Бактериофагия

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное Агентство по образованию

Ивановский государственный химико-технологически университет

Доклад

по микробиологии

на тему «БАКТЕРИОФАГИ»

Выполнила студентка группы №2-28:

Цыганова Ольга

Проверил:

Кузнецов Олег Ювенальевич

Иваново 2009

Оглавление

Введение

1. Обзор литературы

2. Понятие о бактериофагах

3. История открытия

4. Строение и химический состав

5. Жизненный цикл

6. Классификация

7. Примеры бактериофагов

8. Распространение бактериофагов

9. Титрование фагов

10. Практическое применение

11. Проблема антибиотиков и фагов

Список литературы

Введение

Актуальность: человек, как все другие живые существа, подвержен заражению вирусами. Вирусные эпидемии и даже пандемии не раз поражали человечество, приводя к многомиллионным жертвам (натуральная оспа, грипп, желтая лихорадка, клещевой энцефалит и др.). В конце XX века человек столкнулся с возбудителями целого ряда ранее неизвестных инфекций - вирусами геморрагической лихорадки Эболла, гепатитов В, C, D и E, атипичной пневмонии, птичьего гриппа. А в начале 80-ых гг. началась новая эпидемия, которую вызвал вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Надо признать, что одной из важнейших проблем в инфекционной патологии человека являются вирусные заболевания. Вирусы обычно рассматриваются как паразиты возбудители инфекционных болезней, наносящих вред человеку, животным, растениям. Однако такой подход является однобоким, и его нельзя назвать правильным. В 70-ых годах Ждановым В.М. была высказана гипотеза, согласно которой вирусы являются важным фактором эволюции органического мира. Преодолевая видовые барьеры, вирусы могут переносить отдельные гены или группы генов, а интеграция вирусной ДНК с хромосомами клеток может приводить к тому, что вирусные гены становятся клеточными генами, выполняющими важные функции.

Проблема вирус клетка давно вышла за рамки вирусологии и заняла одно из главных мест в науке о жизни. Наибольшие успехи в этом направлении были достигнуты в изучении системы бактериальный вирус - микробная клетка. Это объясняется простотой культивирования системы, коротким периодом генераций, высоким выходом потомства и возможностью весьма точного его количественного учета.

Особая роль бактериальных вирусов определяется тем вкладом, который был внесен при их изучении в решение общевирусологических вопросов. Исследования на бактериофагах (вирусах, размножающихся в бактериях) принесли плодотворные результаты и в разрешение важнейших проблем молекулярной биологии и молекулярной генетики. С их помощью было доказано, что материальным носителем наследственности является ДНК, открыт феномен модификации-рестрикции, открыта транскрипция, проведены важнейшие исследования по изучению репликации, рекомбинации, морфогенезу.

Кроме того, на бактериальных вирусах были проведены широкие радиобиологические исследования. Бактериофаги оказались также удобным объектом для первичного отбора противоопухолевых препаратов. Наконец, фаги с успехом использованы для биологических исследований космического пространства.

В последние годы вновь возрос интерес к вирусам бактерий в медицинской практике. С одной стороны это связано с все более широким их применением в качестве лекарственных препаратов на фоне нарастающего распространения штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а с другой - с использованием бактериофагов в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для ряда объектов.

Ключевые слова: бактериофаг антибиотик вирус

1. Обзор литературы

Основные работы по биологии бактериофагов проводились в 40-50-ые годы прошлого века. Именно на фагах была изучена тонкая структура гена (Benzer,1955,1959; Tessman,1965) исследованы молекулярные процессы, лежащие в основе мутационных изменений (Litman,1956; Loveless,1958; Benzer, Freese,1958), проведены классические работы по расшифровке наследственного кода (Crick,1961; Wittmann,1961)(по ссылке Зуева В 80-ые годы продолжаются исследования молекулярной биологии взаимодействия вирус-клетка хозяина (Крюгер) С помощью фагов изучаются проблемы лизогении и трансдукции, разрабатываются тонкие механизмы регуляции активности генов. Ведутся работы с фагом Ми, ставшем классической моделью при изучении мигрирующих генетических элементов у бактерий. (Алиханян) С начала 90-ых годов значительное внимание уделяется проблемам создания живых рекомбинантных вакцин при участии фагов. (Сандахчиев) Бактериальные вирусы используют с целью изучения путей распространения кишечных инфекций (Чкония) В последнее десятилетие интерес к бактериофагам несколько спал. Однако в связи с ограниченными возможностями антибиотикотерапии внимание медиков вновь привлечено к бактериальным вирусам как средствам лечения.

2. Понятие о бактериофагах

Бактериофаги - (от бактерии и греч. fagos - пожиратель) - это особые представители царства вирусов.

Особенность бактериофагов в том, что они приспособились использовать для своего размножения клетки бактерий.

Эти маленькие создания потрясающе многообразны.

Вирусы бактериий, иначе называемые бактериофагами, - крупнейшая из известных групп вирусов.

Современная классификация бактериофагов включает 13 семейств, подразделенных более чем на 140 родов, которые содержат более 5300 видов фагов.

Применение современных электронных микроскопов позволило детально изучить строение фагов. Оказалось, что многие из них устроены сложнее, чем вирусы человека, животных и растений.

3. История открытия

Ещё в 1896 году британский бактериолог Эрнест Ханкин (Ernest Hanbury Hankin, 1865-1939) сообщил, что воды рек Ганг и Джамна в Индии обладают значительной антибактериальной активностью, которая сохраняется после прохождения через фарфоровые фильтры с порами очень малого размера, но устраняется при кипячении. Ханкин предположил, что некая субстанция в этой воде ответственна за предупреждение распространения эпидемий холеры, которые могут быть вызваны употреблением воды из этих рек.

В 1915 году британский бактериолог Фредерик Творт (Frederick William Twort, 1877-1950) обнаружил вирусы, которые уничтожали бактерий. А в сентябре 1917 года учёный из Института Пастера (Institut Pasteur) Феликс Д'Эрель (F?lix Hubert d'H?relle, 1873-1949) представил Французской академии наук (Acad?mie des Sciences) доклад, в котором сообщил о том, что обнаружил «невидимого микроба», поражающего дизентерийную палочку. Учёный назвал своё детище «бактериофагом», то есть «поедателем бактерий». Вскоре после этого Д'Эрель описал случай успешного лечения дизентерии с помощью своего «поедателя». Микробиология тогда была в моде и переживала свой «золотой век», идея терапевтического применения бактериофагов была очевидна.

Изучением бактериофагов одновременно с исследователями из Института Пастера занимался и грузинский микробиолог Георгий Элиава. В 1920-е годы в Тбилиси он открыл институт, который занялся исследованиями фагов с целью их терапевтического применения и стал мировым лидером в этой области. В 1940-е годы фармацевтическая компания Eli Lilly занималась коммерциализацией фаговой терапии в США, однако бизнесмены и врачи потеряли к ней интерес после распространения антибиотиков.

4. Строение и химический состав

1 -- головка, 2-- хвост, 3 -- нуклеиновая кислота, 4 -- капсид, 5 --"воротничок", 6 -- белковый чехол хвоста, 7-- фибрилла хвоста, 8 -- шипы, 9 -- базальная пластинка

Частицы многих Бактериофаги состоят из головки округлой, гексагональной или палочковидной формы диаметром 45-140 нм и отростка толщиной 10-40 и длиной 100-200 нм (рис.). Другие Бактериофаги не имеют отростка; одни из них округлы, другие - нитевидны, размером 8х800 нм. Содержимое головки состоит преимущественно из дезоксирибону клейновой кислоты (ДНК) (длина её нити во много раз превышает размер головки и достигает 60-70 мкм, эта нить плотно скручена в головке) или рибонуклеиновой кислоты (РНК) и небольшого количества (около 3%) белка и некоторых других веществ. Отросток имеет вид полой трубки, окруженной чехлом, содержащим сократительные белки, подобные мышечным. У ряда Бактериофаги чехол способен сокращаться, обнажая часть стержня. На конце отростка у многих Бактериофаги имеется базальная пластинка с несколькими шиловидными или другие формы выступами. От пластинки отходят тонкие длинные нити, которые способствуют прикреплению фага к бактерии (см. схему). Оболочки головки и отростка состоят из белков. Общее количество белка в частице фага 50-60% , нуклеиновых кислот - 40-50% . Каждый Бактериофаги обладает специфическими антигенными свойствами, отличными от антигенов бактерии-хозяина и других фагов. Имеются антигены, общие для ряда фагов (особенно содержащих РНК).

5. Жизненный цикл

Электронный микроскоп открыл тайну воспроизведения вирусов. Проще всего этот процесс наблюдать на группе вирусов, нападающих на бактерии, - бактериофагов, или просто фагов. Фаги легко размножаются в кишечной палочке Escherichiacoli. Ее клетки поражаются по меньшей мере семью штаммами фаговТ1-Т7.

Природа позаботилась об этих вирусах, снабдив их необходимыми орудиями: ферментом лизоцимом, «открывателем» клеточной мембраны, и микроскопическими «мышцами», сокращение которых способствует попаданию ДНК внутрь клетки.

Электронная микрофотография бактериофагов, инфицирующих клетку

Атака начинается с прикрепления хвостов нескольких десятков фагов к определенной части бактериальной стенки. Тотчас же лизоцим растворяет клеточную мембрану. Аппарат хвоста вируса действует наподобие шприца: «мышцы» сокращаются и нуклеиновая кислота впрыскивается внутрь клетки. Верхняя «одежда» вируса - белковый чехол - остается снаружи клетки. Так завершается «оккупация» бактерий фагами. Весь процесс длится всего несколько минут.

Нуклеиновая кислота играет главную роль в воспроизведении фага. Это было доказано немецкими учеными в опытах по гибридизации вирусов.

Однако не все вирусы так агрессивны, как фаги, не у всех есть хвост с набором необходимых для взлома клетки инструментов. Как же в этих случаях вирус проникает на чужую территорию?

Как ни парадоксально, в этих случаях сама клетка осуществляет внедрение вирусов - она как бы заглатывает их. На протяжении эволюции у клеток выработался механизм активного захвата из окружающей среды различных твердых частиц (фагоцитоз) и капелек жидкости (пиноцитоз). Этот механизм играет большую роль в нормальной жизнедеятельности клетки. В случае же встречи с вирусом происходит как бы «самоубийство» клетки.

Участие обратной транскриптазы в образовании комплиментарной ДНК на вирусной одноцепочечной РНК-матрице в животной клетке

При «заглатывании» вируса клетка стремится «переварить» его специальными ферментами клетки. «Война» может быть закончена миром, если клетке не удастся подобрать ключ - соответствующий фермент для растворения белковой оболочки. В случае же наличия в клетке подходящего фермента происходит следующее: фермент разрушит оболочку вируса, освободит нуклеиновую кислоту, которая по клеточным каналам быстро доберется до ядра клетки и проникнет в него или останется в цитоплазме. Вот с этого момента начинается размножение вируса. Далее клетка будет разрушена.

Далее вирусная нуклеиновая кислота, подавляя производство молекул клетки, вынуждает клетку производить вирусы. Вначале оккупированная клетка начинает синтезировать ферменты - полимеразы, снимающие копии с нуклеиновой кислоты вируса. Таким образом происходит редупликация, совершающаяся в разных частях клетки, в зависимости от вируса. При образовании достаточного количества вирусных нуклеиновых кислот часть из них отправляется на производство белков клетки. Рибосомы теперь вынуждены синтезировать вирусные белки вместо собственных. Оставшаяся часть вирусных нуклеиновых кислот идет на производство дочерних вирусов.

6. Классификация

По характеру взаимодействия фага с клеткой все бактериофаги делятся:

* на вирулентные (литические), вызывающие продуктивную инфекцию и лизис бактериальной клетки;

* умеренные, вызывающие латентную инфекцию и ассоциацию генома вируса с бактериальной хромосомой. Умеренные фаги, в отличие от вирулентности, не вызывают гибели бактериальных клеток и при взаимодействии с ней переходят в неинфекционную форму фага, называемую профагом.Профаг -- геном фага, ассоциированный с бактериальной хромосомой.Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геномом бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке в неограниченном числе поколений. Бактериальные клетки, содержащие в своей хромосоме профаг, называются лизогенными. Профаг в лизогенных бактериях самопроизвольно или под влиянием различных индуцированных агентов может переходить в вегетативный фаг. В результате такого превращения бактериальная клетка лизируется и продуцирует новые фаговые частицы. В ходе лизогенизации бактериальные клетки могут дополнительно приобретать новые признаки, детерминируемые геномом вируса. Такое явление -- изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага -- называется фаговой, илилизогенной, конверсией (проявление вирус-инду-цироанной трансформации).

Умеренные фаги, неспособные ни при каких условиях переходить из профага в вегетативный фаг (образовывать зрелые фаговые частицы), называются дефектными, чаще это происходит в результате нарушения стадии сборки вирусных частиц. Некоторые умеренные фаги называются трансдуцирующими,поскольку с их помощью осуществляется один из механизмов генетической рекомбинации у бактерий - трансдукции. Такие фаги могут использоваться, в частности, в генной инженерии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК и/или приготовлении рекомбинантных (генно-инженерных) вакцин.

Специфичность фагов послужила основанием для их наименования по видовым и родовым названиям чувствительных к ним бактерий. Так, например, фаги, лизирующие стрептококки, называются стрептококковыми, лизирующие холерные вибрионы -холерные, стафилококки -- стафилококковыми. По признаку специфичности выделяютполивалентные бактериофаги, лизирующие культуры одного семейства или рода бактерий, моновалентные (монофаги) -- лизирующие культуры только одного вида бактерий, а также отличающиеся наиболее высокой специфичностью -- типовые бактериофаги, способные вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий.

Наборы таких типоспецифических фагов используются для дифференцировки бактерий внутри вида -- это метод фаготи-пирования бактерий. С помощью этого метода можно установить источник и пути передачи инфекционного заболевания, т. е. провести его эпидемиологический анализ, поскольку он позволяет сравнивать фаготипы (фаговары)чистых культур бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования от больного и от окружающих его лиц -- возможных бактерионосителей.

Фаги получают индукцией из лизогенных культур или из объектов, содержащих соответствующие бактерии, при культивировании на жидкой питательной среде с последующим выделением из культуральной жидкости путем фильтрования через бактериальные фильтры. Активность полученного (выделенного) фага определяют путем титрования или определения количества фаговых частиц в единице объема среды методом агаровых слоев по Трациа. Суть его состоит в том, что на газон чувствительной культуры (первый слой) наносят определенное разведение фага в полужидком агаре (второй слой). Каждая фаговая частица, размножаясь на бактериальном газоне, образует на поверхности выросшей культуры стерильное пятно ("бляшка", или негативная колония фага). Таким образом, по количеству стерильных пятен можно подсчитать количество фаговых частиц в единице среды (титр фага).

7. Примеры бактериофагов

· Бактериофаг брюшнотифозный обладает способностью лизировать сальмонеллы брюшного тифа. Применяют для профилактики брюшного тифа у взрослых и детей.

· Бактериофаг дизентерийный поливалентный (Дизфаг) вызывает специфический лизис шигелл Флекснера и Зонне - возбудителей бактериальной дизентерии. Применяется при бактериальной дизентерии: лечение больных бактериальной дизентерией, санация реконвалесцентов (бактерионосительство), профилактика бактериальной дизентерии.

· Бактериофаг клебсиелл пневмонии (Клебсифаг) обладает способностью специфически лизировать бактерии клебсиелл пневмонии. Предназначен для лечения гнойно-септических и энтеральных заболеваний, вызванных бактериями клебсиелл пневмонии: хирургические инфекции, заболевания урогенитальной сферы, желудочно-кишечного тракта, гнойно-воспалительных заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких, генерализованные септические заболевания, гнойно-септические заболевания новорожденных.

· Бактериофаг клебсиелловый (клебсиеллезный) поливалентный обладает способностью специфически лизировать бактерии клебсиелл озены, риносклеромы и пневмонии. Предназначен для лечения заболеваний, вызванных бактериями клебсиелл: лечение озены, риносклеромы, гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла и носа клебсиеллезной этиологии; инфицированных ран, абсцессов, цистита, пиелонефрита, энтеральных заболеваний, вызванных бактериями клебсиелл. Применяется также профилактически при обсемененности внутрибольничными штаммами клебсиелл.

· Бактериофаг коли (Колифаг) обладает способностью специфически лизировать энтеропатогенные кишечные палочки (E.coli) наиболее значимые в этиологии гнойно-воспалительных заболеваний. Применяют для лечения и профилактики инфекций кожи и внутренних органов, вызванных кишечной палочкой (гнойно-септические заболевания, гнойно-осложненные раны, ожоги, абсцесс, флегмона, фурункулы, карбункулы, гидрадениты, бурситы, тендовагиниты, остеомиелиты, маститы, плевриты, холецистит, проктит, цистит, пиелит, пиелонефрит, эндометрит, кольпит, сальпингоофорит, энтерит, энтероколит, токсикоинфекции); для профилактики колиинфекций.

· Бактериофаг колипротейный (Колипротеофаг) обладает способностью специфически лизировать распространенных энтеропатогенных эшерихий и протея (Pr.mirabilis и Pr.vulgaris). Применяется для лечения и профилактики энтероколитов; для лечения кольпитов колипротейной этиологии и других заболеваний, вызванных коли и протейными бактериями (цистит, пиелит, пиелонефрит, эндометрит, сальпингоофорит, энтеральная патология).

· Бактериофаг протейный (Протеофаг) обладает способностью специфически лизировать бактерии протея (Pr. mirabilis и Pr. vulgaris). Применяется для лечения и профилактики гнойно-воспалительных и кишечных заболеваний, вызванных протейными бактериями видов вульгарис и мирабилис (хирургические инфекции, урогенитальная инфекционная патология, энтеральные инфекции); с профилактической целью при свежеинфицированных ранах; при дисбактериозе кишечника.

· Бактериофаг сальмонеллезный групп АВСДЕ способен вызывать лизис сальмонелл и близких к ним по антигенной структуре бактерий. Применяют при сальмонеллезе у детей и взрослых: лечение сальмонеллеза, санация реконвалесцентов (бактерионосительство), профилактика сальмонеллезов по эпидпоказаниям.

· Бактериофаг синегнойный (псевдомонас аэругиноза) обладает способностью специфически лизировать бактерии псевдомонас аэругиноза. Применяют для лечения и профилактики гнойно-воспалительных заболеваний различных органов, вызванных синегнойной палочкой (заболевания уха, горла, носа, дыхательных путей и легких, хирургические, урогенитальные, энтеральные инфекции, септические заболевания, гнойно-воспалительные заболевания новорожденных), а также дисбактериозов; с профилактической целью для обработки послеоперационных и свежеинфицированных ран; для профилактики внутрибольничных инфекций.

· Бактериофаг стафилококковый (Стафилофаг) обладает способностью лизировать стафилококковые бактерии, выделенные при гнойных инфекциях. Применяется для лечения и профилактики гнойных инфекций кожи, слизистых, висцеральных органов, вызванных стафилококковыми бактериями (синусит, отит, ангина, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит, гнойные раны, инфицированные ожоги, абсцесс, флегмона, фурункул, карбункул, гидраденит, панариций, парапроктит, мастит, бурсит, остеомиелит, уретрит, цистит, пиелонефрит, кольпит, эндометрит, сальпингоофорит, гастроэнтероколит, холецистит, омфалит, сепсис), а также при дисбактериозе кишечника.

· Бактериофаг стрептококковый (Стрептофаг) обладает способностью лизировать стрептококковые бактерии, выделенные при гнойных инфекциях. Применяется для лечения и профилактики гнойных инфекций кожи, слизистых, висцеральных органов, вызванных стрептококками (синуситы, отит, ангина, тонзиллит, фарингит, ларингит, трахеит, бронхит, пневмония, плеврит, нагноения ран, гнойносложные ожоги, абсцесс, флегмона, фурункул, карбункул, гидраденит, панариций, парапроктит, мастит, бурсит, тендовагинит, остеомиелит, уретрит, цистит, пиелит, пиелонефрит, кольпит, эндометриг, сальпингоофорит, гастроэнтероколит, холецистит, омфалит, пиодермия, сепсис), а также при дисбактериозе кишечника.

· Интести-бактериофаг обладает способностью специфически лизировать шигеллезные, сальмонеллезные, стафилококковые и энтерококковые бактерии, энтеропатогенную кишечную палочку, протей, псевдомонас аеругиноза. Применяется для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных чувствительными микроорганизмами: бактериальной дизентерии, сальмонеллеза, брюшного тифа, паратифа, дисбактериозов, энтероколита, колита, диспепсии.

· Пиобактериофаг комбинированный (Пиополифаг) способен лизировать стафилококки, стрептококки (в т.ч. энтерококки), протея (мирабилис и вульгарис), синегнойную (псевдомонас аэругиноза) и кишечную палочки. Предназначен для профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла, носа, пазух носа, дыхательных путей, легких; хирургических инфекций (нагноения, абсцесс, флегмона, остеомиелит, перитонит); урогенитальных инфекций (уретрит, цистит, пиелонефрит); гинекологических инфекций (кольпит, эндометрит, сальпингоофорит); энтеральных инфекций (гастроэнтероколит, холецистит, дисбактериоз); гнойно-септических заболеваний новорожденных.

· Пиобактериофаг поливалентный (Секстафаг) обладает способностью специфически лизировать стафилококки, стрептококки (в т.ч. энтерококки), эшерихию коли, протея (мирабилис и вульгарис), псевдомонас аэругиноза и клебсиеллу пневмония. Предназначен для профилактики и лечения различных форм гнойно-воспалительных и энтеральных заболеваний: гнойно-воспалительных заболеваний уха, горла, носа, дыхательных путей, легких и плевры; хирургических, урогенитальных и энтеральных инфекций; генерализированных септических заболеваний, в т.ч. гнойно-септических заболеваний новорожденных и детей грудного возраста.

· Пиобактериофаг комплексный жидкий представляет собой смесь фаголизатов стафилококков, стрептококков, энтерококков, эшерихий коли, протея (мирабилис и вульгарис), псевдомонас аэругиноза и клебсиелл (пневмония и окситока). Применяется для лечения и профилактики гнойно-воспалительных и кишечных заболеваний: заболеваний уха, горла, носа, дыхательных путей и легких; хирургических инфекций; урогенитальных инфекций; энтеральных инфекций; генерализованных и септических заболеваний; гнойно-воспалительных заболеваний новорожденных; для обработки послеоперационных и свежеинфицированных ран.

8. Распространение бактериофагов

Фаги широко распространены в природе и всегда находятся там, где имеются бактерии. Они обнаруживаются в организме людей, животных, в воде открытых водоемов, в сточных водах, почве, бактериях.

Для выделения фага исследуемый материал фильтруют через бактериальные фильтры. Полученный фильтрат наносят на плотные питательные среды, засеянные соответствующими микробами, в которых способен размножаться фаг. Образование «стерильных» пятен на месте размножения фага свидетельствует об его присутствии.

9. Титрование фагов

Титрование фага по Грация (на плотной среде) методом агаровых слоев позволяет определить количество частиц фага в титруемом материале. Метод основан на том, что каждая частица фага дает зону просветления (лизиса) на чашке с газоном чувствительного к нему микроба, т. е. образует отдельную колонию.

Постановка опыта. Чашки с 20-25 мл МП А покрывают стерильной фильтровальной бумагой и подсушивают в термостате или под бактерицидной лампой (расстояние от лампы не более 2 м). Титруемый фаг разводят от 10 ~' до 10 ~10 (как в предыдущем опыте) и по 1 мл переносят в другие пронумерованные пробирки (соответственно из 1-й в 1-ю и так далее до 10-й), в которые заранее наливают по 2,5 мл 0,7% МПА, расплавленного и остуженного до 45 °С. В каждую из этих пробирок добавляют по 0,1 мл тест-культуры. Содержимое пробирок быстро перемешивают (не дать застыть агару) и выливают на поверхность среды в чашки Петри с номерами, соответствующими номерам пробирок. Через 30 мин чашки ставят в термостат.

Учет результатов проводят через 18-20 ч. При большой концентрации фага (в первых чашках) произойдет сплошной лизис культуры. В тех разведениях фага, в которых находилось небольшое количество частиц фага, появятся изолированные колонии, которые подсчитывают. Чтобы не ошибиться в счете, каждую учтенную колонию помечают со стороны дна чашки. Аппарат для счета колоний намного облегчает работу. Чтобы установить количество частиц фага в 1 мл фаголизата, пользуются формулой: п = ухх, где п-искомое число; у-количество выросших на чашке колоний фага; х-разведение фага в чашке, в которой подсчитаны колонии.

Например, если в чашке с разведением фага Ю-8 (1:108) выросло 25 колоний, то в 1 мл исходной жидкости содержится 25х108 или 2,5х109 частиц фага.

Более точньге результаты получают, если определяют количество частиц фага в исходной жидкости по нескольким разведениям и вычисляют среднее арифметическое. Например, при разведении фага Ю-6 выросло 320 колоний, следовательно, в 1 мл исходной жидкости было 320x10 или 3,2х108 частиц фага. При разведении фага Ю-7 выросло 42 колонии, следовательно, в исходной жидкости было 4,2х108/мл частиц фага. При разведении фага Ю-8 выросло 5 колоний, следовательно, в исходной жидкости было 5х108/мл частиц фага. Сложив величины, полученные при этих подсчетах и разделив сумму на 3 (количество проведенных подсчетов), устанавливают число частиц фага в 1 мл титруемого препарата. В нашем примере оно равно 4,1х108.

Подсчитывать колонии лучше всего на чашках, где выросло не меньше 5 и не больше 50 колоний. В противном случае страдает точность подсчета. Если на чашке много колоний, чашку можно разделить на несколько секторов, сосчитать колонии на одном из них и полученную" цифру умножить на количество секторов.

Как правило, все биологические исследования проводят в трех параллельных опытах. В данном примере каждое разведение фага одновременно титруют трижды.

10. Практическое применение

Препараты фагов применяют для лечения и профилактики инфекционных болезней, а также в диагностике -- для определения фагочувствительности и фаготипироваиия при идентификации микроорганизмов. Действие фагов основано на их строгой специфичности.

Лечебнопрофилактическое действие фагов обусловливается литической активностью самого фага, а также иммунизирующим свойством находящихся в фаголизатах компонентов (антигенов) разрушенных микробных клеток, особенно в случае неоднократного применения.

При получении препаратов фагов используют проверенные производственные штаммы фагов и соответственно типичные культуры микроорганизмов. Бактери. альнуго культуру в жидкой питательной среде, находящуюся в логарифмической фазе размножения, заражают маточной взвесью фага. Лизированную фагом культуру (обычно на следующий день) фильтруют через бактериальные фильтры и к фильтрату, содержащему фаг, в качестве консерванта добавляют раствор хинозола.

Готовый препарат фага представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета. Для более длительного хранения некоторые фаги выпускаются в сухом виде (в таблетках). При лечении и профилактике кишечных инфекций фаги применяют одновременно с раствором гидрокарбоната натрия, так как кислое содержимое желудка разрушает фаг. Сохраняется фаг в организме недолго (5--7 дней), поэтому рекомендуется применять повторно.

В Советском Союзе выпускаются следующие препараты, используемые для лечения и профилактики заболеваний: брюшнотифозный, сальмопеллезный, дизентерийиныи, колифаг, стафилококковый фаг и стрептококковый. В настоящее время фаги применяют для лечения и профилактики в сочетании с антибиотиками. Такое применение оказывает более эффективное действие на антибиотикоустойчивые формы бактерий.

Диагностические бактериофаги широко применяются для идентификации бактерий, выделенных от больного или из инфицированных объектов внешней среды. С помощью бактериофагов вследствие их высокой специфичности можно определить виды бактерий и с большей точностью отдельные типы выделенных бактерий. В настоящее время разработаны фагодиагностика и фаготипирование бактерий рода Salmonella, Vibrio и стафилококков. Фаготипирование помогает устанавливать источник инфекции, изучать эпидемиологические связи, отличать спорадические случаи заболеваний от эпидемических.

В основе фагодиагностики и фаготипирования лежит принцип совместного культивирования выделенного микроорганизма с соответствующими видовыми или типовыми фагами. Положительным результатом считается наличие хорошо выраженного лизиса исследуемой культуры с видовым, а затем с одним из типовых фагов.

11. Проблема антибиотиков и бактериофагов

Очевидные достоинства фагов с точки зрения фармацевтического бизнеса и клинической практики оказались недостатками. Узкая специфичность бактериофагов требует, чтобы возбудитель болезни был точно известен: только тогда можно выбрать «эффективного» фага. Значит, до начала терапии необходимо идентифицировать патогенный микроб: потратить время, лабораторные материалы, человеко-часы микробиолога. Получается слишком много мороки для участкового терапевта, к которому пришёл пациент с обыкновенной ангиной. Антибиотики гораздо удобнее: скорее всего выписанный наугад антибиотик убьёт возбудителя болезни. Если вдруг не убьёт, можно выписать второй, третий.

Кроме того, высокая специфичность подразумевает наличие огромного «арсенала» фагов - примерно такого же разнообразного, как «зоопарк» патогенных микробов. На практике применяют «коктейли», содержащие разных бактериофагов. А для антибиотикотерапии почти любой бактериальной инфекции может подойти не один, так другой антибиотик из сельской аптеки. Бактериофаги - почти живые организмы, их нельзя «синтезировать» тоннами в химическом реакторе, можно только «разводить» в лаборатории. Кроме того, бактериофаги относятся к вирусам: само это слово часто пугает пациента. Для фармацевтических компаний в работе с бактериофагами есть свои сложности: вирусы - объекты на границе живого и неживого, нет чёткой законодательной базы для их патентования и регистрации в качестве лекарств.

Поэтому бактериофаги были интересны ученым на Западе, которые ориентируются на потенциальное применение своих результатов, лишь до тех пор, пока не открыли антибиотики. Широкое распространение химических антибиотиков отвлекло внимание от лучшего, но менее «удобного» класса средств. До сих пор ни в одной стране Запада не разрешено применение фагов в качестве лекарства. При этом учёные продолжали активно изучать бактериофагов и использовать как удобную модель для фундаментальных исследований в молекулярной генетике.

В СССР науку финансировали без оглядки на немедленную прибыль, поэтому здесь фаговой терапии повезло больше: исследования в Институте бактериофагии, микробиологии и вирусологии им. Элиавы АН Грузии и в других центрах продолжались, а в 1940-е годы фаговая терапия широко применялась, в частности, в Красной Армии. Публикации об успехах фаговой терапии выходили на русском и грузинском языках и были недоступны для научного мира за «железным занавесом». Если что-то и становилось доступно, то оставалось без внимания, так как репутация советской биологии была сильно подмочена во времена официального непризнания генетики и клеточной теории - фундаментальных общебиологических учений. Однако и в СССР антибиотики вытесняли фагов. Сейчас фаговую терапию предлагает Центр фаговой терапии на базе Института им. Элавы.

В последние годы ситуация в мире стала меняться. Всё больше данных о вреде антибиотиков; всё больше штаммов, которые устойчивы ко многим антибиотикам; всё более «привередливы» и состоятельны пациенты: не хотят дешевой и доступной терапии и отдают предпочтение безвредной и эффективной. В наши дни слово «химиотерапия» пугает общественность уже больше, чем слово «вирус».

С другой стороны, прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии упростил манипуляции с фагами и их «разведение», а конец холодной войны сделал достижения советских учёных (особенно грузинских) доступными для западных коллег. При обычных случаях инфекций нет смысла «возиться» с бактериофаговой терапией - работает и стандартная терапия антибиотиками. Однако всё чаще встречаются инфекции, вызванные штаммами, которые устойчивы к антибиотикам. В таких случаях фаги оказываются единственным эффективным средством.

В 2006 году Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) признало бактериофагов безопасными в качестве добавки, которая предотвращает размножение нежелательных бактерий на сырах, а в 2007 году их признали и для других продуктов, так что сейчас фаги служат безвредным консервантом.

В ближайшее время ожидаются и более серьёзные применения фагов: итальянские учёные Розанна Каппарелли (Rosanna Capparelli), Марианна Парлато (Marianna Parlato), Джорджа Боррьелло (Giorgia Borriello) и их коллеги из Неаполитанского университета им. Федерико II (Universit? degli Studi di Napoli Federico II) открыли бактериофаг, названный ими MSa, который уничтожает штаммы стафилококка, устойчивые к антибиотику метициллину - главному оружию в борьбе со стафилококковой инфекцией. Стафилококк золотистый поражает многие органы и системы и может приводить к смерти при отсутствии эффективного лечения. В настоящее время от 40% до 60% случаев инфекций вызваны штаммами, которые устойчивы к метициллину. Именно в таких случаях фаговая терапия может быть незаменимой. Пока получены обнадеживающие результаты на лабораторных мышах: MSa предотвращает смерть и полностью уничтожает бактерию золотистого стафилококка в организме.

Сиднейская компания Special Phage Holdings разработала методику лечения с помощью бактериофагов инфекций, вызванных бактериями, устойчивыми ко многим антибиотикам (так называемые multidrug resistant), которые являются главной проблемой в современной терапии инфекционных болезней. Методика успешно проходит клинические испытания. И компания рассчитывает первой захватить новый сектор фармацевтического рынка в Австралии.

Кроме применения фагов просто в качестве «убийц» бактерий, рассматриваются и другие варианты. Так, недавно было предложено использовать бактериофаги в роли троянского коня. Учёным давно известно, что фаги (как и все вирусы) имеют специальные молекулярные механизмы для введения в клетку-жертву своей генетической информации (носитель - цепочка ДНК или РНК). Теперь учёные додумались использовать этот механизм для введения в бактериальные клетки традиционного антибиотика. Такие «наноинъекции» обеспечивают эффективную доставку антибиотика именно внутрь бактерии-возбудителя болезни, а не по всему организму, как это происходит при обыкновенном введении.

Чтобы оценить преимущества и возможности терапии с помощью бактериофагов, несправедливо отвергнутой большинством учёных, потребовалось немало времени. Но сегодня забытый метод переживает второе рождение и имеет все шансы стать весьма эффективным оружием в борьбе человека с враждебным микромиром.

Список литературы

1. Раутенштейн Я.И., Бактериофагия, М., 1955

2. Кривиский А.С., Проблемы бактериофагии, в сборнике: Актуальные вопросы вирусологии, М., 1960

3. Общая биология. 10-11 кл.: учеб. для общеобразоват. учреждений/ А.А. Каменский, Е.А. Криксунов, В.В. Пасечник. М.: Дрофа, 2007

4. Габриэлян Н.И., Горская Е.М., Спирина Т.С., Дарбеева О.С.// Микробиология. 2004, 6. С. 6-10.

5. Баев А.А. Бактериофаги. Пущино.: НЦБИ, 1982

Размещено на http://www.allbest.ru/