Біосинтез ферменту каталази грибом Penicillium vitale

Зміст

Вступ

Розділ 1. Характеристика продукту мікробного синтезу

1.1 Фізико-хімічні властивості ферменту каталази

1.2 Джерела та методи виділення ферменту

1.3 Практичне використання препаратів каталази

1.4 Методи кількісного та якісного визначення ферменту

Розділ 2. Вибір біологічного агента

Розділ 3. Характеристика біологічного агента

3.1 Морфолого-культуральні ознаки

3.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

3.3 Таксонономічне положення

Розділ 4. Вибір поживного середовища для вирощування біологічного агента

4.1 Зберігання музейної культури біологічного агента

4.2 Підготовка посівного матеріалу P vitale

4.3 Культивування з барботажем через середовище повітря і механічним перемішуванням

4.4 Метод направленого культивування P. vitale для підвищення виходу каталази

Список літератури

Вступ

Виникнення і швидкий розвиток біотехнології ґрунтується насамперед на використанні мікроорганізмів як продуцентів практично цінних продуктів (антибіотики, ферменти, органічні кислоти, амінокислоти, вітаміни, полісахариди та ін.). На використанні мікроорганізмів базуються методи генної інженерії, за якими можна створювати нові штами з новими корисними властивостями.

Біотехнологічні процеси з використанням мікроорганізмів і ферментів уже на сучасному технічному рівні широко застосовують у харчовій промисловості. Промислове вирощування мікроорганізмів, рослинних і тваринних клітин використовують для одержання багатьох цінних сполук -- ферментів, гормонів, амінокислот, вітамінів, антибіотиків, метанолу, органічних кислот (оцтової, лимонної, молочної) і т.д. За допомогою мікроорганізмів проводять біотрансформацію одних органічних сполук в інші (наприклад, сорбіта у фруктозу). Широке застосування в різноманітних виробництвах одержали іммобілізовані ферменти. Для виділення біологічно активних речовин зі складних сумішей використовують моноклональні антитіла. Багато промислових технологій заміняються технологіями, що використовують ферменти і мікроорганізми. Такі біотехнологічні методи переробки сільськогосподарських, промислових і побутових відходів, очищення і використання стічних вод для одержання біогазу і добрив. У ряді країн за допомогою мікроорганізмів одержують етиловий спирт, що використовують як пальне для автомобілів. На спроможності різноманітних бактерій перетворювати метали в розчинні сполуки або накопичувати їх у собі заснований витяг багатьох металів із бідних руд або стічних вод [6].

Виготовлення ферментних препаратів займає одне з передових місць в сучасній біотехнології. Об'єм продукції постійно росте, а сфера використання постійно розширюється. Такий швидкий розвиток пов'язаний з тим, що ферменти є високоактивними, нетоксичними біокаталізаторами білкового походження, які широко поширені в природі і без них неможливе здійснення багатьох біохімічних процесів і життя в цілому.

Пізнання ролі ферментів для всього живого на Землі стало основою для створення і розвитку технології ферментних препаратів як науки і для створення промислового виробництва найбільш широко використовуваних ферментних препаратів. Використання цих препаратів дозволило суттєво змінити, інтенсифікувати і удосконалити багато існуючих технологій чи навіть створити принципово нові високоефективні процеси.

Великою перевагою ферментів перед хімічними каталізаторами є те, що вони діють при нормальних тисках, при температурах від 20 до 70 0С і рН в діапазоні від 4 до 9. В більшості випадків ферменти мають виключно високу субстрату специфічність, що дозволяє в складній суміші біополімерів діяти лише на певні елементи. Все це свідчить про те, що вироблення ферментних препаратів є одним із перспективних напрямків в біотехнології, який і далі буде інтенсивно розвиватися та розширюватися [5].

Україна чи не єдина Європейська держава, яка нині не приділяє належної уваги формуванню ринку біотехнологічної продукції. Сучасний стан біотехнологічної галузі України характеризується наявністю науково-технологічного потенціалу і практично повною відсутністю структури, яка б сприяла широкому впровадженню біотехнологічних розробок. Тому медична, сільськогосподарська та промислова галузі, які використовують мікробні біотехнологічні препарати і процеси, майже повністю залежить від постачання цієї продукції із-за кордону. Сьогодні в Україні значний внесок у створенні біотехнологічних мікробних продуктів роблять науково-дослідні установи НАН України, інших академій, деяких міністерств, кафедри вищих навчальних закладів. Проте необхідна зацікавленість владних структур України, а саме належне фінансування, що дозволило б впроваджувати інноваційні розробки в технологічні процеси, підвищуючи рівень розвитку промислових структур [6].

Розділ 1. Характеристика продукту мікробного синтезу

1.1 Фізико-хімічні властивості ферменту каталаза

Каталаза (H2O2:H2O2 - оксидоредуктаза, КФ 1,11,1,6) є білком, що відноситься до гемінової групи ферментів. Каталаза широко поширена в природі, вона виявлена у тварин, рослин і мікроорганізмів, за виключенням анаеробів.

У більшості тварин каталаза виявлена в печінці, еритроцитах і нирках. Головна роль каталази полягає в захисті клітин організму від токсичної дії перекисі водню, що утворюється в клітинах під дією деяких флавінових ферментів, таких, як ксантиноксидаза, амінооксидаза, оксидаза D- і L- амінокислот та деяких інших. Каталаза, руйнуючи перекись водню, регенерує кисень, який може бути використаний іншими ферментами при окисленні різноманітних субстратів. Інакше кажучи, каталаза може діяти пероксидазним шляхом і безпосередньо приймати участь в обміні ряду донорів водню. Є дані, які дозволяють припускати, що ряд серйозних захворювань в організмі людини пов'язаний з пониженням рівня кталази в печінці та інших органах. Це дає підставу розглядати каталазу як один із перспективних профілактичних лікарських засобів.

Дослідженню механізму дії каталази присвячений цілий ряд робіт. На думку багатьох авторів каталаза і пероксидаза прискорюють реакції одного типу, проте каталаза окислює лише одну перекис водню і не окислює більшість речовин, на які діє пероксидаза. Відомо декілька теорій, що по-різному пояснюють механізм дії каталази на перекис, але всі вони говорять про складний процес розкладання перекисі водню на О2 і H2O з утворенням не менше двох комплексів ферменту з субстратом, в результаті чого відбувається окислення простатичної групи ферменту, а потім її відновлення. Простатична група каталази міцно зв'язана з білковою частиною молекули, найймовірніше, через карбоксильні залишки. Відмінною особливістю каталази є те, що її простетична група безпосередньо приймає участь в активації субстрату.

Фермент каталаза каталізує розкладання перекисі водню на воду і молекулярний кисень:

1 тип. H2O2 + Каталаза > Каталаза ? H2O2 .

2 тип. Каталаза ? H2O2 + H2O2 > Каталаза + O2 + 2H2O .

В присутності спиртів і невеликої кількості перекисі водню фермент може окислювати спирт до альдегіду, тобто проявляти проксидазну активність. В цьому випадку використовується одна молекула перекисі водню.

3 тип. Каталаза ? H2O2 + С2Н5ОН > Каталаза + 2H2O + СН3СНО .

Тип реакції, що відбувається залежить від концентрації в реакційному середовищі перекисі водню. При її високому вмісті відбувається каталазна реакція типу (1 і 2), а при низьких - реакція пероксидазного типу (3). В умовах існування живої клітини каталаза працює, як правило по пероксидазному шляху.

Каталази, в залежності від місця локалізації і походженні, помітно відрізняються між собою по структурі, ферментативній активності і фізико-хімічних властивостях. Простетичною групою більшості каталаз є гематин, що являє собою халатне утворення, в якому атом заліза з'єднаний з тетрапірольною (порфіриновою) кільцевою структурою - протопорфірином IX. На рис.1.1 зображено структуру гематину, що входить до складу каталази.

Рис.1.1 Структура гематину [16]

Характер зв'язків простетичної групи з білком остаточно не встановлений. В літературі обговорюється питання про можливість взаємодії карбоксильної групи пропіонової кислоти бокового ланцюга гематину з гуанідиновими групами аргінілових залишків чи азотом гістидину подібно тому, як це має місце в міоглобіні і гемоглобіні.

В молекулі каталази окиснене залізо є стабілізованим. В процесі розкладання перекисі водню каталазою, валентність заліза не змінюється. Відновлення F2+ можливе лише при денатурації ферменту. В молекулі міститься до 0,09% заліза, молекулярна маса складає 240000-300000. Ці цифри свідчать, що в молекулу ферменту входять чотири атоми заліза, які приймають участь в формуванні чотирьох простетичних груп ферменту.

Рентгенографічні дослідження структури каталази Penicillium vitale (рис.1.2) показали, що розміри молекули каталази, виміряні по моделі, рівні 70 х 90 х 120 А. Фермент володіє субодиничною структурою. Аналіз амінокислотного складу каталази P.vitale показує високий вміст аспарагінової і глютамінової кислот, аланіну, лейцину, фенілаланіну. В білковій частині каталази відмічається низький вміст тирозину, триптофану, гістидину і проліну. Порівняльно низький вміст двох останніх амінокислот свідчить про високу ступінь спіралізації поліпептидного ланцюга і компактності молекули каталази. Ця особливість чітко просліджується для каталази мікробного походження.

Рис.1.2 Каталаза Penicillium vitale [16]

Каталаза є глікопротеїдом, до складу її вуглеводневого компоненту (що становить 8,2% ) входять 44 залишки нейтральних цукрів (маноза, галактоза) та 19 залишків глюкозаміну.

Мікробні каталази (P.vitale) не містять сульфгідрильних груп, в той час як каталаза тваринного походження (бичача печінка) містить їх до 16. Молекулярна маса ферменту, продукованого P.vitale має молекулярну масу 2459000, що є близьким значенням до молекулярної ваги каталаз тваринного походження, проте відрізняється від них більшою константою седиментації (S20=13.8х10-3 с-1), константою дифузії (D20 = 5.1x10-7 см2/сек.). Також каталаза цього промислового штаму володіє порівняльно високою термостабільність. Так, при 10-хвилинний експозиції при 65оС активність зберігається повністю, при 75 оС інактивується 50% ферменту і тільки при 80 оС фермент повністю інактивується. Ці показники значно вищі, чим для каталаз із інших джерел. Каталази мікробного походження володіють широким спектром оптимального рН - від 4до 9 [5].

Існують каталази, що збудовані з зовсім інших ланцюгів амінокислот і мають інший активний центр, до якого входять два атома марганцю, але відсутня гемова група. Просторову структуру димарганцевої Т каталази з термофільної бактерії Тhermus thermophilus визначили в лабораторії Б. К. Вайнштейна в 1986-2000 роках послідовно, при розрішенні 3 і 1,0 A. Її молекула (молекулярна маса 200 кДа) складається з шести ідентичних суб'єдиниць, що утворюють гексамер. Аналіз структури області активного центру дозволив запропонувати механізм розщеплення перекису водню. Незважаючи на разючі відмінності в структурі, обидві описані каталази виконують одну й ту ж функцію [7].

1.2 Джерела та методи виділення ферменту

Виділення каталази можна проводити методом сорбції на оксиді алюмінію із нативної культуральної рідини або з ультраконтцентрата. Каталаза порівняно легко ( на 90-95%) елююється з сорбенту 0,1м фосфатним буфером при рН 6,8. Далі її можна осаджувати ізопропіловим спиртом у відношенні 1:1,2 і потім висушувати. Активність препарату складає 80-90% від вихідної. В промислових умовах при глибинному культивуванні P.vitale можна отримувати препарат з каталазною активністю до 1300-1500 од/мл культуральної рідини, що містить до сухої речовини 0,12-0,14% білка і близько 1,5-1,8% сухої речовини. Готова культуральна рідина має рН близько 3-4. При промисловому виробництві доречно використовувати методи ультрафільтрації, так як вони дозволяють не лише сконцентрувати ферментний розчин, але й очистити його від низькомолекулярних баластних речовин. З ультраконцентрата культуральної рідини каталазу можна добути методом сорбції на оксиді алюмінію чи інших алюмінієвмісних сорбентах (наприклад, каоліні). Потім каталазу відділяють з сорбенту і піддають традиційним методам очищення і кристалізації.

Препарати каталази раніше виділяли з листя тютюну, шляхом осадження водного екстракту сірчанокислим амонієм. Пізніше, джерелом ферменту стали печінка великої рогатої худоби, свиней, коней, мікроорганізми[14]. В промислових умовах каталазу отримують переважно на основі глибинного культивування культури P.vitale з використанням сорбційних і ультрафільтраційних методів. Препарати випускають в сухому вигляді. Каталаза являє собою темно-зелений кристалічний порошок, добре розчинний у воді (рис.1.3). Промислові препарати каталази P.vitale володіють високою активністю - 1г препарату містить 4-8 млн. од. активності і питому активність до 20 млн. од. на 1 г білка (тут за одиницю каталазної активності приймається кількість ферменту, що каталізує розкладання мкмоля перекисі водню за 1 хв при концентрації субстрату 0,01 М, рН 6,8 і температурі 0єС). Сухі препарати каталази при температурі 3-6 єС зберігають активність, готова допустима втрата активності складає не більше 20%. Препарати фасуються в скляні флакони по 5 млн. од., які герметично закриваються.



Рис. 1.3. Кристали каталази Penicillium vitalе [7]

Важливо підкреслити, що каталаза, синтезована мікроорганізмами, володіє високою стійкістю до кислого середовища, вона є більш термостабільною та безпечною, оскільки при її використанні не існує ризику передачі хвороб, властивих тваринам. Практично повна стабільність препарату каталази спостерігається при рН середовища 4-9, порівняно висока активність відмічена при рН 3 (рис.1.4.) тоді як каталаза, отримана з тваринних тканин, при рН 3 повністю інактивується за декілька хвилин.

Оптимальний рН для грибних каталаз лежить в інтервалі 4-9, тобто значно ширше ніж для препаратів, отриманих на основі бактерій і тваринних тканин.

Каталаза чутлива до присутності в розчині деяких аніонів. Найбільшу стабільність вона проявляє при рН 5 в фосфатному буфері ( 100% ), трохи нижче - в цитратно-фосфатному - 98,8%, в нітратному - 91% і зовсім низька - в ацетатному - всього 43%. Причому, зі зменшенням рН середовища зростає степінь інактивації каталази (рис .1.5.)



Рис.1.4. Вплив рН реакційного на стабільність каталази 1-при тривалості оброблення 15 хв 2-при тривалості оброблення 3 год;

Рис.1.5. Вплив рН на активність каталази P.vitale - 1 - фосфатний буфер; 2 - цитратно-фосфатний буфер; 3 ? цитратний буфер; 4? ацетатний буфер.

Незважаючи на порівняно високу термостабільність мікробної каталази, оптимальною температурою для дії її в процесах, що потребують миттєвого видалення перекисі водню, є 35 - 50єС. Яко дія каталази необхідна на протязі тривалого часу, то оптимальною є температура від 3 до 10єС.

Будучи ефективними каталізаторами різних процесів, ферменти повинні максимально знижувати величину енергії активації реакцій, що каталізуються ними. Аналіз різних препаратів каталази показує, що енергія активації реакції розкладання перекисі водню різна і залежить від типу каталізатора. Ця залежність приведена нижче.

Таблиця 1.1. Залежність енергії активації від каталізатора

Каталізатор	Енергія активації, кДж/моль
Реакція у водному розчині (без каталізатора)	75,0
Платинована платина	49,0
Каталаза з бичачої печінки	17,6
Каталаза з еритроцитів	7,1
Каталаза з дріжджів	19,3
Каталаза P. vitale Pidopl. et Bilai	6,1

Найменшою енергією активації володіють препарати з мікроскопічних грибів. Каталаза з дріжджів і печінки бика має енергію активації майже втричі більшу. Можна вважати, що каталаза з грибів найбільш ефективно каталізує реакцію розкладання перекисі водню [5].

Отже, каталаза, синтезована мікроорганізмами, володіє високою стійкістю до кислого середовища (рН опт 4-9), вона є більш термостабільною та безпечною, оскільки при її використанні не існує ризику передачі хвороб, властивих тваринам, каталаза із мікроорганізмів, а особливо грибів, найбільш ефективно каталізує реакцію розкладання перекисі водню, оскільки володіє найменшою енергією активації. Технологія виділення із культуральної рідини є досить простою.

1.3 Практичне використання

Препарати каталази широко застосовуються в тих випадках, коли потрібно повністю видалити перекис водню. Насамперед в м'ясній промисловості розроблений метод використання препарату каталази P.vitale для усунення залишків H2О2 після освітлення крові, темних технічних жирів, що є ефективним і економічно-вигідним прийомом, який дозволяє підвищити його сорт. Використання глюкооксидази з каталазою в якості антиоксиданту дає можливість збільшувати термін зберігання топленого свинячого жиру в герметичній упаковці при температурі 20-20єС на розсіяному світлі - до 24 місяців, яловичого при температурі 37єС - до 12 місяців, сприяє захисту від руйнування протягом вказаних термінів таких біологічно-цінних речовин, як лінолева, ліноленова і арахідонова жирні кислоти, а в яловичому жирі, крім цього, ще й каротиноїдів. Каталаза перешкоджає прогірканню ковбас при тривалому зберіганні. Оскільки внесення ферменту в готовий продукт не можливо, а на стадії приготування фаршу досить проблематично (в зв'язку з ймовірністю його інактивації під час копчення), доречно додавати бактеріальні добавки, що дозволяють рівномірно розподілити фермент по ковбасі.

В молочній промисловості каталазу використовують разом з пероксидом водню, що дозволяє виключити процес пастеризації, який проводиться з ціллю інактивації патогенної мікрофлори. В результаті пастеризації частково втрачаються природні ферменти молока. Пероксид водню в концентрації 0,2% - 0,3% від об'єму молока виконує функції дезинфікатора, суттєво не впливаючи на ферменти молока (ліпазу, протеазу, фосфатазу). Додавання каталази інактивує залишки пероксиду водню в молоці [3].

Препарат ефективний при відбілюванні хутра, тканин, в органічному синтезі, при стерилізації бактеріальних середовищ, а також для одержання дозованої кількості кисню, при виготовленні деяких пористих матеріалів, а також в наукових дослідженнях та моніторингах, де вивчають роль супероксиду та перекисі водню в тому чи іншому процесі. Перспективним є використання препарату разом з супероксиддисмутазою в медицині та косметології.

Каталазу (в комплексі з глюкозоксидазою) часто використовують у виноробстві, пивоварінні, консервній, соковій і безалкогольній промисловості для видалення кисню, що дозволяє підвищити стійкість продуктів до тривалого зберігання та збереження кольоровості продукту [10].

Розроблена та запатентована нова методика отримання кисню ферментативно-каталітичним шляхом. Винахід відноситься до екології, а саме до процесів підготовки газів для вдихання, і може бути використаний в приладах автономного забезпечення життєдіяльності, що використовується в медицині.

Відомий спосіб отримання кисню з перекисновмісних солей в присутності каталізаторів - оксидів чи солей металів Mn, Fe, K, Cu, Pb та ін. Отриманий згідно цього методу кисень охолоджують, очищують від твердих частин, знижують лужність. Вихід кисню при температурі 20 єС складає 1,6 л/хв.

Була поставлена задача підвищити виробіток методу при одночасній регуляції виходу кисню, а також спрощення процесу. Як наслідок, запропоновано ферментативне отримання кисню. Суть методу: здійснюють взаємодію грибної каталази штама гриба P.vitale 1312/140 в розчинній чи іммобілізованій формі з активністю 4000 Е/мг з перекисвмісною сполукою - 10-305 перекису водню при масовому співвідношенні H2O2 і каталази (500-150):1 або водний розчин перекісної солі рН 4,5-8,5 при співвідношенні солі каталази (2000-1250):1.

Новий спосіб відрізняється збільшенням виходу кисню до 2,5 л/хв, що 1,5 рази більше порівняно з базовим, при цьому можливо регулювати в часі вихід кисню в залежності від потреби - більший об'єм кисню (10 с) чи маленькі порції протягом тривалого часу (не менше 25 год); завдяки використанні іммобілізованої каталази можливе здійснення циклічного отримання кисню (не менше 55 циклів). Превагами також є простота реалізації за рахунок повного розкладання перекисі в одну стадію, а також завдяки використанні незначної кількості реактивів в реакції, рентабельність завдяки низьким енергозатратам (на відміну від базового методу) і використанні реактивів з малою собівартістю [17].

1.4 Визначення активності каталази

Метод заснований на титрометричному визначенні кількості розкладеної перекисі водню за визначений час. За одиницю активності каталази прийнято кількість ферменту, що каталізує розкладання 1 мкМ H2O2 (0,034 мг) за 1 хв.

Посуд: колби ємністю 50 мл, піпетки, градуйовані на 1,2 і 3 мл; мірний циліндр ємністю 1 л; мікробюретка на 5 мл.

Реактиви: 0,01 н. розчин перекисі водню в 0,006 М фосфатному буфері, рН 6,8; 5 н. розчин сірчаної кислоти; 10%-вий розчин йодистого калію; 1%-вий розчин крохмалю; 0,01 н. розчин тіосульфату натрію.

Послідовність визначення: в колби ємністю 50 мл наливають по 5 мл розведеної до необхідної концентрації культуральної рідини. Інкубують 3 хв на льоді, зупиняють реакцію додаванням 2 мл 5 н. розчину сірчаної кислоти. Далі в колби доливають по 2 мл 10%-вого розчину йодистого калію і по 1-2 каплі 1%-вого розчину йодистого калію і по 1-2 краплі 1%-вого розчину молібденово кислого амонію. Через 3 хв відтитровують йод, що виділився 0,01 н. розчином тіосульфату натрію.

В кінці титрування для чіткого фіксування кінцевої точки процесу додають в якості індикатора 1-2 каплі 1%-вого розчину крохмалю. Контролем служить проба, в яку замість культуральної рідини наливають дистильовану воду.

Виходячи з того що 1 мл 0,01 н. тіосульфату натрію відповідає 0,17 мг перекисі водню і знаючи різницю між його кількістю, що йде на титрування контрольної і дослідної проб, кількість розкладеної перекисі водню розраховують по формулі Х= (Vk - Vоп) · 0,17/0,5 · 0,034 · 3 = (Vk - Vоп) · 3,3 · Р, де Х - активність каталази в 1 мл вихідного розчину; Vk - кількість тіосульфату натрію, що пішла на титрування контрольної проби (мл); Vоп - кількість тіосульфату натрію, що пішла на титрування дослідної проби (мл); 0,17 - кількість H2O2 (мг), що відповідає 1 мл 0,01н. тіосульфату натрію; 0,034 - кількість H2O2 (мг), що відповідає 1 мнМ; 0,5 - кількість розведеної культуральної рідини в пробі; 3 - час інкубації (хв.); Р - фактор розведення.

Для точності аналізу різниця Vk - Vоп не повинна бути менше 1,1 і вище 2,3 мл. В першому випадку для аналізу беруть більше ферментного розчину, в другому - його розводять.

Кількісний аналіз каталази

Кількість каталази в тканині чи рідині можна визначити шляхом вимірювання або перекисі водню, розкладеного каталазою, або визначенням кількості кисню, що виділяється при цій реакції [2].

Розділ 2. Вибір біологічного агента

Джерелом ферменту каталаза є мікроскопічні гриби, що відносяться переважно до роду Penicillium, і значно рідше до роду Aspergillus. Серед пеніцилінових грибів найбільшою здатністю до позаклітинного синтезу ферменту володіють види: Penicillium chrisogenum, P.casei, P.nigricans, P.notatym, P.adametzi, P.cyaneofulvum, P.canescens, P.verruculosum і особливо Penicillium vitale Pidopl. Et Bilai [7]. Каталаза у великій кількості накопичується в міцелії Aspergillus niger (та ряду інших мікроорганізмів) в процесі ферментації, але головним чином внутрішньоклітинно, а в середовище виходить лише на початку автолізу клітин міцелію [1].

Розглянемо процеси синтезу цього ферменту грибами P. vitale, P.canescens, P.verruculosum.

Культивування грибів проводять на середовищі слідуючого складу (в г) : KNO3 - 8; K2HPO4 - 1; MgSO4x7H20 - 0.5; FeSO4x7H20 - середовища в одному літрі, при добавлянні цукру та кукурудзяного екстракту: для P. vitale - 6% цукру і 2% кукурудзяного екстракту; P.verruculosum - 8% цукру і 2% кукурудзяного екстракту; P.canescens - 6% цукру і 3% кукурудзяного екстракту. Інокулят готують із культур на русловому агарі місячного віку при посіві на середовище Билай з 4% цукру з мг/л ZnSO4 x5H20, культивування проводиться на протязі 48 год ,в ферментативне середовище вносять 15% інокулята. Тривалість ферментації становить 7 днів.

Визначення активності фермента проводять методом йодометричного титрування. Реакційна суміш містить 0,5мл культуральної рідини чи розчину ферменту; 5мл субстрату; реакцію проводять на протязі 3хв і зупиняють додаванням 2мл 20%-ної H2SO4. Потім добавляють 2мл 10%-ного розчину йодистого калію і 2-3 каплі 1%-ного розчину молібдену амонію, через 3хв титруванням визначають йод, що утворився (за допомогою розчину гіпосульфіта натрію). За одиницю активності приймають кількість ферменту, що розкладає 1мкмоль H2О2 (0,034 мг) за 1хв,при даних умовах в 0,006 М фосфатному буфері pH 6.8, температура-близько 00, час реакції 3хв.

Виділення каталази проводять шляхом адсорбції на гелі фосфату кальцію, pH8,0-8,6. Гомогенний препарат ферменту отримують шляхом осадження із концентрованого водного розчину ферменту сульфатом амонію. Кристалічний препарат отримують із розчину гомогенного препарату ферменту при додаванні сульфату амонію 59-60% насиченості, pH 5,7-7,6.

Каталаза із P. vitale є геміловим ферментом, по спектру відрізняється від каталаз тваринних і бактеріальних, високочутлива до ціаністого калію і азиду натрію, стійка до оксиду карбону. Каталази P. vitale , P.canescens і P.verruculosum має оптимум температури 60-650; при прогріванні на протязі 10хв при температурі 750 зберігає вихідну активність , при 800 і P.verruculosum зберігає до 75% активності, каталаза P.canescens -14%. При цьому слід відмітити, що термостабільність каталази P. vitale є характерною ознакою, що не змінюється за різних умов культивування. Фермент трьох вказаних видів грибів має максимум адсорбції в видимому світлі при 407, 480, 590,710 нм; ізоелектрична точка P.canescens при pH5,4, P.verruculosum - при pH3,8, P. vitale- при pH5,1.

Каталаза P. vitale має молекулярну масу 2459000, що є близькою до молекулярної маси каталаз тваринного походження, проте відмінна від них більшою константою седиментації (S20=13.8 x10-3 cек-1), константою дифузії [3].

Розроблено методи направленого культивування P. vitale для отримання каталази. Вони відбуваються у дві стадії на спеціально підібраних середовищах. Показано, що додавання в поживне середовище 0,6% NaCl і подвійного з'єднання сполук глюкози з NaCl в якості джерела карбону дозволяє провести біосинтез каталази в одну стадію без попереднього вирощування посівного матеріалу [2].

Отже, найбільш доцільно використовувати гриб P. vitale, як промисловий продуцент ферменту каталази, оскільки :

? каталаза P. vitale має молекулярну масу, що є близькою до молекулярної маси каталаз тваринного походження, проте відмінна від них більшою константою седиментації , константою дифузії.

? термостабільність каталази P. vitale є характерною ознакою, що не змінюється за різних умов культивування.

? іммобілізований різними способами фермент каталаза P. vitale в широкому діапазоні pH характеризується високою каталітичною ємністю, та більш тривалим терміном зберігання активності, порівняно з каталазою інших продуцентів. Препарат володіє низькою енергією активації [3].

? промислові препарати каталази P. vitale володіють високою активністю - 1 г препарату містить 4-8 млн. од. активності

? розроблено методи культивування P. vitale, що дозволяють провести біосинтез ферменту без попереднього вирощування посівного матеріалу. Це значно полегшує технологічний процес, зменшує витрати на поживне середовище, економить час [2].

? при співвідношенні джерела карбону до джерела азоту в межах 10:1 до 10:5 відбувається переважний синтез P. vitale каталази, глюкооксидаза утворюється в незначних кількостях.

Є ряд рекомендацій по використанню в якості продуцента A. niger. О.К.Кисляковою було розроблено метод отримання із глибинних і поверхневих культур A. niger 8 ряду препаратів, що володіють каталазною і глюкооксидазною активністю на основі реальних промислових середовищ. Продуцент накопичував внутрішньоклітинно ферменти протягом доби на середовищі, що містила 3-6%-вий розчин меляси, 0,2% нітрату натрію і близько 0,05% сірчанокислого амонію. Відділений міцелій висушували, потім ферменти екстрагувалися водою і осаджувалися ізопропіловим спиртом (3:1). Вихід препарату складає 3,8% сухої маси міцелію і містить до 70% білка. Такі препарати на 1-1,5 порядки менш активні, ніж препарати із P. vitale [7].

Розділ 3. Характеристика біологічного агента

Типова культура Penicillium vitale Pidoplichko et Bilai apud Bilai 1961 ВКМ F-3624, єдиний представник виду P. vitale, індифікований в Інституті вірусології ім.. Д.К. Заболотного АН УССР. З 1950 р. культура використовувалась для отримання рідкого препарату Мікроцида, якому властиві антибіотичні властивості, а в подальшому для отримання ферменту глюкозооксидози. Пізніше із культуральної рідини гриба стали отримувати каталазу ? гемвмісний фермент, що розкладає перекис водню [4].

3.1 Морфолого-культуральні ознаки

Міцелій добре розвинутий, септований. Колонії ростуть повільно, спочатку білі, потім зелено-голубі, бархатні, дрібно пухнасті, вкриті жовтуватими дрібними каплями, зі складками, досить широким білим краєм, з часом набувають брудно-сірого кольору. Зі зворотної сторони колонії спочатку солом'яно-жовті, потім жовто-коричневі. Діаметр колоній 17 - 20 мм за 7 діб. Пігмент в середовище не виділяється (рис. 3.1).

Рис.3.1. P. vitale [16].

Конідієносці 250-300 х 2-3,5 мкм, з одномутовчастою чи двоярусною кісточкою. Вітки більшої частини 10-15 х 2-3 мкм , фіаліди бутильчасті 6-8 х 2-3,5 мкм. Конідії еліптичні, часто яйцевидні, з віком можуть бути майже кулеподібними, 2,5-3 х 2-2,5 мкм [2, 4].

3.2 Фізіолого-біохімічні ознаки

Поживне середовище:

Ензиматичні дослідження показали, що у гриба P. vitale - промислового продуцента ферменту каталаза, катаболізм ростового субстрату здійснюється за гліколітичним шляхом (шлях Ембдена-Мейєргофа-Парнаса), про що свідчить висока активність ключового ферменту фосфофруктокінази. Наявність 2-оксоглутаратдегідрогеназної активності свідчить про повноцінне функціювання циклу трикарбонових кислот. Пентозофосфатний цикл служить постачальником НАДФН для реакцій конструктивного метаболізму і рибози, для синтезу нуклеотидів [2].

Встановлено, що P.vitale інвертує сахарозу та глюкозу в високих концентраціях, але з невеликою швидкістю. При добавлянні суміші мікроелементів в середовище відбувається пригнічення активності інвертази. Використання вищих цукрів та полісахаридів іде через гідроліз їх до гексоз, що відбувається під дією відповідних ферментів (амілаза, цитраза та інш.). Використання вуглеводів як джерела карбону, часто супроводжується кислотним бродінням.

P. vitale добре використовує як джерело нітрогену білки, які при цьому піддаються гідролізу (протеолітичні ферменти). Серед інших джерел азоту можна вказати амінокислоти (наприклад аспарагін), і особливо солі амонію та нітрати.

Крім карбону та нітрогену потрібні ще наступні елементи: Р (фосфати), S (сульфати), К, Mg, Fe, Zn. Також потрібні мікроелементи [8].

Мікроелементи відіграють важливе значення в обміні речовин грибної клітини, приймаючи участь в ферментативних реакціях синтезу нуклеїнових кислот, в азотному обміні, гліколізі, окисно-відновних реакціях та ін. Завдяки поліфункціональності мікроелементів, їм належить важливе значення в живленні грибів.

В дослідженні впливу мікроелементів на ріст P. vitale було встановлено впливу певних мікроелементів і їх суміші на кислотність поживного середовища (рН), активність глюкозооксидази, каталази та інвертази в культуральній рідині P. vitale , а також утворення в середовищі ФАД-флавінаденіндинуклеотида, що входить до складу молекул глюкозооксидози та коферментних вітамінів.

Робота проведена при глибинному культивуванні P. vitale на качалках зі швидкістю 240 об./хв. при t 26-270 С. Для посіву використовували промиті конідії гриба, вирощеного на агаризованому середовищі, з розрахунку 3х106 в 1мл середовища або 43-годинний інокулят, вирощений на середовищі Білай з 6% сахарози, з розрахунку 5% посівного матеріалу до об'єму ферментаційного середовища. Качалочні колби ємністю 750 мл містили по 150 мл відповідного ферментаційного середовища.

Суміш мікроелементів готували по Бору (г/л): КН2РО4-1,5;Mg Cl2x6H20 - 0,4; MnSO4 x7H20-0.08; Fe SO4 -1,00; СuSO4 x5H20-0.40; ZnSO4 x7H20-8.80; Co(NO3)2-0.10; (NH4)2 MoО4 -0.30; H3 BO4 -0,06. Дану суміш додавали в середовища в концентрації відповідно до пропису Борроу.

При вивченні дії суміші мікроелементів на ріст і ферментативну активність P.vitale було встановлено, що додавання суміші мікроелементів в середовище після 24 год ферментації сприяло збільшенню біомаси гриба в 2-3 рази порівняно з контролем (контроль: середовище Чапека, або Білай з 2% та 8% глюкози відповідно, без внесення мікроелементів)

Досліди з використанням окремих мікроелементів показали, що інтенсивність росту гриба зумовлена головним чином цинком і в меншій мірі кобальтом. Додавання 1, 5, 10 мл суміш мікроелементів пригнічувало накопичення в середовищі глюкозооксидози в 2-3 рази, інвертази в 2-50 раз, і незначно ФАД, порівняно з контролем. Активність каталази зростала з 1-3 од/мл до 300-500 од/мл. Антимікробна активність культуральної рідини при додавання суміші мікроелементів повністю інгібувалась (контроль- висока активність).

Внесення в середовище катіонів Мn+; Cu+; Co; Fe+; BO4- викликали підвищення глюкозооксидазної активності, прискорило накопичення ФАД в середовищі.

Із перевірених іонів металів марганець спонукав до накопичення в культуральній рідині P.vitale глюкозооксидози, ФАД та інвертази .Цинк стимулював ріст P.vitale і каталазну активність, проте інгібував утворення глюкозооксидози та ФАД в культуральній рідині. Відмічена також пряма залежність між ростом гриба та накопичення каталази в середовищі, що свідчить по те, що виділення екзоензима пов'язано з синтезом білка ферменту, а не з автолізом клітини [10].

Також було показано, що утворення коферментних вітамінів (рибофлавін, піридоксин, нікотинова та пантотенова кислота ) P.vitale залежить від складу поживного середовища та умов культивування. Ці вітаміни були виявлені як в міцелії, так і в культуральній рідині гриба.

Внутрішньоклітинні коферментні вітаміни є будівельним матеріалом для синтезу коферментів і ферментів, що забезпечують біосинтетичні процеси в клітині. Вміст коферментних вітамінів при вирощуванні гриба по "каталазному " циклі вища, ніж при вирощуванні його по "глюкозооксидазном" циклі.

За вмістом вітамінів в міцелії і культуральній рідині P.vitale не поступається багатьом іншим мікроорганізмам [4].

P.vitale є хемоорганогетеротрофом.

Кислотність середовища:

Як і більшість інших грибів P. vitale віддає перевагу кислому середовищу. Необхідно відмітити, що утворення глюкозооксидази супроводжується підкисленням середовища до рН 3,0-3,2, в той час на середовищах з сумішшю мікроелементів чи з додаванням одного цинку рН середовища зміщається в сторону основи, що стимулює синтез каталази .

Відношення до кисню та води:

По відношенню до кисню P. vitale аероб. В зв'язку з аеробністю міцелій розвивається переважно у верхніх шарах субстрату і не проникає в його глибину. цей факт тісно пов'язаний з відношенням до води. Необхідність у воді в P. vitale взагалі дуже висока, але насичення водою пористого субстрату (наприклад розвареного зерна) небажане, тому що при цьому повітря витісняється із пор і всередині створюються анаеробні умови. При меншому насиченні гриб проникає глибше і тримається довше на такому субстраті [8].

Температура:

Minimum становить 1-50 , maximum 350 , optimum 250 . При температурі 370 ріст відсутній.

Світло:

Світло не має особливого значення. Розвиток спостерігається як в темноті, так і на розсіяному світлі [4,8].

Розмноження:

Характерні способи розмноження - вегетативне та безстатеве розмноження конідіями. Статевого процесу немає, або він не виявлений [11].

3.3 Таксонономічне положення

P. vitale належить до вищих грибів, оскільки має септований міцелій.

Є пеніциліновим грибом ( рід Penicillium ).

Рід Penicillium раніше розглядали як представника класу аскоміцетів так і класу дейтероміцетів. За даними молекулярно-біологічних і генетичних досліджень, недосконалі гриби (Deuteromucetes) не є самостійною таксономічною групою. Ними або втрачена статева стадія, або вони є анаморфами інших груп грибів (найймовірніше класів Ascomycetes та Basidiomucetes). У зв'язку з цим, дейтероміцети повинні бути розміщені у відповідних класах грибів [11].

Класифікаційна схема грибів і таксономічне положення головних родів по Cl.Moreau (1978р) визначає таке положення гриба P. vitale у систематиці:

Царство-гриби (Fungi);

Відділ -базидіальні ( Basidiomucetes);

Клас-дейтероміцети ( Deuteromucetes);

Порядок-гіфальні (Hiphales );

Сімейство-Phialosporaceae;

Рід- Penicillium [2].

Згідно з системою класифікації Т. Кавалір-Сміта (1998р.) рід Penicillium входить до класу Plectomycetes - дейтероміцети, відділу Ascomucota, підцарство Neomycota, царство - Fungi [11].

Оскільки типова культура даного виду до останнього часу була недоступна для зарубіжних мікологів і вони були змушені використовувати лише короткий авторський опис культури, в основних монографіях по роду Penicillium вид P.vitale переведений в синонім виду Penicillum janthinellum Biourge, описання якого досить близьке. При дослідженні типової культури P.vitale було доведено, що по швидкості росту, розміру філліад і формі конідій культура P.vitale відрізняється від P. Janthinellum. Крім того, на противагу останній, що росте при 370С, у типової культури P.vitale при цій температурі ріст повністю відсутній [4,15].

Отже, згідно сучасної класифікації (http://www.mycobank.org/) P.vitale займає таке таксономічне положення: Eukaryota > Fungi > Dikarya > Ascomycota > Pezizomycotina > Eurotiomycetes > Eurotiomycetidae > Eurotiales > Trichocomaceae> mitosporic Trichocomaceae > Penicillium [13].

Розділ 4. Вибір поживного середовища для вирощування біологічного агента

Каталазу можна отримувати у вигляді високоочищеного гомогенного кристалічного препарату або в суміші з глюкозооксидозою. В першому та другому випадку в якості продуцента використовується мікроскопічний гриб роду Penicillium, вид Penicillium vitale, який вирощується глибинним способом. Від складу поживного середовища залежить здатність мікроорганізму утворювати каталазу чи глюкооксидазу, або обидва ферменти одночасно. Найбільше значення має відношення вуглеводу і азоту, рН середовища і сумарна кількість сухої речовини в середовищі. На середовищах, бідних на джерело вуглецю, але за умови високого вмісту КNO3, синтезується переважно каталаза і практично не утворюється глюкозооксидоза. Так, в лабораторних умовах було встановлено, що при відношенні джерела вуглеводню в середовищі (глюкоза або сахароза) до джерела азоту (КNO3) в межах від 10:1 до 10:5 спостерігається переважний синтез P. vitale каталази, а глюкооксидаза утворюється в мізерних кількостях [4].

Глибинне культивування P. vitale включає декілька стадій:

1) підготовка посівного матеріалу,

2) вирощування вегетативного посівного матеріалу (інокулята),

3) безпосередньо ферментація.

4.1 Зберігання музейної культури біологічного агента

Конідії гриба P. vitale зберігають у флаконах разом з сухим стерильним чорноземним ґрунтом чи в культурі на агарі в пробірках або матрацах, які пересівають раз в 6 місяців. Конідії гриба добре зберігаються і в спеціальних флаконах об'ємом 250 мл після вирощування на пшоні і наступному ліофільному сушінні.

4.2 Підготовка посівного матеріалу

Посівний матеріал гриба готують двома способами: вирощування продуцента на просі і на пшениці. Спочатку конідії висівають на сусловий агар, розлитий в пробірки чи матраци і інкубують при температурі 25єС протягом 30-40 днів. Після перевірки на чистоту посіву (макроскопічної, а в разі необхідності - мікроскопічної) отриману культуру вносять на стерилізоване пшоно або просо.

Підготовка посівного матеріалу P. vitale на просі

В пробірки 20х2 см вносять 8-10 г чистого сухого проса, закривають їх ватними пробками і стерилізують їх в автоклаві при тиску в 2 атм (134 є С) протягом 20 хв. Сухе просо стерилізують двічі з інтервалом в 20-24 години. Після другої стерилізації в пробірки додають стерильну водопровідну воду (60% - 80% маси проса) і знову стерилізують. Відразу після останньої стерилізації пробірки з просом струшують, охолоджують і засівають наважкою конідій в середовище Білай. В кожну пробірку вносять по 1 мл наважки конідій при концентрації їх в середовищі 2х106 в 1 мл. Посів конідій можна проводити шляхом зскрібання їх з агаризованої культури.

Гриб вирощують при температурі 24-25є С протягом 1 місяця. Отриманий посівний матеріал надалі зберігають при кімнатній температурі в сухому місці до посіву. Термін придатності культури 1 рік.

Підготовка посівного матеріалу P. vitale на пшоні

Для отримання посівного матеріалу використовують пшоно вищого або першого сорту (попередньо визначають його вологість). Цільні зерна пшона поміщують в киплячу водопровідну воду (відношення води і пшона 1:1 на суху масу) і варять при перемішуванні протягом 15-20 хв. Напіврозвалене зерно залишають на 15-20 хв в теплій упаковці, а потім переносять на пергаментний папір для застигання і на фільтрувальний папір для підсушування. В спеціальні флакони об'ємом 250 мл переносять по 10-15 г із розрахунку на суху масу пшона. Флакони закривають ватними пробками, марлевими і пергаментними ковпачками і стерилізують текучим паром (температура 100є С) протягом 30 хв, потім температуру підвищують і стерилізують при тиску 1 атм ще 30 хв. Після стерилізації пшоно охолоджують, струшують і повторно стерилізують в тому ж режимі через 20 год.

Для засіву готового середовища можна використовувати наважку конідій 1-2-місячної культури, вирощеної на сусловому агарі, або суспензію конідій стандартного посівного матеріалу, для чого в матрац чи флакон додають стерильну водопровідну воду з розрахунку, щоб отримана суспензія містила (2-3) х 105 конідій в 1 мл. Для засіву середовища беруть 0,5-1 мл суспензії на флакон.

Після засіву конідій флакон закривають ватною пробкою, струшують для рівномірного розподілення культури в поживному субстраті і поміщають в термостат на 7-10 діб (24-25є С) до отримання хорошого рівномірного росту і спороносіння. Під час росту культуру періодично струшують.

Культуру, що виросла, піддають неперервному вакуумному сушінню при температурі не вище 28є С протягом 48-72 год до досягнення постійної маси. Зменшення вологовмісту визначають щодоби зважуванням. Після висушування горло флакона з посівним матеріалом парафінують і покривають пергаментним ковпачком. До кожного флакону додається етикетка, на якій вказується назва назва штаму, номер паспорту і партії, дата випуску, термін придатності. Приготований таким чином посівний матеріал зберігають при кімнатній температурі і нормальній вологості. Термін придатності посівного матеріалу - 1рік з моменту посіву конідій на субстрат.

Посівний матеріал Penicillium vitale Pidoplichko et Bilai apud Bilai має вигляд крупинок зеленого кольору, що вільно переміщаються при струшуванні флакона. У флаконі міститься близько 10-15 млрд. конідій. Проростання конідій повинно бути не менше 80%. Його визначають шляхом вирощування гриба в колбах об'ємом 0,75 л, що містять 120 мл середовища Білай, після 12-15 год ферментації на качалках при 240 об/хв., підраховуючи в рахувальній камері кількість клітин і виражають в процентах.

В посівному матеріалі стороння мікрофлора повинна бути відсутня. Чистоту посівного матеріалу перевіряють засівом на бульйон і агар Хоттінгера чи МПА і МПБ з 0,5% глюкози і інкубацією при температурі 37є С до 4 діб. Для виключення забруднення дріжджами чи іншими грибами його висівають на сусловий агар або середовище Чапека і інкубують при температурі 25 і 37 є С не менше 5 діб.

Морфологія, характерна для даного штама: колонії на агарі Чапека з сахарозою спочатку білі, потім зелено-голубі, бархатні, покриті жовтими дрібними краплями, складчасті, з досить широким білим краєм, що надалі набувають брудно-сірого відтінку. Зворотна сторона колонії спочатку солом'яно-жовта, потім жовто-коричнева. Агар забарвлюється в зеленуватий колір.

Активність посівного матеріалу визначають контрольною ферментацією по регламенту. Для цього 2% флаконів із партії посівноо матеріалу піддають ферментації (після 43-46 год ферментації в колбах ємністю 0.75 л, що містять 200 мл середовища, рН інокулята складає 6,8-7,5, глюкозооксидазна активність відсутня, каталазна активність досягає 45-50 од/ мл). При засіві культурою ферментаційного середовища Білай із розрахунку 4-6% після 72 год ферментації при інших оптимальних умовах культивування, рН культуральної рідини складає не менше 3,4-3,6, глюкооксидазна активність 40-50 од/мл і вище, каталазна активність 4-12 од/мл.

Розроблена схема ведення культури P. vitale - продуцента глюкооксидази і каталази дозволяє тривалий час зберігати досягнений рівень її ферментативної активності не лише в лабораторних, але і в промислових умовах.

4.3 Культивування з барботажем через середовище повітря і механічним перемішуванням

Цей метод передбачає використання ферментерів різних конструкцій і об'ємів, з перемішуючими приладами (мішалками) різних типів, різноманітними способами подачі повітря і наявністю регулюючих приладів, що дозволяють слідкувати за ходом ферментаційного процесу.

Етап підготовки посівної культури описаний вище. Слідуючі етапи глибинного культивування: вирощування вегетативного посівного матеріалу, безпосередньо ферментація.

Першу генерацію вегетативної культури (5-10% об'єму середовища) переносять в лабораторний ферментер і весь процес ферментації в залежності від режиму культивування закінчується протягом 72-120 год. Цей варіант зазвичай використовують у напівпромислових умовах.

Першу генерацію вегетативної культури знову переносять в колби Ерленмейера для отримання другої вегетативної генерації. Після певного періоду вирощування (по досягнення необхідної степені росту) вегетативну культуру переносять в інокулятор чи посівний апарат. Із посівного апарату культура, що виросла надходить в ферментер. В промислових умовах інокулятори містять декілька десятків літрів поживного середовища, посівні апарати - від декількох сот до декількох тисяч літрів поживного середовища, ферментери - до десятки тисяч літрів ферментаційного середовища.

Середовище для отримання інокулята культури P. vitale:

Середовище перше: цукор - 2 г/л, КNO3 - 0,6 г/л, кукурудзяний екстракт - 0,6 г/л (по сухій масі ); рН 4,0- 4,2.

Колби ємністю 750 мл, що містять 200 мл середовища, засівають наважкою спор гриба із розрахунку (0,6-1,2) х 106 конідій на 1 мл поживного середовища. Для посіву використовують 4-8-місячну культуру. Колби поміщують на качалку (240-260 об/хв.); температура культивування 26-28є С, тривалість - 36-44 год. Рівень рН зростає до 6,8-7,5. Глюкооксидазна активність відсутня, активність каталази 40-50 од/мл.

Середовище для ведення процесу ферментації:

Середовеще друге: цукор - 8г/л, КNO3 - 0,8 г/л, КН2РО4 - 0,01 г/л, КСl - 0,05г/л, МgSO4 - 0.05 г/л, FeSO4 - 0.001 г/л; рН 6,2 - 6,6.

Стерильне ферментаційне середовище засівають вегетативним посівним матеріалом (4-8% об'єму середовища). Ферментація відбувається при 26-30є С, тиск 0,2-0,3 атм, неперервне перемішування середовища мішалкою з швидкістю 270-280 об/хв. протягом 72-96 год. Середовище аерують диференційованою подачею повітря в ферментер по схемі, приведеній в табл. 4.1.

Таблиця 4.1 Режим аерації в динаміці ферментації P. vitale

Тривалість ферментації, год	Відношення об'єму повітря до середовища (за 1 хв )
1 - 6 6 ? 12 18 - 24 24 ? 36 36 ? 48 48 ? 64 64 ? до закінчення процесу	1,5:1 2,2:1 2,0:1 1,7:1 2,0:1 2,2:1 2,5:1

Склад отриманої культуральної рідини: 80-100од/мл глюкооксидази; 80-200 од/мл каталази; 1,5-2,2 г/100 мл середовища сахарів (фруктоза); 1,5-2,2 г/100 мл середовища глюконової кислоти; рН 3,8-4,1.

При промисловому отриманні глюкооксидази наважку спор гриба вносять в інокулятор, що вміщує до 200 л поживного середовища (коефіцієнт заповнення 0,6). Щільність посіву (0,6-1,2) х 106 конідій на 1 мл поживного середовища. Температура вирощування 26-28є С, тиск 0,2-0,3 атм. Аерацію здійснюють із розрахунку 1 об'єм повітря на 1 об'єм середовища в хвилину при неперервному перемішуванні середовища мішалкою зі швидкістю 270-280 об/хв. протягом 36-44 год. Для отримання великої кількості посівного матеріалу культуру, вирощену в інокуляторі, переносять в посівний апарат об'ємом 1-5 м3 на середовище аналогічного складу. Після культивування протягом 20-24 год при 26-28є С, тиску 0,2-0,3 атм і аерації середовища з розрахунку 1 об'єм повітря на 1 об'єм середовища в хвилину посівний матеріал переносять в ферментер [2].

Розроблено методи направленого культивування P. vitale для отримання каталази. Вони відбуваються у дві стадії на спеціально підібраних середовищах. Показано, що додавання в поживне середовище 0,6 г/л NaCl і подвійного з'єднання сполук глюкози з NaCl в якості джерела карбону дозволяє провести біосинтез каталази в одну стадію без попереднього вирощування посівного матеріалу.

Піногасник - соняшникова олія: перша порція (0,05-0,1% об'єму середовища) задається одночасно з посівним матеріалом, наступні порції (0,05%) вводять по мірі утворення піни в середовищі. При цьому використовують ферментер з співвідношенням діаметра і висоти 1:2,3, двох'ярусну восьмилопатеву мішалку (280 об/хв.) з чотирма відбійниками, встановленими на 2/3 висоти апарату [3].

4.4 Метод направленого культивування P. vitale для підвищення виходу каталази

Суть методики дослідження: гриб P. vitale вирощували глибинним способом при температурі 24-25 є С протягом 88-96 год при наступному режимі аерації: з моменту засіву спорового матеріалу до 48 год ферментації подають 1 об'єм повітря на 1 об'єм середовища (1:1) в 1 хв, з 48 до 72 год - 1,5:1,0, потім до кінця процесу - 1:1 в 1 хв.

В якості контрольного середовища використовували середовище наступного складу: цукор - 4 г/л; натрій азотнокислий - 0,8 г/л; кукурудзяний екстракт - 0,5г/л; сірчанокислий магній - 0,05; фосфорнокислий калій (одно заміщений) - 0,05г/л.