Изменение уровня никотинамидных нуклеотидов в печени крыс под влиянием летучих компонентов эпоксидной смолы ЭД 20

Изменение уровня никотинамидных нуклеотидов в печени крыс под влиянием летучих компонентов эпоксидной смолы ЭД_20

В ранее проведенных нами исследованиях изучено состояние окислительно-антиоксидантного гомеостаза организма при острой интоксикации летучими компонентами эпоксидной смолы (ЭС) ЭД_20 [1, 2, 3]. В то же время известно, что никотинамидные нуклеотиды в присутствии глутатиона и других SH_содержащих соединений способны стимулировать разложение гидроперекисей липидов и усиливать антиоксидантный статус организма. Доказана также тесная взаимосвязь между реакциями перекисного окисления липидов и компонентами НАДФН-специфической цепи переноса электронов [4]. Кроме этого, эти соединения играют важную роль в метаболизме ксенобиотиков, являются коферментами целого ряда дегидрогеназ, участвуют в энергетическом и пластическом обменах. Так, инактивирование и связывание ксенобиотиков осуществляются при участии НАДФ в системе микросомальных ферментов путем реакций ацетилирования, декарбоксилирования, гидроксилирования, образования глюкуронидов и др. Переходы НАД <=> НАДН, НАДФ <=> НАДФН существенны для редокс-свойств клеток и регулируют основные внутриклеточные метаболические процессы [5]. При различных заболеваниях, интоксикациях, отравлениях химическими соединениями, других патологических процессах происходят значительные нарушения в системе именно никотинамидных нуклеотидов, что не может не отразиться на тех многочисленных процессах в организме, в регуляции которых участвуют эти коферменты [5, 6]. Роль никотинамидных коферментов в токсикологии и механизме действия ЭС до настоящего времени не изучена.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния летучих компонентов ЭС ЭД_20 на содержание в печени животных окисленных и восстановленных форм никотинамидадениндинуклеотидов (НАД+НАДН и НАДФ+НАДФН).

Опыты проводились на белых крысах - самцах линии Вистар массой 180-230 г. Острое токсическое поражение печени вызывали путем однократного 4 часового ингаляционного динамического воздействия летучими компонентами ЭС ЭД_20 в концентрации, составляющей 1/3 LC₅₀ по ЭХГ (120-140 мг/м³).

Ингаляционная затравка осуществлялась в смонтированной по методу А.П. Яворовского [7] в нашей модификации установке, включавшей компрессор, паронасыщающую камеру, затравочную камеру, воздуховоды, терморегулятор, реометры, поглотители с пористой пластинкой и другое вспомогательное оборудование. Перед подачей в паронасыщающую камеру воздух предварительно очищался за счет прохождения через патрон, заполненный активированным углем. Паронасыщающая камера представляла собой колбу из термостойкого стекла или бутыль, частично заполнявшуюся ЭС ЭД_20 и закрывавшуюся резиновой пробкой с отверстиями, через которые проходили 2 патрубка (длинный - для подачи воздуха в толщу слоя ЭС; короткий - для вывода воздуха из верхней части паронасыщающей камеры в затравочную камеру). При этом оголовок длинного патрубка, погружавшийся в ЭС, залитую в паронасыщающую камеру, снабжался воронкой с микропористой стеклянной пластинкой [7] либо вибрирующим пористым элементом [8], дробившим струю подаваемого воздуха на части и обеспечивавшим более интенсивный барботаж. Для усиления насыщения воздуха парами ЭС применялось также разработанное нами распыляющее устройство [9], а также испаритель компонентов ЭС с непрерывной подачей вещества [10].

Насыщенный летучими веществами воздух подавался в течение 4 часов в верхнюю часть 14_литровой затравочной камеры, смонтированной из двух эксикаторов, и, проходя через зону дыхания животных, удалялся из нижней ее части при помощи вытяжной вентиляционной установки.

Режим воздухообмена подбирался таким образом, чтобы в затравочной камере создавалось незначительное разрежение, фиксируемое при помощи вмонтированного в нее водяного манометра.

Навески ЭС ЭД_20, создававшие в камере эффективные концентрации летучих композиций, подбирали опытным путем и нагревали в паронасыщающей камере до температуры 90-100⁰С. В качестве ведущего и характерного компонента летучих комплексов ЭС ЭД_20 был принят эпихлоргидрин (ЭХГ). Это соединение является постоянным, наиболее токсичным компонентом летучих комплексов ЭС ЭД_20, выделяется в воздушную среду пропорционально другим сопутствующим веществам и специфически характеризует ЭС [11]. Все затравки проводились натощак, в одно и то же время суток - в 10 часов утра.

Суммарное содержание окисленных (НАД+НАДФ) и восстановленных (НАДН+НАДФН) форм никотинамидных коферментов определяли в гомогенате печени флюориметрическим методом [12] и выражали в мкмоль/кг влажной ткани, а их отношение выражали коэффициентом. Метод основан на свойстве N_метилникотинамида, а также НАД и НАДФ образовывать при обработке ацетоном стабильные флуорисцирующие соединения, количество которых определяется флюориметрически. Стандартом служил раствор N_метилникотинамида в концентрации 5 мкг/мл. Пробы печени для исследования забирали через 12, 24, 72 и 120 часов после окончания ингаляционного воздействия летучими компонентами ЭС ЭД_20.

Полученные в эксперименте результаты обрабатывали статистически общеизвестным методом (t критерий Стьюдента) с помощью программы Microsoft Excel_97 для Windows [13].

Результаты исследований по определению содержания никотинамидных коферментов в печени крыс в динамике после острой ингаляционной интоксикации ЭС ЭД_20 представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Содержание никотинамидных коферментов в печени животных в условиях острой динамической ингаляционной интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД_20 (n=6-8)

Установлено, что при острой динамической ингаляционной интоксикации ЭС ЭД_20 происходит существенное снижение уровня окисленных форм никотинамидных коферментов в печени во все изучаемые сроки эксперимента (р<0,001). При этом уже через 12 часов после затравки животных уровень НАД+НАДФ в сравнении с группой интактных крыс снижается на 20%. В дальнейшем можно проследить монотонное снижение данного показателя, который к концу третьих суток составляет лишь 65% от исходных величин. К концу пятых суток эксперимента уровень окисленных форм никотинамидных коферментов имеет тенденцию к увеличению, хотя и остается достоверно ниже, чем у интактных крыс, на 21%.

Иная картина отмечается при изучении в печени крыс в условиях острой ингаляционной интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД_20 содержания никотинамидных коферментов в восстановленной форме.

Обнаружено, что в первые 12 часов наблюдения уровень НАДН+НАДФН в изучаемых условиях эксперимента не претерпевает каких-либо значимых изменений, и только лишь к концу третьих суток исследования выявляется достоверное снижение содержания никотинамидных коферментов в восстановленной форме. Однако уже к пятым суткам исследования изучаемый показатель возвращается к величинам, регистрируемым у интактных крыс.

Полученные в этом фрагменте результаты свидетельствуют о том, что окисленная форма НАД теряется, по-видимому, значительно легче, чем восстановленная. Это обусловлено, скорее всего, наличием более прочной связи между НАДН и дегидрогеназами или флавопротеидами, играющими роль промежуточных звеньев в цепи окисления, сопряженного с фосфорилированием [5].

Весьма информативные данные получены при определении суммарного количества никотинамидных нуклеотидов в изучаемых условиях эксперимента. Как следует из таблицы, суммарное содержание коферментов (НАД+НАДФ+НАДН+НАДФН) в печени отравленных ЭС животных изменяется пропорционально и однонаправленно с вышеописанными изменениями уровня их окисленных форм. Об этом могут свидетельствовать цифры, указывающие, что данный показатель достоверно меньше величин, регистрируемых у интактных крыс через 12 и 24 часа, на 11 и 15%, а через 72 и 120 часов, - на 23 и 13% соответственно. Максимальное снижение суммы нуклеотидов регистрируется через 72 часа наблюдения и составляет 77% от показателей в интактной группе крыс. И хотя к концу пятых суток наблюдения имеющиеся различия с исходными величинами и сохраняют достоверный характер, все же отмечается тенденция к восстановлению суммарного количества никотинамидных нуклеотидов в печени отравленных животных.

Исходя из этого, представляется возможным предположить наличие существенных сдвигов в дыхательной цепи и определенное напряжение в состоянии и поддержании энергетического гомеостаза в гепатоцитах у животных при отравлении летучими компонентами ЭС.

Учитывая энергетическое состояние гепатоцитов у животных в условиях острой динамической ингаляционной интоксикации ЭС ЭД_20, особый интерес представляло определение соотношения (НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН), характеризующего суммарное окислительно-восстановительное состояние пула никотинамидных коферментов в клетках печени. Показано, что в условиях острой интоксикации крыс ЭС величина этого соотношения достоверно снижается на 17-28% во все сроки наблюдения по сравнению с интактными животными. Минимальные значения изучаемого интегрального показателя, составляющие 72% от исходных величин, зафиксированы на 72_м часу эксперимента.

Оценка соотношения (НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН), которое является весьма чувствительным индикатором метаболического состояния клеток печени, позволяет сделать заключение о том, что при остром отравлении летучими компонентами ЭС существенно нарушается функционирование прежде всего митохондриальной электрон-транспортной цепи гепатоцитов, что требует соответствующей фармакологической коррекции. В то же время, учитывая роль никотинамидных коферментов как компонентов микросомальной электронтранспортной цепи, можно высказать предположение о возможном нарушении при данном патологическом состоянии процессов детоксикации.

Уменьшение коэффициента, характеризующего отношение окисленных форм к восстановленным при острой динамической интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД_20, вероятно связано с нарушением транспорта электронов и протонов в дыхательной цепи. По аналогии с другими патологическими процессами возможно происходит дискорреляция редокс-соотношения с преобладающим падением уровня окисленных форм, отражающих нарушения в цепи тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования и окислительно-восстановительного потенциала клетки [5].

По-видимому, уменьшение под влиянием летучих компонентов ЭС ЭД_20 соотношения (НАД+НАДФ)/(НАДН+НАДФН) при мало изменяющейся концентрации в печени НАДН+НАДФН и ранее доказанной высокой эффективности флавината, но низкой - никотинамида в условиях острой смертельной интоксикации одним из наиболее опасных летучих компонентов ЭС - ЭХГ [14] свидетельствует о том, что один из участков торможения находится, как и в случае с барбамилом, в «низко» расположенных звеньях цепи переноса электронов на уровне флавопротеидов, переносящих электроны от НАДН на КоQ [15]. Однако в отличие от барбамила, избирательно ингибирующего окисление тех субстратов, которые взаимодействуют с дыхательной цепью через НАД-зависимые дегидрогеназы, и не влияющего на окисление таких субстратов, как сукцинат, алифатический ацил КоА и -глицерофосфат, которые отдают свои электроны непосредственно флавопротеидам [15], летучие компоненты ЭС ЭД_20, на наш взгляд, особенно ЭХГ, вероятно, тормозят на уровне флавопротеидов, помимо основного, и боковой путь окисления субстратов, о чем свидетельствует высокая эффективность флавината. И наконец, следует сказать, что в нарушении обмена никотинамидных коферментов в печени при токсическом действии летучих компонентов ЭС ЭД_20 важное значение имеет изменение ультраструктуры митохондрий, которое характеризуется признаками явной деструкции, сильно набухшим матриксом, деградацией крист, нарушением целостности наружной мембраны [16] и может приводить к вымыванию никотинамидных ферментов из митохондрий.

ВЫВОДЫ

Таким образом, результаты выполненных исследований свидетельствуют о том, что в механизме развития острой интоксикации летучими компонентами ЭС важная роль принадлежит снижению пула никотинамидных коферментов преимущественно за счет окисленных форм и уменьшению соотношения окисленных к восстановленным формам. Это, по-видимому, связано с функциональными нарушениями в дыхательной и детоксицирующей электронтранспортных цепях, системе акцептирования и передачи водорода и ведет к замедлению скорости протекания окислительно-восстановительных реакций.

Список литературы

1. Высоцкий И.Ю., Качанова А.А., Высоцкий В.И. Перекисное окисление липидов при острой интоксикации летучими компонентами эпоксидных смол и его фармакологическая коррекция // Вісник СумДУ. - 2003. - №7 (53). - С. 32-40.

2. Высоцкий И.Ю. Функциональная активность антиоксидантной системы организма в условиях острой токсической гепатопатии индуцированной эпоксидами, на фоне применения фармакотерапевтических средств // Український медичний альманах. - 2003. - Т. 6, №6 (додаток). - С. 17-21.

3. Высоцкий И.Ю., Гребеник Л.И. Лекарственная регуляция тиол-дисульфидного обмена в печени животных при сотрой токсической гепатопатии // Український медичний альманах. - 2003. - Т. 6, №5. - С. 36-41.

4. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.

5. Чекман И.С. Биохимическая фармакодинамика. - К.: Здоровье, 1991. - 200 с.

6. Чекман И.С., Потемкина Н.Н., Туманов В.А. Никотинамидные коферменты как объект воздействия лекарств и ядов // Фармакол. и токсикол. - 1977. - Т. 40, №1. - С. 113-122.

7. Яворовский А.П. Гигиена труда при получении и переработке эпоксидных смол и пластических масс: Дисс. д-ра мед. наук: 14.00.07. - К., 1990. - 494 с.

8. Высоцкий И.Ю. Каликин К.Г. Способ насыщения воздуха парами компонентов эпоксидных смол и других слаболетучих жидкостей с помощью пористой пластинки // Аннотированный перечень изобретений и рационализаторских предложений ученых - медиков к 35_летию Луганского медицинского института: Луганск. - 1991. - Вып. 3. - С. 19.

9. Высоцкий И.Ю., Каликин К.Г. Способ насыщения воздуха парами компонентов эпоксидных смол с помощью распыляющего устройства: Удостов. на рац. предложение №2611, выд. 07.02.1991 г. Луганским медицинским институтом.

10. Высоцкий И.Ю., Каликин К.Г. Испаритель компонентов эпоксидных смол с непрерывной подачей вещества // Аннотированный перечень изобретений и рационализаторских предложений ученых - медиков к 35_летию Луганского медицинского института: Луганск. - 1991. - Вып. 3. - С. 18-19.

11. Шумская Н.И., Толгская М.С. Токсикологические и морфологические исследования при воздействии эпоксидных смол и их исходных продуктов // Токсикология новых промышленных химических веществ. - М.: Медицина, 1965. - Вып. 7. - С. 76-90.

12. Huff W., Perlsweig W.A. The fluorescent consenderation product of N-methylnicotinamide and acetone. Asensitive method for the determination of N-methylnicotinamide in urine //J. Biol. Chem. - 1947. - V. 167, №1. - Р. 157-167.

13. Додж М., Кината К., Стинсон К. Эффективная работа с Microsoft Excel 97. - СПб.: ЗАО «Издательство Питер», 1999. - 1072 с.

14. Высоцкий И.Ю. Изыскание антидотно-лечебных средств при острой интоксикации эпоксидными соединениями // Вісник СумДУ. - 1999. - №1 (12). - С. 115-124.

15. Мак-Мюрей У. Обмен веществ у человека: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980. - 386 с.

16. Высоцкий И.Ю. Изменения ультраструктуры клеток печени при острой интоксикации летучими компонентами эпоксидных смол и лекарственная коррекция возникших нарушений // Вісник СумДУ. - 1999. - №3 (14). - С. 19-27.