1

На правах рукописи

Королева Светлана Вячеславовна

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ КОНТИНУУМА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ И МЕДИАТОРОВ

Специальность 03.03.01 - физиология

МОСКВА - 2010

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой - профессор А.А. Каменский).

Научные консультанты:

академик РАН, доктор химических наук Н.Ф. Мясоедов,

профессор, доктор биологических наук А.А. Каменский.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.А. Титов

доктор биологических наук Т.А. Гудашева

доктор биологических наук И.А. Гривенников

Ведущая организация - Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится 31 мая 2010 г. в 15³⁰ часов на заседании диссертационного ученого совета Д501.001.93 Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук Б.А. Умарова

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема взаимодействия различных регуляторных систем, обеспечивающих гомеостаз при изменяющихся внешних условиях существования организма, до настоящего времени далеко не исчерпана. Бурный прогресс молекулярной биологии, физиологии и медицины позволил за короткий период накопить огромный объем информации, которая определила качественные изменения в оценке деятельности всего организма: на молекулярном, клеточном и органно-системном уровне. Так, было выявлено, что в системе контроля многих жизненно важных процессов организма важную роль играют регуляторные пептиды (РП). Они могут сосуществовать с классическими медиаторами, модулируя и усиливая их активность. С одной стороны, каждый из пептидов обладает уникальным сочетанием эффектов, а, с другой стороны, имеет перекрывающийся с остальными РП спектр биоактивностей. В совокупности все множество РП образует эффективный функциональный континуум, решающий множество задач управления. Способность подавляющего большинства из них индуцировать и ингибировать выход других РП формирует разветвленную, взаимосопряженную систему регуляции биологических функций. Некоторые РП, изученные как факторы внутреннего подкрепления (ФВП) и эмоционально-положительных состояний, являются стимуляторами дофамина и снижают уровень депрессии.

Наряду с РП существует не менее важная группа других биологически активных эндогенных соединений (ЭнС), - непептидных медиаторов, участвующих в управлении и контроле многих жизненно важных процессов организма. Одна из первостепенных ролей в медиаторных процессах принадлежит системе биогенных аминов - дофамину (DA), норадреналину (NE) и серотонину (5-HT), а также ацетилхолину (ACh). Эти эндогенные регуляторы являются хорошо изученными и наиболее характерными представителями основных медиаторных систем ЦНС. Выявлено, что между различными РП и медиаторными системами организма существуют сложные индукционные связи.

К настоящему времени накопился очень большой объем исследовательских работ по анализу воздействия РП и медиаторов на различные параметры организма, а также по их индукционным взаимодействиям. Трудность систематизации и анализа таких экспериментальных данных обусловлена тем, что число известных РП животных и человека превышает уже 9000. Кроме того, большой спектр биоактивностей и индукционных эффектов РП приводит к тому, что каждая функция контролируется, как правило, множеством РП. Вычленение таких пептидных констелляций позволяет, с одной стороны, провести анализ структурно-функциональных закономерностей континуума, а с другой стороны, дает теоретические обоснования для применения комплексов РП и их аналогов в качестве терапевтических агентов. Наряду с желательными физиологическими функциями у каждой комбинации РП обязательно присутствуют побочные эффекты. Необходимость коррекции этих воздействий усложняет задачу поиска оптимальных сочетаний РП. Учитывая все это, необходимо разработать теоретические подходы, позволяющие разумно ограничить выбор комплексов, рассчитанных на достижение того или иного эффекта. Такой анализ комбинаций из множества регуляторных пептидов не представляется возможным без применения компьютерных технологий.

Актуальность работ по фундаментальному исследованию особенностей сети перекрестных взаимодействий между пулом РП, ФВП и медиаторами диктуется их большой практической важностью при решении задач, связанных с поиском новых эффективных терапевтических подходов, открывает возможности для прикладных фармакологических исследований в области биотехнологии и медицины. Мишенями таких исследований являются регуляция эмоционального статуса организма, уровня тревожности и депрессии, процессов памяти, давления крови и др. Таким образом, задача контроля и коррекции функционального состояния организма представляется одним из важнейших направлений медико-биологических исследований.

Разработка автоматизированных систем обработки баз данных (экспертных систем, ЭС) необходима для принятия решений в различных сферах молекулярной физиологии, фармакологии и медицины, так как позволяет получать практически полезные, прогностические знания. Подобные задачи всегда актуальны в областях, где присутствуют большие информационные массивы неоднородных и взаимосвязанных данных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования стали разработка методологии анализа сложной сети эндогенных регуляторов с использованием компьютерных технологий, систематизация экспериментальных данных и выявление основных структурно-функциональных особенностей системы РП, ФВП и медиаторов.

Конкретными задачами диссертационного исследования являлись:

Создание методологии обработки большого массива физиологических данных и учет разных уровней анализа регуляторов, разработка системы оценки и сравнения воздействий одиночных РП, биологически активных веществ (БАВ) и их констелляций на физиологические функции организма с учетом возможных индукционных процессов.

Создание необходимого программного обеспечения базы данных (БД) и модулей анализа.

Создание информационной БД на основании литературных данных по физиологическим и индукционным эффектам РП, ФВП и медиаторов.

Выявление регуляторных закономерностей на основе БД: (а) анализ сети перекрестных влияний РП с выявлением эволюционно отобранных закономерностей регуляторных контуров; (б) определение функциональной роли медиаторных систем и выявление закономерностей сопряженного регулирования медиаторами пула РП; (в) оценка потенциальных каскадных процессов РП и медиаторов, принимающих участие в управлении ряда физиологических параметров; (г) исследование структурно-функциональных особенностей действия констелляций РП и прогнозирование оптимальных сочетаний РП и медиаторов определенного функционального профиля.

Создание методологии адаптационной коррекции функционального состояния организма.

Научная новизна работы. На основании многочисленных литературных данных систематически и комплексно исследованы биологические активности основных представителей ряда семейств РП и определены их интегративные физиологические роли. Впервые разработана система векторного отображения эффектов РП в n-мерном пространстве физиологических функций, позволяющая выявлять особенности организации функционального континуума РП. Разработанное программное обеспечение БД и сопровождающих расчетных модулей позволило изучить структурно-функциональные особенности организации континуума РП и медиаторов как системы контроля физиологических функций организма. Проанализированы возможные каскадные процессы эндогенных регуляторов, позволяющие реализовывать долговременные эффекты. Выявлены группы РП со схожими функциональными свойствами. Построена информационная сеть перекрестных индукционных связей РП и медиаторов, обеспечивающая регуляторную и гомеостатическую функции организма. Впервые проанализирован сопряженный контроль 4 медиаторов и пула РП и выявлены особенности взаимодействия с различными группами РП. Впервые проведен системный анализ физиологических эффектов ФВП и тканеспецифических пептидов и предложены биомодели, лежащие в основе развития физиологических эффектов. Впервые создана теоретическая модель отбора оптимальных сочетаний РП, контролирующих параметры организма требуемым образом с минимальными побочными воздействиями и отобраны наиболее перспективные сочетания регуляторов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создана методология системного анализа множества эндогенных регуляторов, позволяющая оценить статические особенности системы РП и медиаторов, а также динамические и индукционные каскадные процессы, формирующиеся при управлении физиологическими функциями.

2. Выявлены эволюционные особенности развития континуума РП. Построена сеть индукционных взаимодействий пула РП и медиаторов, обеспечивающая оптимальное управление физиологическими процессами.

3. Проведен сравнительный анализ отличительных свойств и наличия единой стратегии в развитии физиологических эффектов одиночных РП и целостных комплексов эндогенных регуляторов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа вносит вклад в исследование структурно-функциональных особенностей регуляторного континуума. Разработанная аналитическая система, сочетающая биологические, математические и компьютерные аспекты, помогает выявлять закономерности эволюционного развития системы РП, оценивать физиологическую роль как одиночных ее представителей, так и целых констелляций РП. Кроме того, появляется возможность на основе запускаемых индукционных процессов прогнозировать динамику развития ответных реакций организма под воздействием различных РП. Выявленные оптимальные комбинации РП, регулирующие определенным образом физиологические функции организма, являются наиболее перспективными сочетаниями пептидов для последующих экспериментальных исследований при разработке эффективных терапевтических агентов.

Особая значимость придается вопросам объективного контроля функциональных состояний человека, разработки “природных” фармакологических и нефармакологических способов предотвращения и коррекции патологических состояний. Выявление “сценариев” развития каскадных реакций и типов регуляторных программ позволило построить модели и оценить фундаментальные закономерности изменения функционального статуса организма при различных патологических состояниях. Такой анализ направлен на обоснование последующих экспериментальных работ по исследованию физиологической активности РП и медиаторов, а также необходим для прикладных фармакологических исследований по поиску эффективных лекарственных препаратов. Появляется возможность уже на доэкспериментальном этапе ограничить круг рассматриваемых объектов и частично апробировать эффективность отдельных регуляторов в виде анализа возможных каскадных процессов и выявления эволюционных закономерностей развития РП-систем. Такой теоретический анализ позволит избежать хаотичности в планировании экспериментов, снизить затратность научных исследований.

Созданный программный комплекс может также служить аппаратом оценки эффектов любых других, кроме РП, биологически активных соединений, оказывающих определенное воздействие на организм.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе: 5th, 7th, 8th ECNP Regional Meetings of European Neuropsychopharmacology (Санкт-Петербург, 2000; Bucharest, Romania, 2002; Москва, 2005), 17th ECNP Congress (Stockholm, Sweden, 2004), заседания Московского Пептидного Клуба, First SIAM Conference on Computational Science and Engineering (Washington, USA, 2000), 13th International Symposium on Regulatory Peptides (Cairns, Australia, 2000), XVIII и ХХ Съезды физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001; Москва, 2007), I и II Российские симпозиумы по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), конференция “Математика. Компьютер. Образование” (Пущино, 2005), конференция “Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты” (Москва, 2005), Forum of European Neuroscience (FENS), (Vienna, Austria, 2006), 8 Международный Конгресс по адаптационной медицине (ISAM), (Москва, 2006), 7th Australian Peptide Conference (Australia, 2007), 25th European Society Comparative Physiology Biochemistry (ESCPB) Congress (Ravenna, Italy, 2008), конференция с международным участием: “Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга” (Санкт-Петербург, 2008).

Диссертация была апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

По теме диссертации опубликовано 39 печатных работ, в том числе 21 статья в рецензируемых журналах.

Работа выполнена при финансовой поддержке Гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых ученых, Российского фонда фундаментальных исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 355 страницах, содержит 58 рисунков и 18 таблиц. Список литературы включает 956 источников.

1 Материалы и методы исследования

При разработке программного обеспечения использовался язык программирования баз данных Visual FoxPro 7.0.

В работе для создания базы данных эффектов РП и медиаторов использовались литературные данные, опубликованные преимущественно за период 1970-2009 годов. Занесение экспериментальных данных любых перекрестных взаимодействий РП проводилось в соответствии со схемой, учитывающей следующие параметры: дозы и способ введения вещества, вид организма, органно-тканевые системы, направленность эффекта, рецепторные механизмы. При занесении данных о влиянии РП в основном использовались те дозы РП, которые изменяли концентрации эндогенных РП в пределах физиологического диапазона. Для оценки эффектов РП и медиаторов использовался полуколичественный подход: усиливающий эффект оценивался как (+1), ингибирующее воздействие как (-1) и отсутствие эффекта (или отсутствие литературных данных на настоящий момент) как 0.

Для расчета регрессионных моделей зависимости развития эффектов РП от времени и доз вещества мы использовали метод наименьших квадратов и метод ортогонализации Грама-Шмидта [Калиткин, 1978; Корн, 1978].

2 Результаты и их обсуждение

2.1 Разработка экспертной системы анализа физиологических эффектов РП. Создание программного комплекса

Для оценки спектров биохимических и физиологических активностей РП и медиаторов был проведен анализ большого объема литературных данных - преимущественно 1970-2009 годов, в процессе которого был установлен ряд требований, которые должны быть предъявлены к созданию информационного обеспечения базы РП и их функций. Были развиты семантико-логические схемы и установлены стратегии молекулярного управления физиологическими функциями. С учетом объектов и аксиоматики предметной области была создана методология обработки большого массива физиологических данных с учетом разных уровней анализа регуляторов. Для этого была разработана система оценки и сравнения воздействий одиночных РП, БАВ и их констелляций на физиологические функции организма с учетом возможных индукционных процессов.

Был разработан метод векторного представления эффектов РП, состоящий из трех основных частей: 1) анализ функций РП на первом шаге индукции - статическое распределение множества РП; 2) оценка каскадных процессов пептидов - динамическое распределение множества РП; 3) отбор комплексов РП определенного функционального профиля.

2.2 Статическое распределение множества РП

Если ввести n-мерное пространство, где n - число, определяющее количество физиологических функций, а каждый базисный вектор отражает одну из биологических активностей, то получим отображение физиологического состояния организма, изменяющегося под действием того или иного фактора. Так как для измерения функций используются различные эталоны, то необходимо нормировать каждое направление координатной оси (положительное и отрицательное) следующим образом:

x_i' = (x_i/?_max x_i)100%, (1)

где x_i - абсолютная величина изменения i-ой функции,

?_max x_i - максимально возможный диапазон изменения i-ой функции.

Эффект РП, как и любого другого БАВ, осуществляющего контроль физиологических процессов, можно представить как радиус-вектор. Координаты конца вектора описывают спектр эффектов данного вещества в принятом метрическом пространстве (рис.1а).

Рисунок 1. а) векторная модель эффектов РП; б) распределение пула РП

При оперировании не самим вектором, а положением точки, имеющей координаты конца этого вектора, получаем, что любой пептид представляет собой точку с координатами (x₁; x₂; x₃; …; x_n). Таким образом, существующее большое количество регуляторных пептидов в данном метрическом пространстве образует множество точек. Это множество не является равномерно распределенным. Образуются уплотнения и разряжения всей “массы” РП (рис.1б).

Вышеописанное представление множества пептидов в метрическом пространстве физиологических эффектов дает наглядную геометрическую интерпретацию, позволяющую анализировать распределение групп РП по их функциям. Важное биологическое значение имеют следующие образования: 1) области уменьшения плотности пептидов и, особенно, одиночно представленные точки (выделены квадратом на рис. 1б), выявляющие специфические ситуации, в которых нет плавного перехода от одних групп регулирующих соединений к другим; 2) области с повышенной плотностью точек или “пептидные скопления”- RPC (от англ. regulatory peptides constellation). Данные RPC-области являются множествами пептидов со сходными спектрами эффектов.

Различия воздействия РП по силе эффекта определяют степень размытости этих областей. Деление на RPC-области позволяет классифицировать множество пептидов на родственные группы по сходному спектру сопутствующих эффектов. Биологическая задача оценки близости эффектов различных пептидов сводится в свете представленного метода анализа к математической операции определения расстояния в n-мерном пространстве между точками. Такое представление значительно упрощает систематическое исследование множества регуляторов и их воздействий на организм, и, что особенно важно, дает возможность применения компьютерных приложений при анализе информации о большом числе пептидов при поиске разнообразных закономерностей.

2.3 Динамическое распределение множества РП

Следует отметить дополнительные теоретические разработки представленного метода, которые в перспективе могли бы позволить на большой БД выявить ряд скрытых закономерностей в существующей системе регуляции РП функций организма. Выше была представлена статическая модель пептидного множества без учета динамики спектра вызываемых функций. Координаты точек характеризовали условно принятые первичные физиологические эффекты, наблюдаемые при введении определенного пептида в организм. Но, как было уже многократно показано, подавляющая часть пептидов регулируют выходы других РП и БАВ. Они оказывают дополнительное влияние и, более того, могут приводить к дальнейшим индукционным воздействиям на выход других пептидов. При рассмотрении биоактивностей РП в сочетании с вызванными физиологическими эффектами на втором, третьем, …, n-ом шагах индукции происходит изменение координат в выбранном метрическом пространстве. Таким образом, с течением времени каждая точка (РП) будет двигаться по траектории, определяемой спектром физиологических функций на каждом шаге индукции. Возможностями, появляющимися при данном анализе, являются изучения общей направленности каскадных реакций конкретных РП. Динамические распределения отдельно взятых пептидов, суммируясь, дают траекторию движения RPC-областей, векторы которой отражают эволюционно-закрепленные механизмы ответных реакций организма с течением времени.

2.4 Статическое распределение множества РП в пространстве пептидов

Одной из модификаций нашего векторного анализа является оценка распределения множества РП в осях количественного изменения уровня самих пептидов. Так, появляется наглядная возможность оценить особенности межпептидных связей. Для этого, как и в случае с осями физиологических функций, нормируем каждое направление координатных осей аналогичным образом - отношение абсолютной величины изменения уровня РП к максимально возможному диапазону изменения. В этом случае значение x_i' соответствует относительному изменению концентрации РП, взятому в качестве базисного вектора. Представив множество РП в описанном n-мерном пространстве мы получаем отображение пептидного статуса организма, изменяющегося под действием того или иного фактора.

2.5 Разработка теоретической модели комплексного действия РП

и отбора требуемого сочетания пептидов

Следующим этапом работы была разработка в рамках представленного метода теоретической модели комплексного действия групп РП, позволяющей разумно ограничить “доэкспериментальный” выбор комбинаций, рассчитанных на достижение того или иного эффекта. Анализ всего спектра пептидов, необходимость функциональной классификации его, оценка роли каждого РП в формирующихся регуляторных континуумах - это рутинный и требующий большого количества ресурсов процесс. Кроме того, значительно осложняют анализ механизмов действия сложной системы регуляторов перекрестные индукционные воздействия пептидов. В таких условиях очевидно, что обработка существующей массы информации требует привлечения дополнительных математических методов с возможностью применения компьютерного анализа.

Рисунок 2. Векторы воздействия B_сум и B_станд

Отображение воздействия пептида на организм в виде вектора позволило провести соответствие между геометрической суммой векторов B_сум и комплексным влиянием группы РП (с учетом аддитивности базисных позиций физиологических функций на первом этапе обобщения). Оценкой близости вектора B_сум каждой комбинации РП и необходимого изменения функций организма, представляемого в виде вектора B_станд, может служить скалярное произведение (R) данных нормированных векторов (рис.2). Чем больше R, тем эффективнее рассматриваемый комплекс пептидов. Таким образом, получен строгий математический критерий для автоматического отбора требуемых комплексов РП с минимизированными побочными эффектами.

2.6 Разработка программного обеспечения ЭС.

Описание программного комплекса RegPep/BAC

С учетом данных требований было разработано программное обеспечение экспертной системы на языке программирования Visual FoxPro 7.0. Программный комплекс состоит из БД и программных модулей анализа: 1) модуль функциональной классификации РП, 2) модули оценки каскадных реакций, 3) модуль отбора оптимальных сочетаний РП.

БД состоит из четырех основных справочников, содержащих следующие формализованные объекты: РП и медиаторы, БАВ, физиологические эффекты, а также другие факторы влияния (возможные внешние воздействия на организм). Каждый справочник разделен на соответствующие группы, включающие схожие по свойствам элементы. При создании файлов-справочников по РП были введены дополнительные реквизиты: аминокислотные структуры РП, организмы-источники РП и литературные ссылки.

Таким образом, БД содержит четыре вида объектов, между которыми учитываются перекрестные взаимодействия. На рисунке 3 представлены возможные информационные связи базы влияний. Для хранения экспериментальных данных о взаимодействиях и литературных ссылок созданы массивы влияний, в которых учитываются вид организма, а также способы введения РП и БАВ. Дополнительно в программном обеспечении БД был создан модуль, позволяющий на основе экспериментальных данных о динамике эффектов РП и БАВ рассчитывать регрессионные коэффициенты зависимости эффекта от времени и величины влияющего объекта.

Рисунок 3. Информационные связи базы влияний

Был разработан программный модуль функциональной классификации РП. Для исследования индуцирующих и ингибирующих воздействий РП на другие пептиды, медиаторы и БАВ, а также для анализа сложных нейроэндокринных сетей регуляции функций организма были разработаны программные модули оценки каскадных процессов на качественном и количественном уровне.

Разработанный математический аппарат оценки перспективности комплексов РП был положен в основу создания программного модуля отбора эффективных комбинаций РП. Этот модуль позволяет на БД большого объема осуществлять поиск оптимальных пептидных констелляций с точки зрения возможного клинического применения и отбрасывать те, которые не заслуживают первоочередного последующего экспериментального изучения.

3 Систематизация и анализ литературных данных

3.1Создание БД по физиологическим эффектам РП, ФВП и медиаторов

В базу данных из различных литературных источников 1970-2009 гг. была занесена информация по эффектам 26 РП, относящихся к основным семействам РП и связанных с проблематикой диссертационной работы: нейропептид Y (NPY), дельта-сон индуцирующий пептид (DSIP), кортиколиберин (CRF), вазоинтестинальный пептид (VIP), адренокортикотропный гормон (ACTH), вазопрессин (VP), окситоцин (OT), бета-эндорфин (beta-End), лей-энкефалин (leu-Enk), натрийуретический пептид предсердия (ANP), вещество P (SP), галанин (Gal), альфа-меланоцит стимулирующий гормон (alpha-MSH), пептид-ингибитор связывания диазепама (DBI), динорфин (Dyn), холецистокинин-8 (CCK-8), холецистокинин-4 (CCK-4), пролактин (PL), соматостатин (SS), тиролиберин (TRH), гонадолиберин (GnRH), меланостатин (MIF-1), нейропептид K (NPK), ангиотензин-II (ATII), кальцитонин-ген-родственный пептид (CGRP), нейротензин (NT). Каждый из перечисленных РП является наиболее известным и изученным представителем того или иного класса, отражающим основной спектр биологических активностей семейств. Кроме того, в БД была сведена информация по физиологическим эффектам и индукционным воздействиям 4 непептидных медиаторов - дофамина, серотонина, норадреналина, ацетилхолина.

3.2 Определение интегративной роли различных РП, ФВП

Исследование функционального континуума РП с помощью ЭС включило несколько уровней анализа: 1) расширение области исследования, охват множества семейств РП с ограничением зоны оценки рецепторных, тканевых и других основ; 2) усиление детализации процессов с одновременным уменьшением области исследования. Особенности как системных параметров, так и детальных фактов важны, т.к. позволяют всесторонне охватывать всю совокупность регуляторных процессов.

3.2.1 Системный уровень анализа роли РП

Методом функциональной классификации на основе информации БД была проведена оценка роли каждого из 26 РП в регуляции состояния тревожности, депрессии, памяти, пищевого поведения, уровня сна/бодрствования, судорожной активности, давления крови и др. В качестве демонстрации статического распределения РП на рисунке 4 представлено множество точек, отображающих реальное распределение 26 представителей избранных семейств РП в пространстве функций тревожности, памяти и депрессии. В работе был проведен анализ формирующихся RPC-областей, а также исследованы особенности объемного распределения точек в выбранных трехмерных пространствах. Необходимо отметить, что в нашем случае RPC-области ограничены из-за относительно небольшого количества отобранных пептидов, однако они дают представление об устойчивых сочетаниях физиологических функций (координаты RPC-области) и о спектре семейств участвующих в формировании обозначенных скоплений точек.

Рисунок 4. РП в метрическом пространстве тревожности, памяти и депрессии

1-NPY, 2-DSIP, 3-CRF, 4-VIP, 5-ACTH, 6-VP, 7-OT, 8-beta-End, 9-leu-Enk, 10-ANP, 11-SP, 12-Gal, 13-alpha-MSH, 14-DBI, 15-Dyn, 16-CCK-8, 17-CCK-4, 18-PL, 19-SS, 20-TRH, 21-GnRH, 22-MIF-1, 23-NPK, 24-AT II, 25-CGRP, 26-NT.

3.2.2 Ограниченный системный анализ

Функциональный континуум РП, усиливающих тревожность

Методология системного анализа континуума РП может включать более прицельное исследование ограниченного комплекса РП, объединенных некоторой общей физиологической функцией. Нами был исследован функциональный континуум РП, усиливающих тревожность (анксиогенные РП). Эмоции тревожности и страха выполняют, как известно, ряд позитивных функций, вызывая настороженность и подготавливая реакции человека и животных на ожидаемые воздействия разнообразных факторов. Вместе с тем, превышение оптимального уровня этих эмоций может быть источником патологических процессов. РП являются важными участниками развития тревожности и страха, и воздействие на РП может быть полезным как для усиления, так и для снижения этих эмоций в различных ситуациях и состояниях организма. Необходимо исследование комплекса основных РП-анксиогенов и дополнительных физиологических эффектов, которые могут сопровождать действие каждого из них и их сочетаний на тревожность и страх. Такой анализ облегчает создание лекарственных аналогов РП, антагонистов и агонистов, непептидных имитаторов РП (пептоидов) и, наконец, развитие метода инверсной иммунорегуляции, направленного на прицельное длительное ингибирование определенных эндогенных РП.

На основании БД были выделены ключевые звенья функционального континуума пептидов, участвующих в формировании тревожно-фобических состояний. Так, основными анксиогенными пептидами являются: CRF, DBI, CCK-4, CCK-8, alpha-MSH и VP. В отношении VP и CCK-8 существуют данные и о некоторой анксиолитической (снижание тревожности) активности. Для оценки особенностей организации функционального континуума РП, усиливающих тревожность, были сопоставлены спектры их биоактивностей и выявлены преимущественные комплексы сопутствующих физиологических эффектов. Кроме того, были обозначены такие сочетания эффектов, которые не затрагиваются выбранной системой регуляторов-анксиогенов.

3.2.3 Детальный уровень анализа роли РП. Прямые эффекты NPY

Для более четкого обозначения функциональной роли выраженного анксиолитика NPY в контроле процессов организма был проведен детальный анализ спектра биологической активности данного РП в свете рецепторных механизмов воздействия. Спектр свойств NPY является весьма обширным и затрагивает регуляцию целого ряда важных процессов организма. Это породило немало идей о применимости NPY, его фрагментов, аналогов, агонистов и антагонистов в качестве терапевтических средств. Исследования влияния NPY на функции нервной системы показали его выраженный анксиолитический и противосудорожный эффекты, а также, но в значительно меньшей степени, антидепрессантное воздействие. При состояниях, сопровождающихся увеличением тревожности, перспективны достаточно стабильные аналоги с высоким сродством к Y-1 рецепторам, при повышенной судорожной готовности - с воздействием на рецепторы Y2. Заслуживает внимания также использование NPY и его аналогов в числе препаратов, усиливающих процессы формирования памяти. В последнем случае важна именно цельная структура NPY, так как происходит подключение каскада индуцированных РП, способных обеспечить долговременный эффект. Ограничением для применения NPY и его аналогов в качестве анксиолитического средства является наличие гипертонии, что часто сопутствует стрессорным состояниям. Это важно учитывать, так как именно Y-1 тип рецепторов опосредует значительную вазоконстрикцию. Естественно, к противопоказаниям могут быть отнесены и нарушения мозгового кровообращения, а также ишемическая болезнь сердца, нарушения сердечного ритма, миокардиты и дистрофии миокарда. Вероятным противопоказанием является также булимия и ожирение.

Помимо приведенных выше биологических активностей NPY обладает еще целым рядом воздействий на другие системы организма. Он является неотъемлемым элементом баланса эндогенных регуляторов, обеспечивающего необходимые уровни липогенных факторов и метаболической активности. Модулирующее влияние NPY проявляется в воспалительных процессах и в формировании болевой чувствительности, а также в регуляции полового поведения и в функционировании репродуктивной системы. Важно отметить значимость NPY для циркадианных процессов в организме, когда осуществляется непрямой контроль активности целого ряда биологических систем.

Проведенный обзор эффектов NPY дал сложную картину многообразия воздействий NPY на организм. Обобщая представленные данные о воздействии NPY на организм можно сделать вывод о том, что NPY и его аналоги могут быть в принципе применены в качестве анксиолитических препаратов с большим “набором” дополнительных позитивных функций. Однако такое “моноприменение” может сопровождаться негативными побочными эффектами. Избежать подобных ситуаций можно посредством совместного введения NPY с другими РП, которые корректировали бы действие NPY необходимым образом.

3.3 Информационная база по взаимодействиям медиаторов и РП

Для оценки взаимодействий “классических” медиаторов с пулом РП и определения их роли в сопряженном контроле физиологических функций организма был проведен анализ их индуцирующих и ингибирующих воздействий на континуум пептидов. DA, NE, 5-HT и ACh охватывают различные грани организации медиаторной системы - структурную, функциональную и пространственно-временную. Такое эквивалентное отображение позволяет оценить основные закономерности регулирования индукционных процессов медиаторами.

Здесь стоит отметить, что существующие функционально-топологическое и структурное разграничения между медиаторами и нейропептидами порой бывают “размыты”. Так, для нервной системы беспозвоночных весьма характерно численное преобладание нейронов, содержащих нейропептиды над нейронами, содержащими какой-либо классический медиатор [Иерусалимский, 2009]. Для большинства данных нейропептидов не доказано, что они являются медиаторами, т.е. непосредственно выделяются в синапсе. Однако внесинаптическое выделение нейроактивных веществ типично для беспозвоночных. Более того, внесинаптическое выделение вещества из конкретного нейрона может сочетаться с его синаптическим выделением.

При подробном анализе структурных аспектов медиаторов и РП также выявляются общие черты [Замятнин, Воронина, 1998]. DA, NE, 5-HT, а также адреналин и гистамин из-за отсутствия в них пептидных связей не являются веществами пептидной природы. Однако они представляют собой химические аналоги аминокислотных остатков Tyr, Trp и His и могут эффективно связываться с определенными рецепторными структурами. Молекулы всех этих веществ обладают положительно заряженным радикалом. Более того, существует много примеров тому, что эти молекулы, известные больше как нейромедиаторы, в эндокринной системе осуществляют функции рилизинг-факторов тропных гормонов. Медиатор ACh также содержит положительно заряженную группу. Таким образом, функциональные свойства низкомолекулярных нейромедиаторов реализуются в первую очередь за счет участия положительно заряженных радикалов в механизмах связывания с соответствующими рецепторными структурами на основании тех же физико-химических закономерностей, что и у олигопептидных структур. Таким образом, DA, NE, 5-HT могут быть рассмотрены как “монопептиды”, для которых число аминокислотных остатков равно 1. Рассматривая их в ряду континуума РП можно проследить всю сеть сложных индукционных взаимодействий от “монопептидных вершин” до достаточно протяженных аминокислотных структур. Таким образом, представляется наглядная возможность отследить, как по мере удлинения пептидной цепи меняется регуляторная роль соединений, как смещается спектр их индукционных связей.

3.3.1Дофамин, ФВП и эмоциональный статус организма

На основании многочисленных литературных данных об эффектах плацебо и о связи положительных эмоций (ПЭ) с уровнем таких нейромедиаторов, как DA и ряда эндогенных РП-ФВП были проанализированы нейрохимические механизмы, связывающие положительные эмоции и патологию. Недостаточность центральных DA-систем играет важную роль в патогенезе депрессивного синдрома. С другой стороны, активность тех же систем обуславливает формирование гедонических реакций. Было убедительно показано, что значимая часть большинства точек мозга, через которые реализуется самораздражение, состоит из DA-ергических нейронов [Шабанов, 2002]. Таким образом, DA-система играет ключевую роль в формировании эмоционального статуса организма, определяя уровень ПЭ. Многие пептидные регуляторы, основательно изученные как индукторы подкрепления и вознаграждения - опиоиды, NT, SP, NPY, alpha-MSH, анандамид и другие эндогенные лиганды каннабиноидных рецепторов, являются стимуляторами выхода DA и повышения его уровня. Вместе с тем нельзя пока исключить и какие-либо независимые от DA связи с ПЭ нейротензина, NPY, опиоидов и эндогенных лигандов каннабиноидных рецепторов.

3.3.2 Сеть индукционных взаимодействий между

медиаторами и пулом РП

На основании информационной базы были построены схемы перекрестных влияний DA, NE, 5-HT, ACh и пула РП. Данные схемы позволили визуализировать возможные информационные потоки между эндогенными регуляторами и обозначили структурно-функциональные характеристики медиаторно-пептидного континуума. Пример информационных сетей индукционных связей DA, 5-HT и 26 РП представлен на рисунках 5, 6 (сплошными стрелками обозначен индуцирующий эффект, пунктирными - ингибирующий эффект).

Были введены характеристики медиаторов как системоорганизующих факторов. Исследования перекрестных индукционных эффектов 4 медиаторов с различными представителями семейств РП выявили, что между DA, NE, ACh и отдельными РП преимущественно наблюдаются взаимодействия одной направленности (позитивной или негативной). Так, DA влияет однонаправлено на 60% от пула пептидов, на который он воздействует, NE - на 81% , а ACh - на 71%. Кроме того, ACh оказывает преимущественно однонаправленные стимулирующие эффекты на РП: стимулирует 67% пептидов из тех, на которые оказывает воздействия. Вместе 3 медиатора DA, NE, ACh образуют остов директивных управляющих программ на разных уровнях систем организма.

В противовес им 5-HT образует единый, множественно-распределенный (ЦНС, периферия, ЖКТ, тромбоциты и др.) остов модулирующей активности на пул РП. Анализ литературных данных дает представление о сложной связи 5-HT с РП. Между 5-HT и каждым РП отмечаются взаимодействия различной направлен-ности. Так, 5-HT оказывает двунаправлен-ные эффекты на 75% РП от пула пептидов, на который он воздействует. “Насыщенная” связь 5-HT с РП отражает тонкую регуляцию серотонином множества РП. 5-HT завязан на мелатонин, который является базисом циркадных ритмов и выступает генератором частоты и синхронизации различных процессов в организме. Кроме того, мелатонин известен своими многочисленными индукционными взаимодействиями с нейромедиаторами, РП, гормонами и т.д.

1

Были проанализированы системы обратных положительных и отрицательных связей между медиаторами, ФВП и РП. Образование обратных связей между регуляторами позволяет усилить или уменьшить их эффекты, а также изменить их временной характер - пролонгировать или ограничить во времени эффекты.

1

Рисунок 6. Схема взаимо-действия 5-HT с РП

3.4 Сопряженное взаимодействие DA, NE, 5-HT, ACh и системы РП

На следующем этапе работы был проведен анализ особенностей сопряжен-ного функционирования DA-, 5-HT-, NE- и ACh-систем с пулом РП. Была предпринята попытка сопоставить все данные по индуцирующим и ингибирую-щим перекрестным влияниям обозначен-ных четырех медиаторных систем и РП, а также показать принципиально возмож-ные схемы каскадных путей регулирова-ния уровня DA, NE, 5-HT, ACh и РП. Такой анализ, несмотря на несколько условный характер (необходима дальнейшая детальная оценка особенностей тканевого расположения, концентрации веществ и т.д.), позволил наглядно представить схему взаимоотношений 4 медиаторов и групп РП и визуализировать особенности организации информационных потоков в системе контроля обозначенных эндоген-ных регуляторов.

3.4.1 Особенности взаимодействия DA- и 5-HT-систем

Были определены особенности системы сопряженного функционирования двух медиаторов DA и 5-HT на нескольких различных уровнях: 1) формирование систем обратных положительных и отрицательных связей между DA и 5-HT через ФВП и РП; 2) сопряжение разнонаправленных воздействий со стороны функционального континуума РП на DA и 5-HT; 3) основное направление эффектов обозначенных систем на физиологические параметры организма; 4) онтогенез медиатор-специфических систем нейронов; 5) оппонентные взаимодействия между 5-HT и DA как функциональных систем; 6) определение природы результирующих векторов взаимодействия DA и 5-HT с пулом РП, формирующей общую направленность каскадных процессов и, в конечном счете, управление физиологическими параметрами организма.

1. Анализ индукционных схем обозначил существование в организме сложных систем обратных положительных и отрицательных связей между DA, 5-HT, ФВП и РП. Были выделены обратные положительные связи между DA и 5-HT через такие ФВП, как NT и SP. Отрицательная обратная связь может осуществляться через Gal, выраженный индуктор депрессионных состояний, и CRF - пептид гормональной оси стресса.

2. С помощью векторного метода отображения эффектов РП было проанализировано распределение 26 РП в пространстве функций контроля уровня 5-HT и DA. Был выявлен ряд фокусов усиленного дублирования (ФД) определенных сочетаний индукционных эффектов РП. Наиболее выраженным ФД сходящихся влияний является одновременное подавление 5-HT-системы и усиление DA-системы. Существует не менее 13 разных путей реализации данного сочетания эффектов: SP, NT, Gal, NPY, CCK-4, CCK-8, alpha-MSH, CRF, beta-End, leu-Enk, OT, SS, TRH. Было выдвинуто предположение, что такое эволюционно-отобранное сочетание индукционных эффектов имеет важное значение для определения эмоционального статуса организма.

3. 5-HT-, DA- (а также NE-) системы являются ключевыми для поощрения и подкрепления, вследствие чего они приобретают оценочную функцию и принимают участие практически во всех видах поведения. Показано, что эмоционально-положительные состояния формируются усилением активности DA (NE, опиоидной)-систем и уменьшением активности 5-HT-системы мозга [Базян, 2000]. И наоборот, эмоционально-отрицательные состояния формируются усилением активности 5-HT-системы и уменьшением активности DA (NE, опиоидной)-систем мозга. Таким образом, баланс DA- и 5-HT-систем обеспечивает оптимальный эмоциональный/физиологический статус организма.

Был проведен анализ сопряженного воздействия 5-HT и DA на гипоталамо-гипофизарно-адреналовую (ГГА) и иммунную системы, имеющие прямые или косвенные связи с ПЭ. Были выявлены оппонентные взаимоотношения двух систем: 5-HT способен запускать ГГА-ось, которая опосредует стрессорные реакции, и вызывать иммуносупрессию, в то время как DA ограничивает ГГА-ось и оказывает иммуностимулирующее воздействие.

4. Модулирующая роль 5-HT по сравнению с профилем DA хорошо прослеживается в экспериментах по исследованию онтогенеза медиатор-специфических систем нейронов беспозвоночных. Дофаминовая система как у ювенильных, так и у взрослых особей улитки не меняется по количеству нейронов, обеспечивая одинаковое для разного возраста развертывание определенных форм поведения животного [Иерусалимский, 2009]. В то же время ювенильные животные (для них характерен пониженный уровень 5-HT) в меньшей степени проявляют реакции на потенциально опасный стимул и отличаются большей директивностью поведения. С увеличением числа 5-HT-нейронов (с возрастом) организм получает новые возможности модификации оборонительного поведения, более тонкой настройки ответной реакции на внешние воздействия (усиливается модулирующий характер).

5. Было показано, что эти две медиаторные системы кодируют информацию об отрицательном и положительном подкреплении, формируя фазические и тонические компоненты сигнала, и обеспечивают формирование позитивных и негативных эмоций [Daw, 2002].

6. На последнем уровне анализа были введены интегральные характеристики сопряженности функционирования DA- и 5-HT-систем. Высказано предположение о DA как о директивном (направляющем) агенте, а о 5-HT-системе как о модулирующей системе. Было предположено, что между 5-HT- и DA-системами существуют оппонентно-реципрокные взаимоотношения, обеспечивающие оптимальный эмоциональный/физиологический статус организма. При этом под оппонентной компонентой мы понимаем противоположные по сути явления: а) фазические и тонические компоненты сигнала, б) директивное и модулирующее индукционные воздействия. А под реципрокной компонентой - взаимозависимые динамические процессы: а) двухкомпонентный вклад систем в каждый сигнал, б) двустороннее воздействие на пул ФВП и РП.

3.4.2 Сочетанное функционирование четырех медиаторов

Типы регуляторных программ между медиаторами и континуумом РП. При анализе сложной многоуровневой сети РП-медиаторных индукционных связей были определены модели регуляторных программ, которые, с одной стороны, позволили понять основные принципы функционирования множества эндогенных регуляторов, а с другой стороны, обозначили каналы прицельного терапевтического управления биопроцессами.

Все модели регуляторных программ были рассмотрены на системном (организм), на информационном и на профильном (конкретная форма регулирующих воздействий) уровнях.

В первом случае анализ проводился на системном уровне, когда группа ЭнС определялась шириной охвата спектра основных поведенческих реакций и физиологических процессов. Под “кругом-ОР” было представлено образное отображение перебора всех комбинаций ответных реакций на внешние и внутренние сигналы и комбинаций индукционных связей. Медиаторы имеют выходы практически на все РП, образуя “монопептидную” управленческую верхушку круга-ОР. Также в этот круг входит ACh, не являющийся “монопептидом”, но содержащий подобно им положительно заряженные боковые радикальные группы. Регуляторные программы РП скорее стоит отнести к секторальному принципу контроля биопроцессов со значительным сужением глобальных (общесистемных) реакций и увеличением специализированных программ. Однако некоторые РП, такие как опиоиды, а также ряд гормонов тоже образуют управленческие структуры круга-ОР, только более внутренней (метаболические процессы) направленности. Таким образом, можно выделить два типа системных программ - круговое управление (КУ) и секторальное управление (СУ) биопроцессами организма.

Во втором случае, при анализе моделей регуляторных программ на информационном уровне определяющее значение приобретает смена типа управления, “кадровое движение”. В этом случае каждая позиция ЭнС в континууме всех регуляторов определяется определенным набором “прав” и “обязанностей”. Был выделен ряд моделей, которые позволили визуализировать основные тенденции формирования каскадных процессов.

В третьем случае, при анализе моделей регуляторных программ на профильном уровне определяющее значение приобретает сама форма управления физиологическими параметрами и РП как передаточной функции на разных шагах индукции. Однако в рамках этого исследования были разобраны в основном одношаговые программы между медиаторами и РП. Были выделены следующие модели:

1) “Узел проскальзывания (сужение зоны влияния)”. Регуляторная программа переключения множественных индукционных входов на одиночные индукционные выходы. Пример - NE и 5-HT. Первый является “узлом проскальзывания (сужение зоны влияния)” у опиоидов, а второй - у остальных ФВП.

2) “Узел проскальзывания (расширение зоны влияния)”. Регуляторная программа переключения одиночных индукционных входов на множественные индукционные выходы. Пример - leu-Enk, который является “узлом проскальзывания (расширение зоны влияния)” для реализации любой конфигурации эффектов на медиаторы при определенных внешних условиях.

3) “Первично инициирующий источник”. Реализация “фонтанирующей” регуляторной программы нарастания от нулевых индукционных входов до максимально возможного спектра выходных модулирующих воздействий. Пример - CCK-8, пептид “паники, фобических состояний”. Данный РП, при отсутствии медиаторного контроля “фобических” РП, со своей стороны модулирует уровни всех 4 медиаторов. Можно предположить, что необходим резервный “пустой” (и в тоже время потенциально “полный”) канал для ситуаций абсолютной новизны-паники, когда должен отсутствовать (или задерживаться) отработанный механизм поведенческой целостной реакции данных медиаторов.

4) “Равномерная передача”. Регуляторная программа, которая осуществляет равноценный переход от одного веера индукционных связей к другому. Большинство представленных в базе данных РП относятся к этому типу.

5) “Зона молчания”. Регуляторная программа РП, который сам не оказывает воздействия ни на один из обозначенных медиаторов, и они, в свою очередь, “игнорируют” его. Пример - NPK.

6) “Предпочтение (игнорирование) определенных РП и медиаторов”. Регуляторная программа реализации выборочной фокусировки индукционных связей на и от конкретных ЭнС. Пример - значительные модулирующие активности 5-HT и ACh при воздействии на группу вазоактивных РП и практически минимальное участие в этом процессе DA и NE.

7) “Предпочтение (игнорирование) определенного типа воздействия”. Регуляторная программа предпочтения стимулирующего или ингибирующего индукционного входа (выхода). Пример - PL, который собирает на себе больше ингибирующих воздействий медиаторов. Или TRH, формирующий, в основном, стимулирующие влияния на медиаторы.