більше рибосомальних білків ніж мембрани КО(5). Відомо, що хлоропластні рибосоми асоційовані з тилакоїдними мембранами і на них здійснюється синтез хлоропласт-кодованих тилакоїдних білків. Таке низьке співвідношення КО/КМ тилакоїд-зв'язаних рибосом може пояснюватись великою кількістю ФСІІ та частим її оновленням у КМ. NDH комплекс КО також містить багато хлоропласт-кодованих білків, проте його відносна концентрація та швидкість оновлення в кілька разів нижчі ніж у ФСІІ(5).

5. Шаперони, ізомерази, протеази.

Родини шаперонів «домашнього господарства» Hsp70/GrpE та Cpn60/20, до якої входять Cpn60?, Cpn60? та Cpn20 рівномірно розподіляється між хлоропластами КО та КМ. Але для двох шаперонів родини Hsp70/GrpE цей розподіл значно зсунутий в бік КМ, де в 5-6 раз більшій кількості ці білки накопичуються. Це може бути пов'язано з виконанням ними специфічної функції у пластидах КМ, наприклад, у С. reinhardtii ці білки залучені у захист та відновлення ФСІІ, зокрема в умовах світлового стресу(7). Шаперони Hsp90 та ClpB3 в 2-6 раз більшій кількості акумулюються в пластидах КО, не зважаючи на досить низьку їх трансляційну активність(5).

Ізомерази порожнини тилакоїдів у різній кількості накопичуються у КО та КМ, відповідно до специфічного пристосування, наявності специфічних субстратів(5). Пептидил-проліл ізомераза TLP40 накопичується у тилакоїдах КМ, що може бути пов'язано з опосередкованим світлом фосфорилюванням білків субодиниць ФСІІ. Виявлені пептидил-проліл цис-транс ізомерази, залучені у біогенез субодиниці Rieske комплексу Cytb6f , що накопичуються у пластидах КО (КО/КМ - 1.7-3.1)(6)

Сlp протеазна система, локалізована у стромі, належить до протеаз «домашнього господарства» і розподіляється між хлоропластами двох типів приблизно рівномірно. Проте, присутні протеази з вузькою функціональною спеціалізацією та крайнім значенням співвідношення КО/КМ. Протеази DegP2, ейциламінопептидаза LAP1 та M24 амінопептидаза АРР2 в 2, 4 та 5 раз відповідно в більшій кількості акумулюються в пластидах КМ. Тоді як глутамілендопептидази (сGEP) та гліциламінопептиази (М1) в 4 та 2 рази більше в пластидах КО. Субстрати вказаних пептидаз не відомі, проте характер накопичення може свідчити про наявність специфічних субстратів у відповідних компартментах(5). Тилакоїд-асоційована протеаза DegP, що залучена у деградацію D1 білка, накопичується в хлоропластах КМ із співвідношенням КО/КМ - 0,56(6).

6. Імпорт білків

Кодовані ядерними генами хлоропластні білки, імпортуються через Toc-Tic комплекс, який складається з кількох зовнішніх та внутрішніх мембранних білків. Компоненти Tic комплексу(Tic110, Tic21, Tic40) акумулюються в основному в мембранах пластид КМ (КО/КМ - ~ 0,46, або тільки в КМ), що свідчить про більш активний імпорт білків в цих компартментах. Кілька шляхів вставки та транслокації тилакоїдних білків було відкрито у С3 та С4 рослин (напр..SecA/Y). SecA/Y шлях забезпечує вставку білків, кодованих хлоропластною та ядерною ДНК, у мембрани тилакоїдів. (6). Білок SecА накопичується у пластидах КМ, оскільки більшість SecА-залежних білків є компонентами комплексу ФСІІ. SecY являє собою загальний тилакоїдний канал імпорту мембранних білків, що розподіляється рівномірно між двома типами пластид (5).

7. Мембранні специфічні транспортери

В мембранах хлоропластів КМ у великій кількості (в 1,5 раз більше), порівняно з хлоропластами КО, локалізуються такі переносники: Mep2 і Mep3 (піруват/малат), OMT1 (2OG/Mal), Dit1 (OAA/2-оксоглутарат/Mal), РРТ (піруват/фосфоенолпіруват), ААТР1 (АТP/ADP), TRT (Pi/3PGA/3TP), ANTR1 (Pi), Pic1/Tic21 (Fe), Tim17/22 (амінокислоти). Переносник Mep3/4 (піруват/малат) у більшій кількості був знайдений у пластидах КО. Інші мембранні переносники( Dit2 (Glu/Mal), Mep1 (OAA?), КЕА і МАТЕ (катіони), РАА1 (Cu) та ін.) приблизно рівномірно розподілені між КО та КМ(5). Dit1, Dit2 у кукурудзи беруть участь у перенесенні малату, тоді як у С3 рослин (A.thaliana) ці переносники слугують процесу фотодихання(6). Mex1 - переносних мальтози, розміщений у внутрішній мембрані хлоропласта. Mex1 акумулюється в КО, що пов'язано з переважною локалізацією механізмів синтезу крохмалю та його деградації саме у пластидах цього типу. (6)

клітина обкладка мезофіл мембрана

Размещено на Allbest.ru