Молекулярно-биологическая характеристика прионных белков

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

Медицинский факультет

Кафедра микробиологии

Курсовая работа по медицинской микробиологии

Молекулярно-биологическая характеристика прионных белков

Грибова Оксана Михайловна

Научный руководитель:

Рыбальченко О. В.

Санкт-Петербург 2008 г.

Оглавление

Введение

Глава 1. Исторический обзор, развитие представлений о прионных белках

Глава 2. Структура и свойства прионных белков

2.1 Молекулярное строение PrPc и его функции

2.2 PrPc, теории о механизмах его превращения и накопления в организме

Глава 3. Прионные болезни

3.1 Межвидовой барьер и пути передачи прионных болезней

3.2 Классификация, патогенез и клинические проявления прионных болезней

3.3 Лечение и профилактика ТГЭ

Заключение

Список литературы

Приложения

Введение

С развитием технологий стало возможным исследовать казавшиеся ранее непонятными вещи, было совершено множество открытий и прорывов, человечество всё более углублялось в микрокосмос: открыт был атом, протоны, электроны, на пороге открытия мельчайших энергочастиц - также и в микробиологии были открыты такие принципиально новые инфекционные агенты, как прионы.

Прионные белки вызывают тяжёлые заболевания, практически всегда заканчивающиеся летально, и поэтому во многих лабораториях по всему миру сейчас учёные работают над разработкой эффективной терапии. Для устранения любой проблемы необходимо понять её суть - не так уж часто в медицине происходят случаи случайного попадания нахождения верного лекарства, и, чтобы ускорить это так называемое попадание, очень важно как можно подробнее изучить прионные белки (их строение, жизненный цикл, функционирование, патогенез заболеваний, ими вызываемых, генетику и пр.). Понимая механизмы, совершающиеся в организме, врач имеет намного больше шансов не навредить пациенту, нежели действуя наобум.

Заболеваемость прионными инфекциями относительно мала, однако тот факт, что болезни этой группы могут быть эпидемическими, заставил данную тему стать не только модной, но и более-менее значимой.

Каждый день мы сталкиваемся с тем, что ищем одно - а находим другое. Может быть, изучение прионных инфекций приведёт к открытию средства излечения от болезни Альцгеймера - учёный никогда не должен упускать из виду ни одну кажущуюся мелочь.

В своей работе автор собрал сведения из различных источников с той целью, чтобы читатель мог иметь представление о функциональной значимости прионных белков, нормальных и патологических, в организме человека.

1. Исторический обзор, развитие представлений о прионных белках

Формальное знакомство с медленными инфекциями, вызываемые как вирусами, так и прионными белками, уходит своими корнями в далёкое прошлое, когда более 200 лет назад была описана, сначала в Англии (1732), а вскоре и в Германии (1750), одна из «классических» медленных инфекций - скрепи у овец. Другой исторический пример мы находим в трудах известного французского невропатолога Scharcot, описавшего более 130 лет назад клиническую картину амиотрофического бокового склероза (Gibbs, Gajdusek, 1972). В позапрошлом веке, особенно ветеринарам, было известно, что некоторые инфекционные заболевания могут иметь более продолжительный период течения.

Эти заболевания включали и те, которые имели вирусную этиологию (стоит отметить, что долгое время прионы считались формой вируса, поэтому не следует удивляться, когда мы видим в исторических документах вместо словосочетания «прионный агент» слово «вирус»). Worz (1858) описал подострый энцефалит у лошадей, названный болезнью Борна. Более 70 лет назад установлено, что лошади, заболевшие острой инфекционной анемией, могут сохранять инфекционность крови в течение 7 лет, не обнаруживая при этом никаких клинических признаков заболевания (Waterson, 1972). Однако истинная история изучения медленных инфекций как научной проблемы началась лишь с середины XX века, уже после того, как были достигнуты крупные успехи в медицинской вирусологии, связанные с открытием и изучением вирусных агентов - возбудителей лихорадочных острых заболеваний.

В марте 1954 года в Лондонском университете профессор Рейкьявикского института экспериментальной патологии (Исландия) Sigurdsson прочитал цикл из трёх лекций с несколько необычным названием «Наблюдения за тремя медленными инфекциями овец», в котором изложил результаты своих многолетних исследований неизвестных ранее массовых заболеваний среди овец, импортированных в страну для развития каракулеводства. Животные долгое время казались здоровыми, и первые признаки болезни у них появлялись через много месяцев, а иногда и лет после прибытия на остров. Исследуя таких животных, Sigurdsson выявил общие закономерности и сходные признаки в течении заболеваний даже в тех случаях, когда эти заболевания достаточно чётко различались между собой: они возникали после очень длительного инкубационного периода и развивались постепенно, без ремиссий, с медленным, но неуклонным нарастанием симптомов страдания, что принципиально отличало эти болезни от групп известных хронически протекающих заболеваний, отличающихся ремиссиями на протяжении своего развития.

Sigurdsson, учитывая все эти особенности, предложил обозначить подобного рода заболевания как «медленные инфекции», основываясь на трёх главных отличительных признаках:

очень продолжительном первоначальном периоде скрытого состояния, продолжающимся от нескольких месяцев до нескольких лет;

обычно затяжном течении после проявления клинических признаков, заканчивающемся тяжёлым расстройством или смертью;

ограничении инфекции одним хозяином и анатомических поражениях только одного органа и одной тканевой системы.

Не удивительно, что вызванные вирусами длительное время скрыто протекающие, а в дальнейшем медленно развивающиеся процессы первоначально плохо воспринимались специалистами, потому что не укладывались в рамки существующих представлений о неизбежной острой конфликтной ситуации при встрече организма (клетки) с вирусными частицами.

Через 3 после работ Sigurdsson, Gajdusek и Zigas (1957) впервые описали куру - новое неизвестное заболевание среди людей на о. Новая Гвинея, характеризующееся мозжечковой атаксией и дрожанием. Болезнь сопровождалась дегенеративным изменениями в ЦНС и через несколько месяцев после появления первых симптомов заканчивалась смертью.

За короткое время был накоплен большой и весьма неожиданный фактический материал: оказалось, что очень многие вирусы, давно и хорошо известные как возбудители острых заболеваний, способны при определенных условиях вызывать в организме медленный инфекционный процесс, полностью отвечающий всем четырем признакам медленных инфекций. В числе таких вирусов вскоре оказались вирусы кори, краснухи, герпеса, клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, африканской лихорадки свиней, инфекционной анемии лошадей, бешенства, вирусы семейства папова, гриппа, иммунодефицита человека и др.

Следует также отметить фамилии таких учёных, как Gibbs, Hadlow, Thormar, Palsson, Silverman, Парфанович, Алекберова, Чумаченко, Зуев, внесших свой вклад в это тогда ещё совсем молодое направление в вирусологии.

Начиная с первых сообщений Sigurdsson, в литературе постепенно накапливались данные об особой группе медленных инфекций человека и животных, патоморфология которых весьма существенно отличалась выраженным своеобразием, проявляющимся только в поражении центральной нервной системы, где на основе первично-дегенеративных процессов (без признаков воспаления) развивается характерная картина формирования так называемого губкообразного состояния (status spongiosus) серого и/или белого вещества головного, а иногда и спинного мозга, что может сопровождаться образованием амилоидных бляшек и выраженным глиозом. Подобное своеобразие патоморфологической картины определило и первичное (и до сих пор используемое) название всей группы этих необычных страданий как "трансмиссивные губкообразные энцефалопатии" (ТГЭ). Именно трансмиссивность губкообразных изменений только в центральной нервной системе и является их патогномоничным признаком.

На протяжении нескольких десятилетий все попытки обнаружить возбудителей ТГЭ заканчивались неудачей, хотя инфекционная природа их была точно доказана многочисленными опытами передачи заболеваний различным животным и потому не вызывала сомнений. Вместе с тем на протяжении этих лет накапливались данные, которые не прямо, но косвенно позволяли судить, по крайней мере, о некоторых свойствах возбудителей ТГЭ. И первые же положительные результаты подтвердили если не правомерность, то, во всяком случае, эффективность вирусологического подхода в изучении этиологии ТГЭ.

Не имея возможности работать с самим этиологическим агентом, исследователи предприняли разностороннее изучение инфицированной мозговой ткани, наиболее высокое содержание инфекционного агента в которой было давно установлено. При этом оказалось, что предполагаемый инфекционный агент:

1) способен проходить через бактериальные фильтры с диаметром пор от 25 до 100 нм;

2) не способен размножаться на искусственных питательных средах;

3) воспроизводит феномен титрования (вызывает гибель зараженных животных при высоких значениях инфицирующей дозы для 50% животных - ИД₅₀);

4) накапливается до титров 10⁵-10¹¹ ИД₅₀ на 1 г мозговой ткани;

5) способен первоначально репродуцироваться в селезенке и других органах ретикулоэндотелиальной системы, а затем в мозговой ткани;

6) способен к адаптации к новому хозяину, что нередко сопровождается укорочением инкубационного периода;

7) характеризуется наличием генетического контроля чувствительности некоторых хозяев (например, у овец и мышей для возбудителя скрепи);

8) имеет специфический (для конкретного штамма) круг хозяев;

9) может изменять патогенность и вирулентность для различного круга хозяев;

10) может селекционироваться из штаммов дикого типа;

11) характеризуется возможностью воспроизведения феномена интерференции (например, медленно репродуцирующегося штамма возбудителя скрепи с быстро репродуцирующимся штаммом в организме мышей);

12) обладает способностью к персистенции в культуре клеток, полученных из органов и тканей зараженного организма.

Обнаружение перечисленных выше признаков, характерных для широко известных вирусов человека и животных, достаточно убедительно объясняет многолетний устойчивый интерес вирусологов к возбудителям ТГЭ.

Однако, наряду с приведенными, у возбудителей ТГЭ были обнаружены свойства, которые принципиально отличались от таковых у известных вирусов. Так, возбудители ТГЭ оказались устойчивыми к действию бета-пропиолактона, формальдегида, глутаральдегида, ЭДТА, нуклеаз (РНКазы, ДНКазы I), псораленов, нагревания до 80°С (при неполной инактивации в условиях кипячения), УФ-лучей, ионизирующей радиации, ультразвука. Более того, ни одним из инфекционных материалов, полученным от животных или людей, погибших от ТГЭ, долгое время не удавалось заразить интактные клеточные культуры.

Перечисленные выше своеобразные свойства дали основание рассматривать возбудителей ТГЭ как "необычные вирусы". В этой связи и сами заболевания некоторое время подразделяли на две группы: медленные инфекции, вызываемые обычными вирусами, и медленные инфекции, вызываемые необычными вирусами.

Однако в начале 80-х годов эти нечеткие определения были значительно конкретизированы, а в дальнейшем и уточнены, что целиком и полностью связано с успехами в расшифровке природы возбудителей ТГЭ. Американский биохимик S. Prusiner, используя новые подходы к накоплению и очистке инфекционного начала в мозговой ткани зараженных агентом скрепи хомяков, показал, что возбудителем наиболее распространенной в природе ТГЭ - скрепи (заболевание, которое в природе встречается среди овец и коз) является без нуклеиновый низкомолекулярный (27-30 кДа) белок. S. Prusiner назвал его "инфекционный прионный белок", а в качестве инфекционной единицы предложил наименование "прион". Термин "прион" образован как анаграмма английских слов "белковая инфекционная (частица)" - "proteinaceous infectious (particles)". Прион, как инфекционная единица, состоит из молекул инфекционного прионного белка.

Результаты исследований последних 15 лет полностью подтвердили прионную природу возбудителей ТГЭ и на этом основании эти заболевания обозначают теперь как "прионные болезни".

2. Структура и свойства прионных белков

Прионный белок, как оказалось, может существовать в двух формах. Его нормальная или клеточная форма, обозначенная как PrPc (аббревиатура от англ. - Prion Protein of Cell), обнаруживается в организме всех млекопитающих, включая и человека. Ген PRNP, кодирующий синтез PrPc, расположен в коротком плече хромосомы 20 у человека и хромосомы 2 - у мыши.

2.1 Молекулярное строение PrPc и его функции

На рис.1 представлена схема строения нормального прионного белка.

Рис. 1. Схема строения PrPc. Глобулярная часть - 3 б-спирали (Н1-Н3), короткие антипараллельные в-слои (в1, в2). ГД - гидрофобный домен, которому предшествует заряженный кластер (ЗК), расположенный в неструктурированной N-концевой области PrPc. S-S - дисульфидная связь; -СНО - место гликозилирования; ГФИЯ - гликозилфосфатидилиносительный якорь.

PrPc - гликопротеид, его метаболический цикл начинается в эндоплазматическом ретикулуме, где к нему присоединяется ГФИЯ, также к одному или двум аспарагинам N180 и N196 (потенциальным сайтам гликозилирования) присоединяются сахара. Эти олигосахариды затем подвергаются модификации в аппарате Гольджи, поэтому PrPc даёт в геле обычно 3 полосы, соответственно не гликозилированной (25 кДа), частично гликозилированной (30 кДа) и полностью гликозилированной (32-40 кДа) формам PrPc. продолжительность полураспада PrPc составляет всего 5-6 ч.

PrPc слабо присоединён к внешнему лепестку мембраны клетки нейрона с помощью ГФИЯ и может быть удалён из ткани фосфолипазой и протеазой. Дисульфидные связи способствуют образованию правильной пространственной структуры белка. PrPc образует кластеры в пределах микродоменов мембран клеток, богатых холестерином, так называемых рафтов.

Общие черты пространственной структуры PrPc мыши, человека, хомяка, крупного рогатого скота (установлено с помощью МРТ):

1) белок на N-конце имеет длинную неструктурированную область (23-128 пары оснований), 3 б-спирали и 2 анти параллельных в-слоя;

2) вторичная структура PrPc содержит 3 % в-структур, 43 % б-спиралей;

3) длина полипептидной цепи его несущественно колеблется в зависимости от вида животного (от 253 пар оснований у человека до 265 пар оснований у крупного рогатого скота).

PrPc экспрессируется, в основном, в клетки мозга. Обнаруживается в селезёнке, лимфатических узлах, фолликулярных дендритных клетках, коже, ЖКТ, лимфоцитах человека, нервно-мышечных контактах у млекопитающих.

До конца функция PrPc не ясна, но считают, что данный белок играет важную роль, т.к. присутствует во многих тканях и органах у многих видов животных.

Трансгенные мыши, лишённые гена PRPN, развиваются и чувствуют себя нормально, за исключением циркадных ритмов и электрофизиологического параметров, спустя 70 недель у них развиваются прогрессирующие симптомы атаксии, в частности нарушается моторная координация вследствие экстенсивной потери клеток Пуркинье (крупных нейронов коры мозжечка). Такие мыши полностью резистентны к этиологическому агенту ТГЭ, что неопровержимо доказывает необходимость экспрессии PrPc для развития патологического процесса.

Ш Предполагают участие PrPc в метаболизме Cu (в первую очередь в головном мозге). 4 атома меди присоединяются на N-конце полипептидной цепи белка [PrPc] к гистидинам в октаповторах.

Ш Получены доказательства о локализации PrPc в синапсе, что может являться основанием предполагать участие PrPc в нейротрансмиссии.

Ш PrPc обладает активностью подобно ферментам Cu/Zn супероксиддисмутазе и повышает клеточную резистентность к окислительному стрессу (нейронов и астроцитов).

Ш Участвует в образовании ионных каналов, тем самым регулируя потоки ионов кальция через клеточную мембрану.

Ш Возможно участие PrPc в активации лимфоцитов.

Ш PrPc выступает в качестве трофического фактора для некоторых популяций нейронов.

Ш Доказано участие PrPc в регуляции процессов сна.

Ш Клеточный прионный белок играет определяющую роль в поддержании так называемых "циркадианных" ритмов (от лат. cirka - около и dies - день), регулируя суточные циклы активности и покоя в клетках, органах и в организме в целом.

Ш Некоторые считают, что функцией PrPc является подавление возрастных процессов, и поэтому прионные болезни сходны по своим клиническим и морфологическим характеристикам с геронтологическими заболеваниями.

2.2 PrPc, теории о механизмах его превращения и накопления в организме

Под воздействием экзо- или/и эндогенных факторов происходит изменение конфирмации PrPc, что приводит к образованию его лизоформы PrPsc, содержащей 43 % в-структур и 34 % б-спиралей. Отсюда следует изменение физических свойств белка, что, собственно, и приводит к патологии.

Молекулярная масса PrPsc равняется 33-35 кДа, сам белок отличается от PrPc лишь пространственной конфигурацией. Основные изменения структуры происходят в области двух первых б-спиралей. Все точечные мутации, которые, по-видимому, дестабилизируют структуру белка, локализованы вблизи б-спиралей в пределах ГД (см. рис. 1).

В отличие от PrPc, PrPsc нерастворим в детергентах, устойчив к инактивации ионизирующим облучением, УЗ- и УФ-излучением, подвергается ограниченному протеолизу протеинкиназой К лишь до протеазорезистентного фрагмента (27-30 кДа) - ферментом отщепляется N-конец полипептида в области 74-102 пар оснований (подробнее об устойчивости PrPsc см. в прил. 1). На основании анализа фрагмента PrPsc, резистентного к действию протеазы К, идентифицированы по меньшей мере 2 гликоформы этого белка. В подавляющем числе экспериментов показано, что PrPsc является неотъемлемым фактором возникновения ТГЭ.

PrPsc гликолизирован, имеет ГФИЯ, однако связан с мембраной так, что ГФИЯ не доступен для фосфолипазы. PrPsc накапливается на поверхности клетки в поздних эндосомах, лизосомах и в межклеточном пространстве в форме аморфных депозитов диффузных фибрилл (их ещё называют скрепиассоциированными фибриллами - САФ) или плотных амилоидных бляшек (см. рис. 2). Конверсия PrPc и PrPsc происходит на богатых холестерином участках плазматической мембраны (рафтах).

Частично, по-видимому, PrPsc распадается. Показано, что обмен PrPc происходит значительно интенсивнее, чем PrPsc, тем не менее, накопление последнего происходит достаточно медленно.



Рис. 2. Схема формирования прионных структур по В. Caughey и В. Chesebro. ПрПсен -- прион-протеин (ПрП), сенситивный к протеолизу, нормальный, клеточный; ПрПрез -- ПрП, резистентный к протеолизу, инфекционный;САФ -- скрепиассоциированные фибриллы, их происхождение из ПрПрез -- вопрос спорный; ЭР -- эндоплазматический ретикулум.

Так называемые скрепиассоциированные фибриллы (САФ) впервые обнаружил в гомогенатах мозга пораженных скрепи овец Р. A. Merz, используя электронную микроскопию. Некоторые сочли их артефактом, но впоследствии их обнаруживали при многих прионных болезнях у человека и животных.

Авторы статьи, из которых заимствован рисунок, изобразили на нем САФ, полагая вслед за другими исследователями, что они образуются из прионных палочек. Однако вопрос о природе САФ остается спорным. Приводятся веские аргументы в пользу того, что это совершенно разные структуры (прил. 2). В отличие от прионных палочек САФ, например, обладают иными метрическими параметрами, не имеют тинкториальных особенностей амилоида и т. д. Вполне возможно, что они представляют собой дистрофически и некробиотически измененные нейтрофиламенты, в ответ на которые и образуются аутоантитела, неоднократно обнаруживавшиеся при ряде прионных болезней.

Согласно «белковой гипотезе» (protein only theory) конфармационный переход является автокаталитическим процессом, в ходе которого необходимо непосредственное физическое взаимодействие PrPsc с эндогенным PrPc, при этом PrPsc выступает в роли матрицы. Однако следует заметить, что главной проблемой «белковой теории», постулирующей, что конверсия PrPc в PrPsc происходит без участия нуклеиновых кислот, является существование различных штаммов ТГЭ. До сих пор эта проблема остаётся неясной.

Механизм накопления инфекционного прионного белка в зараженном организме сегодня точно не известен. Однако имеющиеся сведения и представление о том, что это посттрансляционный процесс, дают основание считать, что инфицирующий прионный белок вызывает в здоровом до этого организме трансформацию нормального (клеточного) прионного белка в его инфекционную форму за счет его конформационных (пространственных) изменений. В этом случае речь идет об изменении третичной или даже четвертичной структуры исходного белка РrРc. Таким образом, процесс накопления инфекционного прионного белка происходит не в результате синтеза в зараженном организме молекул PrPsc de novo, а вследствие конформационных изменений уже синтезированных нормальных молекул РrРc под влиянием молекул инфекционного прионного белка РrРsc. Есть основания считать, что в этом процессе определенную роль играет еще какой-то белок "X", выполняющий функцию шаперона. Схематически процесс накопления инфекционного прионного белка представлен на рисунке 3. Он предусматривает, прежде всего, необходимость контакта двух молекул. В результате под влиянием одной молекулы РrРsc происходит трансформация контактирующей с ней одной молекулы РrРc в ее инфекционную форму. Таким образом всего в организме образуются две молекулы РrРsc. Следующий этап включает в себя уже влияние двух молекул РrРsc, под воздействием которых сразу образуются еще две (а всего их будет четыре) молекулы РrРsc и т.д. Таким образом, как видно из приведенной схемы, процесс накопления инфекционного прионного белка носит лавинообразный характер.

Рис. 3. Схема процесса накопления молекул инфекционного прионного белка.

Наиболее привлекательна «затравочная модель», которая предполагает существование термодинамического равновесия между двумя изоформами, а внесение экзогенного PrPsc при инфицировании смещает это равновесие в сторону преобладания PrPsc. Вследствие этого образуется затравка полимерной цепи, состоящая из PrPsc, к концу которой добавлены мономеры трансформированного PrPc. Растущая полимерная цепь может образовывать фрагменты, которые захватывают соседние клетки. Этот процесс подобен полимеризации актина и тубулина. Энергетический барьер преодолевается добавлением новых субъединиц. Система становится неравновесной.

Эта модель применима и для наследственных ТГЭ. Мутации, по-видимому, дестабилизируют структуры PrPc, что способствует смещению равновесия в сторону образования PrPsc.

В отличие от PrPc инфекционный прионный белок PrPsc первично аккумулируется в клетках, накапливаясь в цитоплазматических везикулах. Дальнейшее накопление PrPsc в синаптических структурах и связанная с этим дезорганизация синапсов, возможно, являются причиной развития глубоких неврологических дефектов и деменции.

Также PrPsc может высвобождаться во внеклеточное пространство и откладываться в амилоидных бляшках.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что прионные болезни возникают в результате накопления PrPsc, а не подавления функции PrPc. Механизмы взаимодействия PrPsc и нейрона недостаточно изучены. Имеются данные о том, что события, связанные с реализацией функции как PrPc, так и PrPsc, очевидно, происходят в мембране.

Так, при изучении свободной клеточной трансляции выявлено 2 формы PrPc: трансмембранной и секреторной. Видимо, мембранозависимые процессы важны для синтеза PrPsc, так как брефелдин A, селективно разрушающий вещества, депонированные в аппарате Гольджи, препятствует синтезу PrPsc в инфицированных скрепи культурах клеток.

В действительности связь инфекционности скрепи с мембранными фракциями известна довольно давно. Считается, что гидрофобные взаимодействия определяют многие физические свойства, проявляемые инфекционными прионными частицами. В последние годы получены данные о том, что в реализации взаимодействия PrPsc и нейрона имеют значение экзайтотоксические (нейротоксические) механизмы.

3. Прионные болезни

Напомним, что заболевания, вызываемые прионами, характеризуются рядом признаков, сочетание которых определяется биологическими особенностями их возбудителей: это, прежде всего длительный инкубационный период (от месяцев до десятков лет), отсутствие воспалительных изменений, хронически прогрессирующая патология, отсутствие ремиссий и выздоровления. Для прионных болезней характерен ряд отрицательных признаков, которые не наблюдаются при заболеваниях, вызываемых вирусами. К ним относятся отсутствие продукции интерферона и нечувствительность к интерферону, отсутствие в составе возбудителя инфекционных нуклеиновых кислот и неспособность прионов интерферировать с вирусами. Для прионных болезней характерны нечувствительность к иммуно супрессирующему или иммуно потенцирующему действию АКТГ, кортизона, циклофосфамида, УЗ-лучей, антилимфоцитарной сыворотки, тимэктомии и спленэктомии, отсутствие влияния адъювантов. Для прионных болезней характерна также интактность В- и Т- клеток. Комбинация всех перечисленных признаков, каждый из которых не является чем-то уникальным, и определяет своеобразие прионных болезней.

3.1 Межвидовой барьер и пути передачи прионных болезней

Межвидовая передача ТГЭ всегда характеризуется увеличением инкубационного периода. Степень такой резистентности определяет видовой барьер. Опыты на трансгенных животных и культурах клеток показали, что эффективность формирования PrPsc зависит от степени гомологии между белками PrPc реципиента и донора и соответствия их третичной структуры, что доказывает необходимость прямого взаимодействия между PrPc и PrPsc. Минорные различия даже в пределах нескольких аминокислотных остатков в центральной части молекулы PrPc (109 - 190 пары оснований) ведёт к возникновению резистентности при межвидовой передаче ТГЭ. Замены даже одной аминокислоты или полиморфизм в кодоне 129 у человека влияют на чувствительность к ТГЭ.

Прионные заболевания являются одновременно и инфекционными, и наследственными болезнями. Они могут быть и спорадическими в том смысле, что имеются случаи, в которых не выявляют никакого известного фактора риска, хотя наиболее вероятно, что инфекция была приобретена одним из двух ранее указанных способов. Исходя из современных знаний, трансмиссия прионных энцефалопатий определяется тремя факторами: дозой инфекта, путем инфицирования, видовым барьером.

Доза инфекционного агента, полученная хозяином, зависит от количества ткани инфекта и его вирулентной способности (инфекционный титр). Но необходимо всегда помнить, что при повторной экспозиции обязательно существует риск кумулятивного эффекта.

Путь инфицирования прионами играет важную роль в развитии заболевания и имеет свою определенную иерархию. По степени значимости пути инфицирования можно распределить в такой последовательности:- интрацеребральный;- интравенозный;- интраперитонеальный;- подкожный;- оральный.

В качестве примера зависимости от дозы и пути поступления инфекта служат эксперименты, которые показали, что доза, необходимая для заражения прионами мышей при оральном пути должна быть в 200 000 раз выше, чем при интрацеребральном.

Обнаружено, что при различных способах введения патологических прионов через различные периферические пути, включая брюшную полость, желудок, инфекционный агент сначала появляется в клетках лимфоретикулярной системы миндалин, тимуса, лимфатических узлов и, особенно, селезенки. В первую очередь инфект определяется в B-клеточных зонах. Авторы показали, что дифференцированные B-лимфоциты принимают участие в нейроинвазии прионов. Это, по их мнению, может иметь значение для предупреждения болезни и использовано в терапевтических целях.

При алиментарном заражении прионы в Пейеровых бляшках тонкой кишки проникают через клеточные мембраны во внутренние структуры лимфоидных клеток, откуда в дальнейшем они попадают в другие органы иммунной системы: лимфоузлы, селезенку, миндалины и др. В этих органах возможна частичная репликация прионов. Предполагается, что дендритные клетки являются пермиссивными для периферической репродукции прионов. Из органов иммуногенеза прионы по нервам достигают ближайших аксонов. В области аксона может происходить их значительная репликация. При достижении критической концентрации прионы продвигаются по направлению к спинному, а затем головному мозгу.

После подкожного заражения грызунов прионы выделяются из селезенки (1-я неделя после заражения), из селезенки и лимфатических узлов (5-13-я неделя), из спинного мозга (13-17-я неделя) и из головного мозга (17-19-я неделя). Установлено, что патологические изменения в мозге появляются на 25-й неделе, а клинические проявления начинают регистрироваться с 34-й недели. Все пораженные органы содержат до 10 млн. инфекционных единиц на 1 г, однако в них, за исключением головного мозга, не обнаруживается никаких патологических изменений. По некоторым данным, максимум инфекционности достигается к 40-му дню, т.е. задолго до клинического заболевания у внешне совершенно здорового животного, когда еще нельзя распознать болезнь и принять меры по профилактике и лечению. Из этого обстоятельства вытекают трудности ранней диагностики и опасность передачи инфекции с продуктами питания.

Инфицированность органов иммуногенеза подразумевает перенос инфекционного агента с кровью. Однако, ни в инкубационном периоде, ни в преклинической стадии, ни даже в разгар болезни пока не находят биологических сдвигов в периферической крови.

После внутри церебрального внедрения в животный организм прион-протеина PrPsc, он начинает избирательно накапливаться в мозге. Имеются доказательства существования транспорта PrPс и PrPsc вдоль аксонов. Большинство клеточных прионов протеина присоединяются к внешней поверхности мембраны клеток якорем гликопротеидов после прохождения через комплекс Гольджи. Подобно другим протеинам, изоформа прион протеина PrPsc проходит внутрь клетки через фиссуры, находящиеся на поверхности клетки. В отличие от клеточной изоформы прион-протеина PrPsc накапливается в клетке.

3.2 Классификация, патогенез и клинические проявления прионных болезней

Заболевания, вызванные прионными белками, регистрируют как у животных, так и у человека.

Таблица 1. Современная классификация прионных болезней человека и животных
Нозологическая форма	Естественный хозяин
Болезнь Kрейтцфельда - Якоба	Человек
Kуру	Человек
Синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера	Человек
Смертельная семейная бессонница	Человек
Скрепи	Овцы и козы
Трансмиссивная энцефалопатия норок	Норки
Хроническая изнуряющая болезнь	Олени и лоси
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота	Kоровы и быки
Губкообразная энцефалопатия кошек	Kошки
Губкообразная энцефалопатия экзотических копытных	Антилопы и большой куду

Нейропатология прионных болезней человека характеризуется 4 классическими микроскопическими признаками:- спонгиозным изменениями;- потерей нейронов;- астроцитозом;- формированием амилоидных бляшек.

Иммуно-электронномикроскопические исследования указывают на то, что накопление PrPsc происходит в структурах вторичных лизосом, содержащих фигуры миелина, богатые фосфолипидами. После повреждения лизосом и гибели клетки прионы заселяют другие клетки. Внутриклеточное накопление PrPsc в головном мозге проявляется спонгиформной дистрофией нейронов, гибелью нервной клетки и реактивным астроцитозным глиозом, что и определяет нейроморфологию прионных заболеваний.

Экспериментально доказано, что репликация прионного агента может происходить как в нейронах, так и в глиальных элементах. Некоторые авторы считают, что астроциты и другие глиальные клетки, возможно, играют ключевую роль в патогенезе прионной инфекции. Это подтверждается высоким уровнем цитокинов на поздней стадии заболевания. К тому же на линейных мышах, у которых инфицированы были только глиальные клетки, получена морфологическая картина спонгиозной энцефалопатии.

Болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ) связана с мутацией PRNP в кодонах 178, 180, 200, 208, 210, 232 и полиморфизмом в кодоне 129. Спорадическая форма встречается повсеместно в 1 случае на 2 млн. жителей. В 10% случаев она носит семейный характер. Известны ятрогенные случаи заболевания, связанные с инструментальными исследованиями, пересадкой тканей, гормонотерапией.

В 2 публикациях отмечено редкое, но достоверное сочетание БКЯ с церебральной амилоидной ангиопатией, когда гистологически определяемые амилоидные бляшки содержали только PrPsc, в то время как амилоид в сосудах реагировал с анти сывороткой к b-амилоиду, характерному для болезни Альцгеймера.

Сходство нейроморфологического проявления БКЯ и болезни Альцгеймера подтверждается также наблюдениями, в которых амилоидные бляшки содержали только b-амилоид, но в иммуноблотинге экстракта мозга определялось значительное количество PrPsc.

Используя различные варианты фиксации и набор анти сывороток, удалось обнаружить PrPsc при БКЯ не только в бляшках, но и в ткани мозга по периферии спонгиозных вакуолей, вокруг нейронов, астроцитов и даже внутри самих клеток.

Куру. Характерные амилоидные куру-бляшки, или звездчатые бляшки, впервые описаны I. Klatzo и D. С. Gaydusek в 1959 г. Они встречались в 75% случаев заболевания чаще в гранулярном, реже в молекулярном слое мозжечка и белом веществе, располагались в базальных ганглиях и коре затылочной области большого мозга. При иммуноморфологическом исследовании было установлено, что куру-бляшки содержали PrPsc.

Синдром Герстманна-Штреусслера-Шейнкера (ГШШ) связан с мутацией PRNP в кодонах 102, 105, 117, 198, 217 и полиморфизмом в кодонах 129 и 219. Редкое семейное заболевание встречается в 2 случаях на 200 млн. жителей.

Наиболее характерным патоморфологическим проявлением заболевания служит обилие амилоидных бляшек, встречающихся практически во всех отделах мозга. Распределение областей мозга в порядке убывания в них числа бляшек следующее: молекулярный слой мозжечка (116 бляшек в 1 кв. мм), гранулярноклеточный слой мозжечка (19 бляшек в 1 кв. мм), парагиппокампальная извилина (15,9 бляшек в 1 кв. мм), островковая извилина (11,5 бляшек в 1 кв. мм), верхняя фронтальная извилина (10,6 бляшек в 1 кв. мм). Бляшки исключительно плеоморфны: примитивные бляшки, куру-бляшки, сенильные бляшки, типа кокарда и мультицентрические, или сложные, бляшки. Последние считаются чуть ли не патогномоничными для синдрома ГШШ. Они состоят из нескольких мелких бляшек, собранных вместе, или центральное ядро амилоида окружено множеством мелких амилоидных глобул. Как правило, мультицентрические бляшки имеют большие размеры и обладают всеми тинкториальными свойствами амилоида. На ультраструктурном уровне такие бляшки состоят из темных филаментов и аморфных отложений, среди которых различаются тонкие фибриллы диаметром 10--15 нм, окруженные по периферии отростками астроцитов.

Фатальная семейная бессонница (ФСБ) - сравнительно недавно описанное семейное заболевание, насчитывающее пока 10 случаев, связано с мутацией в кодоне 178 PRNP. Нейродегенеративные изменения с потерей нейронов и глиозом не сопровождаются развитием амилоидных бляшек. Тем не менее, отдельные скопления PrPsc наблюдались в таламусе, стволе и других отделах мозга. При переносе гомогената мозга умерших людей лабораторным животным у них развивалась типичная картина прионной болезни с выраженным спонгиозом и образованием амилоидных бляшек.

Клиника всех форм прионной энцефалопатии может быть представлена разнообразной неврологической симптоматикой, обусловленной вакуолизацией и гибелью нейронов (основной механизм действия прионов на клеточном уровне) практически в любом отделе серого вещества мозга, включая мозжечок. Типичными являются:

1. Расстройства чувствительной сферы: амнезия различной степени, потеря и извращение чувствительности, выпадение функций органов чувств.

2. Нарушения в двигательной сфере: атаксия, обездвижение, атрофия мышц, в том числе дыхательных, параличи.

3. Нарушения психики: утрата профессиональных навыков, депрессия, сонливость, агрессивность, снижение интеллекта, вплоть до полного слабоумия.

прионный белок патогенетическая клиническое

3.3 Лечение и профилактика ТГЭ

В настоящее время не существует эффективной этиологической и патогенетической терапии прионных болезней, несмотря на достигнутый в последние годы прогресс в изучении этой группы медленных инфекций.

В ранних стадиях применяется симптоматическая терапия, корригирующая поведенческие нарушения, расстройства сна и миоклонии (амфетамины, барбитураты, антидепрессанты, бензодиазепины, другие нейролептики); в поздних - поддерживающая терапия.

По лимитированным данным, амфотерицин, НРА-23 (ингибитор синтеза вирусного гликопротеида) и кортикостероиды увеличивают инкубационный период при экспериментальном скрепи, а некоторые антибиотики несколько удлиняют жизнь больных животных.

Брефелдин А, разрушая аппарат Гольджи, препятствует синтезу PrPsc в инфицированной культуре клеток. Блокаторы кальциевых каналов, в частности NMDA-рецепторов, способствуют более длительному выживанию инфицированных нейрональных культур.

Стало ясно, что прион-амилоид не следствие, а ведущий фактор патоморфоза заболеваний со всеми его проявлениями. Поэтому особый интерес представляют работы, в которых показано, что конго красный и его аналоги -- сульфатированные гликаны -- не только ингибируют процесс агрегации PrPsc, но и заметно удлиняют инкубационный период заболевания. Не лишне отметить, что ингибирующее действие конго красного на амилоидогенез отмечено в ряде экспериментов на мышах еще на ранних этапах изучения амилоидогенеза. Эти наблюдения создают предпосылку для разработки адекватной терапии как прионных, так и иных заболеваний, связанных с отложением амилоида в мозге и иных органах.

Нельзя не отметить еще одно своеобразие прионных болезней, имеющее принципиальное значение. Учитывая структурную близость инфекционного прионного белка и его нормальной (клеточной) изоформы, легко понять, что при развитии прионных заболеваний в организме людей и животных не обнаруживаются антитела на прионный белок РrРsc, который воспринимается иммунной системой как "свой", что, естественно, затрудняет лабораторную диагностику заболеваний, их иммунотерапию и иммунопрофилактику. Действительно, из очень большого числа испытанных противовирусных средств и иммуномодуляторов лишь преднизолон, арахисовое масло и полианионы заметно снижали чувствительность мышей к экспериментальному заражению возбудителем скрепи. Многочисленные попытки применения в клинической практике антибиотиков, стероидов, ацикловира или тиамина при болезни Крейтцфельда-Якоба заканчивались неудачей. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения, наиболее перспективными следует признать подходы, основывающиеся на результатах молекулярно-биологических исследований трехмерной структуры прионов.

Одним из наиболее перспективных путей лечения представляется предотвращение преобразования PrPc в PrPsc путем стабилизации структуры PrPc связующим активным веществом или изменением действия протеина X, который может функционировать как молекулярный шаперон. Остается определить, какой из препаратов будет более действенным: связывающий PrPc или имитирующий структуру PrPc с основными полиморфными остатками, который, возможно, предотвращает скрепи и БКЯ. Следует отметить, что средства, призванные воспрепятствовать образованию прионов, должны проникать через гематоэнцефалический барьер.

Возможным терапевтическим подходом при лечении прионных болезней может быть снижение уровня PrPc у человека без нанесения ему вреда в результате уменьшения содержания PrP мРНК с помощью олигонуклеотидов, что может отсрочить появление симптомов болезни.

В настоящее время осуществляется ряд мероприятий по профилактике прионных инфекций. Вводятся ограничения на использование лекарственных препаратов, приготовленных из тканей крупного рогатого скота. Прекращено производство гормонов гипофиза животного происхождения. В ряде стран введены ограничения на трансплантацию твердой мозговой оболочки.

Поскольку передача от человека к человеку предполагает прямую инокуляцию инфекционного материала, при работе с биологическими жидкостями больных необходимо использовать резиновые перчатки.

Инструменты рекомендуется дезинфицировать автоклавированием при температуре 132^оС в течение 1 ч, а при температуре 121^оС - 4,5 ч или погружением в раствор гидроксида натрия на 1 ч при комнатной температуре.

Заключение

Таким образом, изучение прионов и связанных с ними заболеваний является новой быстроразвивающейся областью биомедицинских исследований.

Весьма вероятно, что основы знаний, полученных при изучении прионных болезней, можно будет применить для выяснения причин других, более распространенных нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и др.

Несмотря на популярность, прионная гипотеза встречает и ряд возражений. Например, предполагают, что PrPsc может оказаться лишь кофактором или рецептором, вовлеченным в патогенез заболевания. Подозрительным считают слишком большое количество штаммов, например более 20 скрепи у мышей. Не исключают также, что PrPrsc -- очень мелкий вирус.

Своеобразие прионных заболеваний у человека состоит в том, что, всегда оставаясь инфекционными, они могут протекать как эпидемии (куру), спорадические случаи и как "фамильные" болезни. Разнообразие их проявления даже в пределах одной нозологической формы во многом определяется мутациями PRNP-гена человека, которых к настоящему времени, по мнению S. В. Prusiner, насчитывается 19.

Уже сейчас имеется возможность определить группу риска возникновения врожденных прионных болезней задолго до проявления неврологических нарушений. В связи с этим встает настоятельная необходимость разработки эффективной терапии. Однако насколько быстро возможность лечения прионных болезней станет реальностью, зависит от успехов молекулярной и клеточной биологии, а также химии белка, что дает возможность расшифровки процессов репликации прионов и раскрытию патогенетических механизмов этих болезней. Чем эффективнее будут сотрудничать представители разных наук, тем больших результатов учёные смогут добиться, в т.ч. и в данной области.

Список литературы

1. В. Д. Тимаков, В. А. Зуев Медленные инфекции. Москва: Медицина, 1977.

2. Д.К.Львов, Л.М.Алимбарова, С.В.Альховский и др. под редакцией Д. К. Львова Медицинская вирусология: Учебное пособие. М., 2008.

3. И.А. Завалишин, И.Е. Шитикова, Т.Д. Жученко Прионы и прионные болезни // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. 2000. Т. 2. № 2. С. 12-19..

4. О. Е. Блинникова Трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии // Новый Хирургический Архив. 2001. №2. http://likar.org.ua/content/view/791/116/lang,uk

5. В. С. Рукосуев, А. А. Жаворонков. Прионовые болезни и амилоидоз головного мозга. // Архив патологии. 1999. №2. С. 50-55.

6. В. А. Зуев Прионы - новый класс возбудителей инфекционных заболеваний // Антибиотики и химиотерапия. 1999. № 10. С. 33-38.

7. В.Г. Шлопов Прионные инфекции: Лекция курса патологической анатомии.

8. Покровский В.И., Киселев О.И. Молекулярные основы прионных болезней // Вестник РАМН. 1998. № 10.

9. Зуев В.А., Завалишин И.А., Ройхель В.М. Прионные болезни человека и животных: Руководство для врачей. М. 1999.

Приложения

Приложение 1. Характеристика устойчивости прионов к различным воздействиям

Реактивы	Дозы	Эффект воздействия
Физико-химическое воздействие
NH2OH	0,1-0,5 мM	Устойчив
Псорален	10-500 мг/мл	Устойчив
Фенол	100%	Инактивация
SDS	1-10%	Инактивация
Zn2+	2 мM	Устойчив
Мочевина	3-8 M	Инактивация
Сода	1N в течение 1 часа при 20°C	Инактивация
Гипохлорид натрия	2,5% в течение 1 часа при 20°C	Инактивация
Обработка ферментами
ДНK-аза A	0,1-100 мг/мл	Устойчив
ДНK-аза	100 мг/мл	Устойчив
Протеиназа K	100 мг/мл	Инактивация
Трипсин	100 мг/мл	Инактивация
Физическое воздействие
Автоклавирование	136°C в течение 18 минут	Инактивация
Сухой жар	160°C в течение 24 часов	Инактивация
УФ	Сильные дозы	Устойчив

Приложение 2. Сравнительные свойства прионных палочек и САФ (по М. McKinley и S. В. Prusiner)

Свойства	Прионовые палочки	САФ
Диаметр, нм	10-20	12-16(I тип)
		27-34 (II тип)
Длина, нм	100--200	100-1000
Тонкая структура	Изменчивая структура с выраженной агрегацией, не отличимая от очищенных форм амилоида	Спирально закрученные субфиламенты с периодичностью от 40--60 до 80--100 нм (I тип). Субфиламенты с периодичностью 100--200 нм (II тип). Субфиламенты разделены пространством 2--4 нм, легко отличимы от амилоида
Состав	ПрП 27--30 в скрепиэкстрактах	Не известен
Тинкториальные свойства	Конгофильны, обладают двойным лучепреломлением, зелено-золотистого цвета	Конго красным не окрашиваются
Связь с инфекционностью	В виде ПрП 27--30 коррелируют с титром. Другие мелкие структуры такой корреляции не обнаружили. Сферы и липосомы инфекционности не теряли	Найдены в мозге и селезенке на поздних стадиях болезни. Нет корреляции с селезеночным титром

Размещено на Allbest.ru