Механизмы радиобиологического и физиологического действия химических ингибиторов синтеза биогенного оксида азота (NO)

Более 60 лет прошло со времени открытия Патом с сотрудниками эффекта защиты животных от действия ионизирующей радиации химическим агентом - цистеином [Patt H.M. et al., 1949]. Открытие возможности увеличения радиоустойчивости биологических объектов с помощью химических соединений стимулировало во всем мире большое число исследований, направленных на отыскание наиболее эффективных радиозащитных средств. Помимо прямой защиты от летального воздействия высоких доз радиации при ядерных инцидентах, это и другие соединения могли бы найти применение для сохранения важных функций организма у людей, занятых в таких областях человеческой деятельности как космические полеты, горнодобывающая промышленность, химические и энергетические радиационные производства, ядерная медицина, лучевая противоопухолевая терапия. В последнем случае, так как этой процедуре подвергается примерно половина заболевших, по-прежнему актуальной остается проблема защиты нормальных тканей, лежащих рядом с опухолью, из-за невозможности избежать их облучения. Таким образом, проблема создания эффективных радиопротекторов по-прежнему остается актуальной [Владимиров В.Г. и соавт., 1989; Maisin J.R., 1998; Lindegaard J.C., Grau C., 2000; Flynn D.F., Goans RE., 2006; Greenberger J.S., 2009].

Хотя в радиобиологии оксид азота (NO) известен уже более 50 лет как гипоксический радиосенсибилизатор [Howard-Flanders, 1957], его признание как важнейшего биомедиатора в сердечно-сосудистой, нервной, иммунной и других системах организма позволило открыть новые направления в исследованиях механизмов радиобиологических реакций и создало основу для разработки эффективных подходов к модификации радиочувствительности и радиотерапии злокачественных новообразований [Ванин А.Ф., 1997; Недоспасов А.А., 1999; Проскуряков С.Я. и соавт., 2000; Проскуряков С.Я. и соавт., 2001].

Первые радиобиологические исследования NO, которые были проведены на бактериальной культуре, показали, что эта газообразная субстанция, как экзогенный агент, обладает радиосенсибилизирующим действием [Howard-Flanders P., 1957]. Последующие эксперименты на культурах клеток млекопитающих и на животных подтвердили радиомодифицирующие свойства этой молекулы, а именно, радиочувствительность исследуемого объекта зависела от содержания NO в клетке или организме, которое можно было увеличивать либо с помощью введения доноров NO, или уменьшать применением ингибиторов его синтеза [Mitchell J.B. et al., 1993; Liebmann J. et al., 1994].

Изучение источников литературы показало, что ряд субстанций, относящихся к различным группам высокоэффективных радиопротекторов, таких как меркаптоэтилгуанидин, этилизотиомочевина и другие, ингибируют in vitro активность фермента, синтезирующего NO (NO-синтаза, NOS) [Проскуряков С.Я. и соавт., 2003; Southan, G.J., Szabo S.C., 1996]. Существенной особенностью подобных веществ было наличие в их молекуле структурного фрагмента, подобного (изостеричного) гуанидиновой группе L-аргинина, субстрата NOS (фермента, синтезирующего оксид азота), поскольку именно эта часть L-аргинина связывается с каталитическим центром NOS и является источником NO [см. обзор: Проскуряков С.Я. и соавт., 2005а]. Этот анализ и явился одной из причин развития наших исследований взаимосвязи химической структуры, NOS-ингибирующей активности, радиомодифицирующего и физиологического действия соединений одного из малоизученных классов, а именно, относящихся к производным изотиомочевины (R¹-NH-C(SR²)=NH).

Опубликованные данные о NO-ингибирующей активности как синтезированных, так и естественных субстанций, главным образом, опирались на результаты опытов в пробирке с изолированным (выделенным с той или иной степенью очистки) ферментом, синтезирующим NO - синтазой оксида азота (NOS). В незначительной части экспериментов оценка ингибирующей активности проводилась косвенным образом на основе измерения содержания метаболитов NO (NO₂- и NO₃-), либо в среде культивации определенной линии клеток, либо в сыворотке экспериментальных животных [Проскуряков С.Я. и соавт., 2005а; Salerno L. et al., 2002]. При этом в ряде случаев активные in vitro субстанции были неактивны в целостном организме экспериментальных животных или слишком токсичны, что существенно осложняло интерпретацию закономерностей активность-структура с целью дизайна и синтеза более эффективных веществ. Для преодоления этих недостатков при оценке NO-ингибирующей активности синтезированных веществ нами был модифицирован и использован метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки, развитый А.Ф. Ваниным и позволяющий проводить прямые измерения содержания NO в тканях организма ex vivo [Ванин А.Ф. и соавт., 1984; Коноплянников А.Г. и соавт., 1999].

Таким образом, учитывая, что NO проявляет многочисленные физиологические и биохимические свойства (фактор релаксации сосудов, антипатогенный эффектор, модулятор ангиогенеза, активатор стволовых клеток, нейтрансмиттер, регулятор редокс-гомеостаза и митохондриальной активности, танатогенный медиатор и др.) в настоящей работе нами были предприняты исследования в области решения двух актуальных проблем радиобиологии: 1) проблемы изыскания новых противолучевых средств на основе изучения роли эндогенного NO и ингибиторов его синтеза в радиобиологических процессах, развивающихся в организме млекопитающих при воздействии ионизирующей радиации, и 2) проблемы особенностей химической структуры веществ со свойствами ингибиторов синтеза NO в проявлении ими противолучевых и иных физиологических свойств, обеспечивающих предотвращение формирования у млекопитающих некоторых форм патологии (комбинированные радиационно-термические поражения, различные по генезу формы шока).

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования состояла в исследовании радиобиологического и физиологического действия низкомолекулярных ингибиторов синтеза оксида азота (NO) из химического класса производных изотиомочевины.

В рамках указанной цели решались следующие основные задачи:

1. Модифицировать метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки для оценки активности химических ингибиторов продукции биогенного NO in vivo.

2. Исследовать способность ряда известных радиопротекторов к ингибированию синтеза NO in vivo и выявить связь между этой активностью и их химической структурой.

3. Оценить способность к ингибированию синтеза NO ряда новых субстанций, содержащих тиоамидиновый фрагмент.

4. Выявить гипертензивную активность ингибиторов синтеза NO.

5. Исследовать действие ряда производных изотиомочевины на восстановление численности клоногенных клеток гемопоэза и кишечного эпителия у облученных животных.

6. Исследовать роль NO и модификаторов его синтеза и обмена в модели комбинированного радиационно-термического поражения.

7. На основе анализа данных о связи ингибирующая активность - структура предложить соединения с новой химической структурой в качестве ингибиторов синтеза и обмена NO и провести изучение синтезированных на этих принципах субстанций, как радиопротекторных, вазотропных и антишоковых средств.

Научная новизна исследования

Впервые исследована способность ряда известных радиопротекторов, в том числе производных изотиомочевины, к ингибированию продукции биогенного оксида азота в целостном организме экспериментальных животных и выявлены закономерности, связывающие их химическую структуру и биохимическую активность.

Получены приоритетные данные о способности ряда новых соединений - производных изотиомочевины, отличающихся наличием тиоамидиновой группы в линейной или циклической форме, ингибировать синтез NO в тканях животных.

Для некоторых ингибиторов синтеза NO исследована гипертензивная активность в моделях септического и гиповолемического шока и получены патенты на изобретение новых биологически активных субстанций.

Оригинальные производные изотиомочевины, синтезированные на основе анализа структура-активность, проявили существенную радиозащитную активность в отношении восстановления численности клоногенных клеток гемопоэза и кишечного эпителия у облученных животных.

Подтверждены предположения о возможности существенного снижения летальных последствий комбинированного радиационно-термического поражения с помощью ингибиторов и модификаторов продукции биогенного NO.

Новизна полученных результатов подтверждена двумя патентами РФ.

Теоретическое значение работы

1) Получены данные о соотношении структура-активность в ряду производных изотиомочевины, ингибиторов синтеза NO в тканях целостного организма, что позволяет делать рациональное предсказание новых структур потенциальных биологически активных субстанций.

2) На основе собственных результатов и данных литературы обосновано новое направление в поиске и создании радиопротективных средств как для защиты целостного организма, так и радиочувствительных систем - костного мозга и кишечного эпителия.

Практическое значение работы

В ходе выполнения данного исследования были созданы новые вещества, обладающие свойствами, перспективными для их применения в качестве препаратов, защищающих нормальные ткани при проведении лучевой терапии онкологических заболеваний, ослабления патологических последствий комбинированного радиационно-термического поражения, а также шоковых состояний различного генеза.

Положения выносимые на защиту

1. Модифицированный метод ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки адекватно определяет влияние производных изотиомочевины на продукцию оксида азота in vivo.

2. Соединения из класса производных изотиомочевины, обладающие радиопротекторными свойствами, являются ингибиторами синтеза биогенного оксида азота.

3. Найдены особенности химической структуры производных изотиомочевины, позволяющие создавать новые вещества с прогнозируемыми биологическими свойствами.

4. Производные изотиомочевины, синтезированные на основе дизайна их структуры, как ингибиторов продукции оксида азота in vivo, обладают радиопротективным и гипертензивным действием.

Апробация работы

Основные результаты работы представлены на следующих научных конференциях:

1. Международная конференция "Энергетика-3000" (Обнинск, 1998 г.);

2. Конфер. "Свободные радикалы и болезни человека" (Смоленск, 1999 г.);

3. Международная конференция "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000 г.);

4. International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia, 2000 г.);

5. Национальная научно-практическая конференция с международным участием "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека" (Смоленск, 2001 г.);

6. IX Российский национальный конгресс "Человек и Лекарство" (Москва, 2002 г.);

7. Национальная научно-практическая конференция с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003 г.);

8. Вторая международная конференция "Кислород- и серу-содержащие гетероциклы" (Москва, 2003 г.);

9. Конференция "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2005 г.);

10. Международная конференция по химии гетероциклических соединений,

11. посвященная 90-летию со дня рождения профессора А.Н. Коста

12. (Москва, 2005 г.);

13. VII Международная конференция "Биоантиоксидант" (Москва, 2006 г.);

14. Конференция "Фундаментальная наука - Центральной России" (Тамбов, 2007 г.).

Диссертация апробирована на научной конференции Экспериментального радиологического сектора Учреждения Российской академии медицинских наук "Медицинский радиологический научный центр РАМН" 20 января 2010 года (протокол "№ 251).

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 51 научная работа, из них 23 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОиН РФ.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследований, проведении большинства экспериментов, анализе и обобщении полученных данных. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 196 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения и выводов. Список литературы содержит 337 источников. Диссертация иллюстрирована 30 таблицами и 19 рисунками.

Материалы и методы исследования

Животные. Исследования проведены на 2500 белых неимбредно разводимых мышах (исходный генотип - линия Swiss), обоего пола, в возрасте 4-5 месяцев и массой 27-33 г, и на 2000 мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl/6), самцах, в возрасте 3 месяца и массой 20-22 г, на 350 крысах-самцах линии Вистар массой 250-350 г. Экспериментальные животные содержались в условиях лабораторного вивария и получали стандартный рацион и воду без ограничений.

Вещества. Все вспомогательные вещества были приобретены у фирмы "Сигма-Алдрич", Москва, если это не указано особо. Производные изотиомочевины были синтезированы в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ РАМН (зав. канд. мед. наук Ю.Г. Верховский). Производные 2-амино-2-тиазолина и 2-амино-5,6-дигидро-4Н-1,3-тиазина были получены от проф. В.М. Федосеева (кафедра Радиохимии, Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва).

Производные 2-аминобензотиазола были получены у проф. Л.Д. Смирнова (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН).

Серотонина адипинат и этилизотимочевины диэтилфосфат ("Дифетур") были предоставлены В.Ю. Ковтуном (НПЦ "Фармзащита", Химки, Россия).

Облучение и комбинированное радиационно-термическое поражение

Общее гамма-облучение мышей проводили на аппарате "Луч" (⁶⁰Co) при мощности дозы 0,3 - 0,5 Гр/мин.

При моделировании КРТП термический ожог (ІІІ-Б степени, 10% общей площади поверхности тела) наносили на предварительно выстриженную поверхность области спины мышей c помощью мощной вспышки света в первые 5 мин после облучения в дозе 7 Гр.

Регистрация NO методом ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки

Для индукции достаточного для целей исследования количества NO в организме экспериментальных животных им за 4,0 ч до эвтаназии инъецировали липополисахарид (ЛПС, 1,5 мг/кг). Затем из их органов (печень, почки, легкие, сердце, головной мозг, эпителий кишечника) готовили образцы для определения содержания в них NO-радикалов методом ЭПР-спектроскопии спиновой ловушки (СЛ) с использованием метода, разработанного А.Ф.Ваниным и сотрудниками [Ванин А.Ф. и соавт., 1984; Микоян В.Д. и соавт., 1994]. В качестве СЛ NO использовали Fe²⁺-диэтилдитиокарбаматный комплекс (Fe²⁺-ДЭТК), который вводили животным за 30 мин до взятия образцов тканей. Для увеличения надежности получаемых оценок уровня NO и в целях приближения методики к задачам исследования были внесены модификации [Коноплянников А.Г. и соавт., 1999; Проскуряков С.Я. и соавт., 2003]. В частности, из результирующего ЭПР-спектра СЛ вычитали спектр ДЭТК-Cu²⁺, который вносит определенную погрешность при измерении амплитуды интересующего нас сигнала [Кубрина Л.Н. и соавт., 1989; Suzuki Y. et al., 1997]. Кроме того, для стандартизации измерений одновременно со спектром образца, в том же канале, записывали спектр эталона MgO:Mn²⁺ (Институт физико-технических и радиотехнических измерений, Менделеево, Россия). Относительное содержание (ОС) оксида азота в образцах рассчитывали по соотношению ОС = А₂ / (А₁ х M), где А₁ - величина амплитуды второй низкопольной линии спектра ЭПР-эталона, А₂ - амплитуда 1-го (низкопольного) компонента сверхтонкой структуры спектра ЭПР (СТС) после вычитания спектра примеси ДЭТК-Cu²⁺, а М - масса образца в граммах. Спектры ЭПР регистрировали при 77К на радиоспектрометре фирмы "Bruker" (модель ESP-300E) в X-диапазоне при СВЧ-мощности 5 мВт и амплитуде модуляции магнитного поля 0,32 мТ.

Результаты измерений содержания NO в ткани животных (в печени, если не указано особо), обработанных различными веществами, выражались как отношение амплитуды ЭПР-сигнала комплекса NO-Fe²⁺-(DETC)₂ в образцах из мышей, подвергшихся воздействию ЛПС+вещество, к амплитуде сигнала в образцах печени из мышей, обработанных только ЛПС.

Определение выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток методом селезеночных эндоколоний (КОЕ-С-8)

Опыты проводили на мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl/6), самцах, массой 20-22 г, в возрасте 3 месяцев, находившихся в условиях содержания и кормления лабораторного вивария. Через 8 суток после воздействия (облучение в дозах от 6 до 7 Гр, облучение + ожог) у животных извлекали селезенки и фиксировали для подсчета на их поверхности колоний размером более 0,2 мм, образованных выжившими гемопоэтическими клоногенными клетками, которые принято обозначать как КОЕ-С-8 [Коноплянников А.Г., 1984]. В каждой группе в этих опытах содержалось 12 мышей, опыты повторялись 2-3 раза. Статистическую обработку среднего числа селезеночных колоний, образованных за счет выживших клеток, проводили согласно методическим рекомендациям [Коноплянников А.Г., 1975].

Определение выживаемости клоногенных клеток в криптах кишечного эпителия

Выживаемость стволовых клеток эпителия тонкого кишечника оценивали с помощью методики "кишечных микроколоний" [Коноплянников А.Г., 1984], подвергая мышей (F1(CBAxC57Bl/6), самцы, массой 20-22 г) с применением соответствующих модификаторов или без них общему гамма-облучению в дозе 13 Гр. Через 3 суток животных декапитировали для взятия участка тонкой кишки, который фиксировали и приготавливали гистологические препараты поперечных срезов кишечника. На этих срезах подсчитывали число регенерирующих крипт (сохранивших выжившие стволовые клетки кишечного эпителия) и крипт, в которых регенерация отсутствует (нет выживших стволовых клеток). В этих опытах в каждой группе было по 5 мышей.

Исследование вазотропного действия химических субстанций

Исследования выполнены на крысах Wistar массой 250 - 350 г по 4-8 животных в группе. У наркотизированных крыс (нембутал 55 мг/кг, внутрибрюшинно) регистрировали следующие параметры сердечно-сосудистой деятельности: частота дыхательных движений (ЧДД), частота сердечных сокращений (ЧСС) по интервалу RR, систолическое и диастолическое давление (АДс и АДд) из устья левой сонной артерии, а также показатели электрокардиограммы в трех стандартных отведениях (ЭКГ).

Для оценки антигипотензивного действия изучаемых субстанций использовали 2 модели шока. При моделировании септического шока, сразу после записи фоновых показателей, животным инъецировали внутрияремно в течение 3 - 5 мин. ЛПС из Escherichia coli (Sigma - 0111:B4) в дозе 20 мг/кг. После достижения устойчивого эффекта гипотонии (через 20 мин) крысы получали исследуемые препараты.

Для создания гиповолемического шока из яремной вены производили забор крови в объёме 1,4 - 1,9% от массы подопытного животного.

В группах было по 3 - 7 животных. Контрольным группам в качестве плацебо вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Статистическая обработка результатов

Данные приведены в виде средних ± стандартное отклонение. Статистические различия средних значений устанавливали с помощью дисперсионного анализа и критериев Ньюмена-Кейлса и Даннета. Достоверность различий в выживаемости мышей разных групп оценивали с использованием критерия ?² [Урбах В.Ю., 1964; Гланц С., 1999]. Статистически значимыми признавались отличия с P<0,05.

Результаты исследований и обсуждение

Влияние радиопротекторов на синтез биогенного NO in vivo

Большая часть экспериментов была проведена на мышах, получавших за 4 ч до эвтаназии инъекцию ЛПС (1,5 мг/кг) для стимуляции синтеза NO. Такая обработка позволяет надежно фиксировать влияние ингибиторов NO на его продукцию, поскольку под влиянием индуктора содержание NO возрастает, в частности в печени мышей в 10-30 раз, в зависимости от линии и возраста экспериментальных животных. Исследуемые субстанции вводили животным через 3,0 ч после ЛПС, если не отмечено особо, так, что взаимодействие потенциального ингибитора синтазы оксида азота продолжалось (до получения образцов ткани) в течение одного часа. Выбор дозы препарата определялся его токсичностью и проявляемым радиозащитным эффектом [Яшунский В.Г., 1975; Яшунский В.Г., Ковтун Е.Ю., 1985; Гугушвили Б.С. и соавт., 1987; Weiss J.F., Landauer M., 2000].

В табл. 1 и 2 представлены результаты определения NO-ингибирующей активности ряда радиопротекторов различной химической структуры [Федосеев В.М., 1973; Shapira R. et al., 1957; Weiss J.F., 1997].

Производные изотиомочевины - этирон и АЭТ отличались большей NO-ингибирующей активностью по сравнению с классическими радиопротекторами: Cys, МЭА и WR-2721. Этирон и АЭТ подавляли продукцию NO в той же степени, что и классический ингибитор синтазы оксида азота (NOS) L-NNA, взятом для сравнения примерно в той же молярной дозе. Эти величины - 2, 3 и 2%, соответственно, достоверно не отличаются от стационарной концентрации NO в интактных животных, т.е. у животных не получавших ЛПС. Увеличение объема S-заместителя у тиомочевины, т.е. замена этильного радикала в этироне на этилизотиурониевый или пропилизотиурониевый, привело к существенному снижению NO-ингибирующей активности ЭДТ и ПДТ до 65 и 60%, соответственно.

В табл. 2 приведены данные о NO-ингибирующей активности соединений с радиопротективным действием из двух групп циклических производных изотиомочевины (ИТМ) - производных тиазолина и тиазина [Некрасова И.М. и соавт., 1974; Константинова М.М. и соавт., 1977; Федосеев В.М. и соавт., 1978], а также гетероциклического соединения из класса производных индолилалкиламина, известного радиопротектора - 5-метокситриптамина [Жеребченко П.Г., 1971].

Таблица 1. NO-ингибирующая активность in vivo некоторых радиопротекторов с линейной структурой.

¹ - приведено отношение содержания NO в печени подопытных мышей, получавших ЛПС и препараты за 4 ч и за 1 ч до эвтаназии, соответственно, к содержанию NO в печени контрольных мышей, обработанных только ЛПС;

² - Препарат вводили за 4 ч до эвтаназии животных;

* - Указаны данные, статистически отличающееся от контроля (Р<0,05) и не отличающиеся от конститутивного уровня продукции NO у интактных животных, не получавших ЛПС (Р>0,05);

** - Указаны данные, статистически отличающееся от конститутивного уровня продукции NO у интактных животных (Р<0,05) и от величины продукции NO у животных контрольной группы, получавших только ЛПС (Р<0,05).

В наибольшей степени среди циклических производных изотиомочевины продукцию NO до базального уровня подавляли 2-АТ и 2-АDТ при дозе 0,32 и 0,5 ммоль/кг. Кроме 5-КМАТ, все остальные изученные гетероциклические производные, содержащие тиоамидиновую группу, подавляли продукцию NO с эффективностью, сравнимой с линейными изотиурониевыми производными. Следует отметить, что 2-АТ и 2-АDТ являются основными продуктами метаболизма АЭТ и S-аминопропилизотиомочевины в организме животных [Тарасенко А.Г. и соавт., 1973; Федосеев В.М. и соавт, 1973; Федосеев В.М. и соавт., 1974; Kozak I, Arient M., 1973].

Таблица 2. NO-ингибирующая активность in vivo некоторых радиопротекторов с гетероциклической структурой.

^1, *, ** -то же, что в табл. 1.

С целью сравнительной оценки NO-ингибирующего действия содержащих и не содержащих серу радиопротекторов были испытаны три соединения из группы индолилалкиламина. Данные (табл.2) свидетельствуют о том, что все эти вещества в дозах, соответствующих их радиопротективному действию, достоверно подавляют продукцию NO.

Таким образом, из вышеприведенных данных и анализа литературы можно заключить, что 1) полученная методом ЭПР-спектроскопии оценка NO-ингибирующей активности in vivo ряда радиопротекторов, относящихся к группам меркаптоалкилгуанидина, изотиомочевины и ее гетероциклических производных, в целом совпадает с результатами определения NOS-ингибирующего действия этих субстанций на моделях с изолированным ферментом или культурах клеток [Garvey E.P et al, 1994; Southan G.J. et al., 1995; Southan G.J. et al., 1996a; Southan G.J. et al., 1996b; Southan G.J. et al., 1996c;]; 2) способность к ингибированию продукции NO может быть общим свойством радиопротекторов, которое, вероятно, лежит в основе одного из механизмов защиты от воздействия ионизирующей радиации. Поэтому следующим этапом исследования стал поиск новых химических соединений, содержащих тиоамидиновый структурный фрагмент (табл.1), в том числе в классе производных изотиомочевины (ИТМ), с целью создания эффективных ингибиторов продукции NO in vivo и, затем, испытание их в качестве радиопротекторов.

NO-ингибирующая активность линейных и гетероциклических соединений, содержащих тиоамидиновую структурную группу

С целью определения структурных особенностей соединений с высокой NO-ингибирующей активностью было изучено несколько классов линейных и гетероциклических соединений, содержащих тиоамидиновый фрагмент. Среди них были N'-моно- и N',N'-дизамещенные 2-амино-2-тиазолины (13 веществ), производные 2-аминобензотиазола и индола (21 вещество), однако эффективных ингибиторов среди них найдено не было. Влияние веществ из двух групп производных 2-амино-5,6-дигидро-1,3-тиазина и S-алкилизотиомочевины на продукцию биогенного NO у мышей, подвергнутых эндотоксиновому шоку, представлено ниже.

Производные 2-амино-5,6-дигидро-4(Н)-1,3-тиазина

Следующей исследованной группой соединений стали производные 2-амино-4,5-дигидро-4(Н)-1,3-тиазина (Табл. 3). Родительский представитель этой группы - 2-АDТ является одним из самых сильных ингибиторов (in vitro) среди соединений, содержащих в своей структуре тиоамидиновый фрагмент [Narayanan K. et al., 1995; Moore W.M. et al. 1996]. Однако другие его производные, кроме 6-метил-2-АДТ [Nakane M. et al., 1995], не были изучены.

В табл. 3 представлены результаты определения NO-ингибирующей активности производных 2-АDТ. Основываясь на структуре высокоэффективного ингибитора NOS 6-метил-2-АDТ [Nakane M. et al., 1995], были выбраны и испытаны 2 соединения, у которых в 6-ом положении была спирогруппа (ADT-XI, -XII). Полученные данные показали, что, вероятно, такой большой объем заместителя, по сравнению с метильной группой в 6-метил-2-АDТ, не позволяет прочно взаимодействовать соединению с ферментом и конкурировать с L-аргинином за каталитический центр. Наиболее активными в этой серии соединений оказались ацильные производные 2-АDТ (ADT-XIII, -XIV, -XV). При дозе введения животным 0,01 ммоль/кг они подавляли продукцию NO в печени до уровня стационарного синтеза радикала в интактных животных. Это свидетельствует о том, что производные 2-АDТ, содержащие ацильный радикал (ацетил-, пропионил- и бензоил-) являются ингибиторами NOS. Т.е., помимо возможного в организме влияния других факторов (распределение, накопление, метаболизм и др.), основная причина ингибирующего эффекта связана с пространственным соответствием структуры соединения и каталитического центра фермента и соответствующим подавлением его NO-синтетической активности.

Таблица 3. Ингибирующее действие производных 2-амино-5,6-дигидро-4(H)-1,3-тиазина на продукцию NO.

^1, *, ** -то же, что в табл. 1.

Однако дальнейшее увеличение размера заместителя у аминогруппы (циклогекcаноил-, и адамантоил-), привело к уменьшению ингибирующего действия этих производных 2-АDТ (АDT-XVI, - XVII). При дозе 0,1 ммоль/кг, в 10 раз большей по сравнению с тремя вышеупомянутыми веществами, они снижали продукцию NO лишь до 32 и 12%, соответственно.

Таким образом, введение карбонильного мостика между алкильным или арильным заместителем и аминогруппой гетероцикла существенно усиливает NO-ингибирующее действие таких производных. Отсюда следует, что 1) открыты новые высокоэффективные ингибиторы продукции NO in vivo в группе производных 2-амино-5,6-дигидро-4(H)-1,3-тиазина, содержащих N'-ацильный заместитель; 2) по-всей вероятности, ингибирование обусловлено достаточной гибкостью дигидротиазинового цикла, который, несмотря на значительно бoльший объем по сравнению с линейными производными изотиомочевины, способен стерически адаптироваться к форме каталитической полости фермента, а также карбонильной группой, образующей дополнительные водородные связи с пептидами фермента [Трофимова Т.П. и соавт., 2008; 2009; Зефирова О.Н. и соавт., 2009]; 3) высокая биохимическая активность вышеуказанных соединений позволяет предположить у них определенный спектр физиологической активности, в том числе, вазоконстрикторный и противовоспалительный эффекты, которые могут быть полезны в снижении патогенетических последствий радиационного и комбинированного радиационно-термического поражения [Проскуряков С.Я. и соавт., 2003; Проскуряков С.Я. и соавт., 2005b; Будагов Р.С. и соавт., 2006].

Производные изотиомочевины

В табл. 4 приведены данные о NO-ингибирующей активности производных изотиомочевины (ИТМ) in vivo, полученные методом ЭПР-спектроскопии СЛ. Из них следует, что соединения с алкильными заместителями, содержащими в линейной части более или менее 2 углеродных атомов (ITU-I - ITU-IV и ITU-XIV, -XV), проявляют меньшее ингибирующее действие на продукцию NO. В частности, N-ацетил-S-(4-фторбутил)-ИТМ (ITU-XV) практически не оказывала действия на продукцию NO. Слабая ингибирующая активность была и у ИТМ с аллильным радикалом (ITU-XIV). Также незначительной активностью отличались ИТМ, не содержащие карбонильного звена (-(CO)-) в N-заместителе - N-метил-S-этил-ИТМ и N-дифенилфосфат-S-этил-ИТМ (ITU-I и ITU-VI), 80% при дозе 0.01 ммоль/кг и 64% при дозе 0,03 ммоль/кг, соответственно.

Интересный результат был получен при изучении N-ацилированных S-алкил-ИТМ. Эти производные с S-метильным, этильным и изопропильным заместителями эффективно ингибировали продукцию NO. Например, (ITU-IX) при дозе 10 ммоль/кг подавляло содержание NO в печени до 3%. Кроме того видно, что ацилирование практически не снижало ингибирующей активности производных по сравнению с их родительскими соединениями, например, ITU-I и ITU-II, ITU-V и ITU-VII. Можно отметить, что в отличие от тиомочевины и ее N-алкил(арил)производных, N-гуанилтиомочевина (GTU) (известный антигипоксант - гутимин) оказывал достоверное ингибирующее действие на продукцию NO, что может быть одним из механизмов его биологической активности.

Таблица 4. Ингибирующее действие S,N-замещенных производных изотиомочевины на продукцию NO.

Ингибиторы вводили животным через 3 ч после введения LPS [Коноплянников А.Г. и соавт., 1999; Проскуряков С.Я. и соавт., 2003; Проскуряков С.Я. и соавт., 2009];

^{1, 2, *, **} - то же, что в табл. 1.

В целом, результаты, полученные при исследовании N'-ацилированных производных 2-АDТ (табл. 3) и N-ацилированных производных ИТМ (табл. 4) свидетельствуют о том, что найдена возможность существенного расширения спектра веществ, ингибирующих продукцию NO in vivo. Это открывает перспективы синтеза таких производных, которые, не теряя высокой ингибирующей активности, по сравнению с родительскими соединениями, будут обладать требуемыми фармакологическими характеристиками, как-то, токсичность, клиренс, метаболизм и распределение в организме. Кроме того, новые соединения, охарактеризованные как эффективные ингибиторы продукции NO in vivo, могут быть использованы в модели in vitro с выделенным ферментом для решения фундаментальных вопросов, касающихся строения и механизмов функционирования синтазы оксида азота.

Учитывая важную роль NO в формировании радиобиологических реакций [Mikkelsen R.B. et al., 2003; Michurina T. et al., 2004], в следующем разделе было изучено влияние некоторых соединений, содержащих тиоамидиновую группу и обладающих NO-ингибирующей активностью in vivo, на клоногенные клетки гемопоэза.

Стимулирующее действие призводных изотиомочевины на выживаемость гемопоэтических клоногенных клеток в облученных животных. Для исследования радиопротективного действия на модели эндогенных селезеночных колоний (КОЕ-С-8) были отобраны соединения с наибольшей NO-ингибирующей активностью. Препараты вводили в максимально толерантной дозе. В таких дозах эти соединения не могли быть испытаны в опытах по ингибированию синтеза NO, так как вместе с другими компонентами СЛ они были слишком токсичны. Препараты, обладавшие существенной NO-ингибирующей активностью, как из группы производных 2-АDТ, так и изотиомочевины, оказывали достоверное стимулирующее действие на выживаемость гемопоэтических клоногенных клеток (ГКК).

На следующих рисунках представлены данные о влиянии N,S-замещённых производных изотиомочевины (ИТМ) на образование эндогенных гемопоэтических колоний в селезенке облученных животных. Из рис.1 видно, что все испытанные соединения оказали защитное действие, которое выразилось в росте числа КОЕ-С-8 с увеличением дозы веществ, инъецируемых животным за 10-20 мин до облучения. Если животные получали бoльшую дозу препарата (0,5 ммоль/кг), то число колоний на селезенке, отражающее рост числа выживших ГКК, возрастало примерно в 1,8 - 5,2 раза. При этом эффект защиты был наименьшим у S-алкил-производных ИТМ по сравнению с N-пропионил-S-алкил-производными (Рис.1Б). Число КОЕ-С-8 увеличивалось в среднем в 1,5 - 2,9 раза в зависимости от дозы вещества.

Из данных, приведенных на рис. 1, видно, что N-пропионил-S-алкил-ИТМ проявляют заметно большее стимулирующее влияние на выживаемость гемопоэтических клоногенных клеток, чем неацилированные производные S-алкил-ИТМ. Подобное радиопротективное действие было обнаружено и для N-ацетил-S-алкил-ИТМ (соединения ITU-II, VI, XII, табл. 4). Число КОЕ-С-8 у животных, получавших эти препараты, увеличивалось в 2,6 - 5,8 раза.

Рис. 1. Радиозащитное действие производных изотиомочевины на выживаемость гемопоэтических клоногенных клеток (ГКК).

А: 1- ITU-I (S-метил-ИТМ, диметилфосфат);

2 - ITU-V (S-этил-ИТМ, диэтилфосфат);

3 - ITU-XI (S-изопропил-ИТМ, диизопропилфосфат).

Б. 1- ITU-III (N-Пропионил -S-метил-ИТМ, гидроиодид);

2 - ITU-VIII (N-Пропионил -S-этил-ИТМ, гидробромид);

3 - ITU-XIII (N-Пропионил-S-изопропил-ИТМ, гидробромид).

* - статистически значимые различия с контролем, P<0,05.

Радиопротективные свойства ИТМ были также подтверждены в экспериментах по облучению животных в диапазоне доз, вызывающих кишечную форму гибели животных. На рис. 2 показано влияние двух производных ИТМ (ITU-VIII, ITU-XIII) на восстановление крипт тонкого кишечника после облучения в дозе 13 Гр. Оба препарата достоверно увеличивали (почти в 3 раза) число выживших крипт, что свидетельствует о радиозащитном действии производных ИТМ на стволовые клетки кишечного эпителия.

Рис. 2. Радиозащитное действие производных изотиомочевины на выживаемость клоногенных клеток крипт тонкого кишечника (ККК).

I - Контроль, 13 Гр;

II - ITU-VIII (N-Пропионил-S-этил-ИТМ, гидробромид) за 10 мин до обл.;

III - ITU-XIII (N-Пропионил-S-изопропил-ИТМ, гидробромид) за 10 мин до облучения.

Данные, представленные на рис. 3, свидетельствуют о радиозащитном действии одного из производных ИТМ (ITU-XIII) на выживаемость животных. Продолжительность жизни погибших животных также увеличавалась с дозой препарата от 7,6 до 14 суток.

В целом, можно заключить, что N-ацилированные циклические и линейные производные изотиомочевины проявляют не меньшую радиозащитную активность, чем их родительские аналоги, а это открывает перспективы синтеза новых веществ в этом классе, которые, не теряя радиозащитного действия, будут обладать требуемыми фармакологическими характеристиками, как-то, токсичность, клиренс, метаболизм, распределение в организме и др.

Рис. 3. Радиопротективное действие препарата ITU-XIII (N-пропионил-S- изопропил-ИТМ, гидробромид), введенного за 10 мин до облучения, на выживаемость мышей.

1 - Контроль, 9 Гр; 2 - 21 мг/кг; 3 - 42 мг/кг; 4 - 127 мг/кг.

3 и 4 статистически достоверно отличаются от 1, Р<0,05.

Гипертензивное действие линейных и гетероциклических производных изотиомочевины.

Исходя из данных о важнейшей роли NO, как эндогенного вазорелаксирующего фактора, в том числе при стрессовых состояниях [Shah N.S., Billiar T.R., 1998], было исследовано действие ингибиторов продукции биогенного NO in vivo на артериальное давление, частоту сердечных сокращений и дыхательных движений у интактных животных и животных, находящихся в состоянии септического или геморрагического шока.

Было испытано несколько препаратов (4-ОАТ, АЭТ, 2-АТ, 2-АDТ) с NO-ингибирующим и радиопротективным действием. Через 10 мин после их введения наркотизированным животным наблюдалось увеличение артериального давления на 10 - 18%, которое в течение одного часа снижалось.

Таким образом, как гемодинамические исследования, так и ЭПР-спектроскопические подтверждают факт, что одним из механизмов увеличения АД под действием испытанных препаратов является ингибирование активности ферментов, синтезирующих NO, и соответствующее снижение содержания этого вазорелаксирующего агента.

Известно, что одним из важных патогенетических факторов, приводящих к синдрому мультиорганной недостаточности при ряде форм шока, является гипотензия и кислородная недостаточность (гипоксия), в решающей степени обусловленные избыточной продукцией биогенного NO [Paternotte E. et al., 2008].

На рис. 4 приведены данные, типичные для временной зависимости АД у крыс. Обработка животных после инъекции ЛПС препаратом 2-АDТ в дозе 5 мг/кг вызывала достоверное увеличение АД на 20-30%, которое сохранялось на протяжении 70 мин. Повторное введение препарата, на фоне нового развития гипотонии, через 100 мин после 1-ого практически не вызывало гипертензивного эффекта. Следует отметить, что после повторного введения 2-АDТ в больших дозах (10, 20 и 30 мг/кг), в соответствующих группах наблюдалось угнетение дыхания и последующая гибель животных.

Рис. 4. Динамика изменений артериального давления у крыс, получивших 2-АДТ (5 мг/кг) через 20 мин (А) после инъекции LPS. Пунктирными линиями ( ; ) обозначены уровни артериального давления у интактных животных: систолическое (АДс, 167±7 мм рт. ст.) и диастолическое (АДд, 116±4 мм рт. ст.).

Подобные результаты были получены при изучении гипертензивного эффекта ацилированных производных 2-АDТ. Наиболее продолжительный и выраженный подъем АД наблюдали после введения ADT-XV (5 мг/кг), продолжительностью до 2 часов и до 90% от уровня АД у контрольных животных, не получавших ЛПС.

ADT-X - бензильное производное 2-АDТ, оказалось гораздо слабее в нормализации гемодинамических изменений, вызванных ЛПС. Введение его крысам, находящимся в состоянии септического шока, в дозе 5 мг/кг вызывало умеренное, на 15 - 20%, повышение АД. Но к 20 минуте наблюдений эффект пропадал и продолжалось снижение АД.

Таким образом, можно заключить, что, как у интактных животных, так и находящихся в состоянии эндотоксемического шока, отобранные нами ингибиторы продукции NO (эндогенного фактора релаксации сосудов) вызывают вазоконстрикцию и соответствующее увеличение артериального давления. При этом более слабый ингибитор - ADT-X проявлял и меньший антигипотензивный эффект.

С целью расширения области возможного терапевтического применения отобранных нами ингибиторов продукции NO in vivo было изучено их действие на сердечно-сосудистую деятельность у животных, подвергнутых геморрагическому шоку, вызванному острой кровопотерей.

Рис. 5. Антигипотензивное действие производных изотиомочевины при дозе введения 10 мг/кг. Влияние на диастолическое АД (АДд).

1 - ITU-XII (N-Ацетил-S-изопропил-ИТМ, гидробромид);

2 - ITU-V (S-Этил-ИТМ, диэтилфосфат);

3 - ITU-XI (S-Изопропил-ИТМ, диизопропилфосфат);

4 - ITU-VI (N-Ацетил-S-этил-ИТМ, гидробромид).

* - отмечено отсутствие статистически достоверного эффекта препарата на измеряемый гемодинамический параметр. В остальных случаях увеличение АД под влиянием препаратов было статистически значимо, P<0,05.

Данные, представленные на рис. 5, рассчитаны по соотношению: "Изменение АДд" = {[АДд(оп) - АДд(кп)]/[АДд(к) - АДд(кп)]}х100%, где АДд(оп) - артериальное давление у крыс, получавших препарат после кровопотери, АДд(кп) - у животных в состоянии гиповолемического шока и АДд(к) - артериальное давление у интактных животных, соответственно. Таким образом, если после введения препарата животным в состоянии шока АДд(оп) у них увеличивалось до АДд у интактных крыс, то "Изменение АДд" становилось равным 100% и свидетельствовало о высокой эффективности вещества. Подобные соотношения и выводы о влиянии производных ИТМ на АД относятся и к систолическому АД.

Из представленных результатов видно, что наиболее сильным гипертензивным действием обладает ITU-XII. Через 5 мин после введения соединение увеличивало АД до 80% от нормы и затем, на протяжении 40 мин, поддерживало АДд на уровне 80-100% и АДс на уровне 80-60%. Менее выраженное, но также продолжительное гипертензивное действие оказывали два соединения из группы неацилированных производных ИТМ. Антигипотензивный эффект N-ацетил-S-этил-ИТМ был ограничен 10 мин после кровопотери.

Приведенные данные позволяют заключить, что несмотря на высокую NO-ингибирующую активность, испытанные соединения проявляли различное физиологическое (гипертензивное) действие, что свидетельствует о влиянии на гемодинамику животных, подвергнутых гиповолемическому шоку, других факторов организма, действующих в комплексе с NO. Тем не менее следует отметить, что два соединения (метил-ИТМ диметилфосфат (ITU-I ), N-ацетил-S-метил-ИТМ гидроиодид (ITU-II) с более низкой NO-ингибирующей активностью (табл. 4), чем вышеуказанные, практически не влияли на изменения АД после кровопотери.

В целом, исследование антишокового действия линейных и циклических производных изотиомочевины показало, что существенную роль в падении АД в первые минуты после кровопотери играет избыточная продукция NO (вероятно, и других гипотензивных агентов, секретируемых под действием шока). Все изученные соединения вызывали достоверное повышение АД в первые 5 мин после их введения животным. Очевидно, что поступление ингибиторов NOS в кровоток вызывает снижение продукции вазорелаксирующего фактора в эндотелии и гладкомышечной ткани сосудов, что и является причиной вазоконстрикции и гипертензивной реакции.

Роль NO-зависимых механизмов в патогенезе комбинированного радиационно-термического воздействия

Механизмы отягощающего действия термической травмы на течение и исход радиационного поражения при комбинированном радиационно-термическом воздействии остаются пока еще далеко не выясненными, хотя и получены важные экспериментальные данные об участии в них таких биомедиаторов, как цитокины и метаболиты арахидонового цикла [Будагов Р.С., Ульянова Л.П., 2004; 2005; Ran X.Z. et al., 2008]. С целью уточнения этих механизмов было изучено действие ряда модификаторов продукции NO на выживаемость животных как интегральный показатель [Проскуряков С.Я. и соавт., 2005; Будагов Р.С. и соавт., 2006].

На рис.6 представлены данные о влиянии ингибитора синтеза NO препарата дифетур на выживаемость животных с комбинированными радиационно-термическими поражениями (КРТП). Выживаемость животных возрастала с 20% в контроле до 50% при введении препарата сразу после воздействия и троекратно (через 4 ч, на 5-е и 6-е сутки). Однако когда препарат вводили через 4 ч, достоверного отличия между контрольной группой (только КРТП) и группой (3), которой вводили препарат, не было.

Рис. 6. Влияние дифетура (15 мг/кг, 0,06 ммоль/кг) на выживаемость животных, подвергнутых комбинированному радиационно- термическому воздействию.

1 - КРТП (Контроль); 2 - дифетур сразу после КРТП, интрагастрально;

3 - через 4 ч после КРТП; 4 - трехкратная обработка препаратом, через 4 ч и на 5-ые и 6-ые сутки после КРТП. Зависимости 2 и 4 статистически достоверно отличались от контрольной 1, Р<0,05

Из полученных результатов видно, что имеется два критических периода в развитии повреждений, вызываемых комбинированным воздействием: в 1-е часы и 5-е, 6-е сутки после КРТП. Можно предположить, что повышение синтеза NO в раннем периоде КРТП увеличивает чувствительность животных к патологическим процессам, приводящим к гибели в более поздние сроки. Эти данные также свидетельствуют о перспективности поиска новых средств терапии КРТП среди соединений, подавляющих продукцию NO, в том числе содержащих тиоамидиновый структурный фрагмент (табл.1).

На рис.7 показаны данные о динамике гибели животных, получавших препарат темпол. Его ингибирующее действие на продукцию биогенного NO также было определено in vivo в печени эндотоксемических мышей и составило 54% при дозе 100 ммоль/кг. Под действием темпола выживаемость животных увеличивалась с 20% в контрольной группе (1) до более 60% в группах, получавших препарат по разным схемам.