Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана (бетулоновой кислотой и ее производными)

Таким образом, курсовое введение БК, и особенно ее аланинамидных производных в постцитостатическом периоде, уменьшало признаки токсического нефроза, оказывая позитивное влияние на состояние нефрона.

Морфологическое исследование печени показало, что на 15-й день после введения комплекса цитостатических препаратов ее балочная структура в основном сохранялась, однако в ней наблюдались выраженные альтеративные изменения: отек интерстиция, полнокровие вен, значительное сужение синусоидальных капилляров, просвет которых местами не определялся. Отмечены дистрофия гепатоцитов, фокальные микронекрозы, наиболее выраженные в центральных отделах долек.

Объемная плотность дистрофических и некротических изменений под влиянием цитостатиков достигала 64,82 и 11,37% объема паренхимы (табл. 13). У животных в группе с изолированным введением цитостатических препаратов наблюдалось снижение, относительно контроля, объемной плотности синусоидов на 46,43%, увеличение цитоплазмы гепатоцитов на 15,28%, снижение ядерно-цитоплазматического отношения на 20%. Количество двуядерных гепатоцитов снизилось на 38,63%, что свидетельствует о депрессии пролиферативных процессов.

Введение тритерпеноидов способствовало восстановлению гистологической картины печени. В печеночной паренхиме наблюдалось уменьшение отека, увеличение просвета синусоидов, сокращение количества некротизированных участков, цитолитических повреждений гепатоцитов, количества клеток с пикнотическими ядрами. Отмечено умеренное неравномерное полнокровие сосудов (центральных вен) и синусоидных капилляров преимущественно в центре долек. Тритерпеноиды достоверно уменьшали степень выраженности альтеративных изменений гепатоцитов, вызванных введением цитостатических препаратов. Введение БК вызвало достоверное уменьшение в 11,5 раз объемной плотности гепатоцитов в состоянии дистрофии относительно референсной группы (ПХТ - 64,8%, БК - 5,6%). В группах животных с введением в-алаБК и Ме-в-алаБК также наблюдалось достоверное снижение объемной плотности дистрофических изменений в 4 и 6,6 раза соответственно, однако по степени выраженности гепатозащитного действия аланиламидные производные уступали БК. Введение БК на фоне ПХТ уменьшало в 6,6 раза показатель объемной плотности некрозов (ПХТ - 11,3%, БК - 1,7%). Введение животным аланинамидных производных БК после ПХТ сопровождалось недостоверным снижением объемной плотности некрозов. Согласно данным таблицы, все тритерпеноиды восстанавливали до нормы объемную плотность синусоидов.

Нормализация структуры печени под влиянием БК и ее производных сопровождалась увеличением объемной плотности ядер при сохранении нормальной плотности цитоплазмы, что привело к достоверному повышению ядерно-цитоплазматического отношения в этих группах. Полученные результаты указывают на усиление синтетических процессов в клетках печени, что свидетельствует о повышении их функциональной активности. В связи с этим обращает на себя внимание, что Ме-в-алаБК в большей степени, чем остальные тритерпеноиды увеличивал ядерно-цитоплазматическое отношение и количество двуядерных гепатоцитов.

Данные морфологического анализа свидетельствуют о том, что коррекция лупановыми тритерпеноидами структурных повреждений в тканях и клеточных компартментах в результате изолированного введения цитостатиков или их комбинации здоровым животным, обеспечивается в основном противовоспалительным действием данных агентов.

Основываясь на данных различных исследователей, свидетельствующих об индукции тритерпеноидами цитопротекторных сигнальных путей в ответ на действие провоспалительных факторов, можно предположить, что производные бетулоновой кислоты на фоне введения цитостатиков активируют сигнальный путь Nrf2.

Этот вывод подтверждается данными группы исследователей, которые обнаружили у ряда цианопроизводных бетулоновой кислоты способность подавлять индуцированную макрофагами синтазу окиси азота и активировать NAD(P)H хинон оксидоредуктазу и гемоксигеназу - ферменты второй фазы репарационного ответа, с помощью которых клетки подавляют развитие электрофильного или окислительного стресса (Liby K. Et al., 2007).

Еще одним доказательством выдвинутого предположения являются результаты исследования, в котором изучалось влияние тритерпеноида олеонанового типа ODDO-Im на развитие острого Т-клеточного воспаления в печени мышей, вызванного введением конковалина А (Osburn W.O. et al., 2008).

В данной модели развитие иммуногенного воспалительного процесса сопровождается выделением активированными макрофагами про-воспалительных цитокинов, что приводит к некрозам гепатоцитов.

Используя различные линии нокаутных мышей, авторы показали, что ODDO-Im уменьшает воспалительное повреждение печени путем активации генов сигнального пути Nrf2, уменьшая при этом экспрессию про-воспалительных генов и снижая секрецию эффекторных клеток на поздних стадиях воспаления.

Эти результаты продемонстрировали, что усиление сигнализации Nrf2 обеспечивает мощную защиту печени от воспалительного и иммуногенного некроза гепатоцитов.

Другой возможной мишенью лупановых соединений могут являться белки-регулятоы сигнального пути NFкB, выступающего ключевым регулятором воспалительного процесса и контролирующего экспрессию различных цитокинов и факторов адгезии (Lu H. Et al., 2006).

Лупановые тритерпеноиды - бетулин и бетулиновая кислота, как было показано на культуре стимулированных IFN-г макрофагов, подавляют активность выделяемых ими провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-б, а также снижают активность индуцибельных синтазы окиси азота и циклоосигеназы-2 (Suh N. Et al., 1998, 1999).

Аналогичные результаты были получены на такой же модели для лупеола (Fernandes M.A. et al., 2001) и ряда олеонановых и урсановых тритерпеноидов (Honda T. et al., 1997). Приведенные данные могут являться доказательством кардиопротекторного действия олеоноловой и урсоловой кислот в модели оксидативного повреждения миокарда, вызванного введением некрозогенного агента изопротеринола (Senthil S. Et al., 2007). В последнем случае тритерпеноиды существенно снижали количество некротизированных клеток и уровень ТБАС в ишемизированном миокарде.

Полученные нами данные свидетельствуют о вовлеченности иммунной системы в механизмы корректирующего влияния лупановых тритерпеноидов.

На это указывают модулирующий эффект бетулоновой кислоты и ее производных на численность клеток гранулоцитарно-моноцитарного ряда, являющихся эффекторами иммунных и воспалительных реакций, а также выявленное тимус-протекторное действие этих агентов.

Сообщалось, что иммунорегулирующая активность характерна также для других тритерпеноидов - олеаноловой и урсоловой кислот (Rafael TJ Kuttan, 2003) и их производных (Hsu H-J et al., 1997), бетулиновой и бетулоновой кислот и их амидов (Покровский А.Г. и др., 2001).

На тесную связь противовоспалительных и иммунокорректорных свойств лупановых агентов указывают данные (Zdzisinska B. Et al., 2003), полученные на культуре цельной крови человека. Они показывают, что бетулиновая кислота не влияет на продукцию секретируемого стимулированным моноцитами TNF-б, но уменьшает соотношение IFN-г/ IL-10.

Принимая во внимание, что про-воспалительный IFN-г секретируется популяцией Th1 клеток, а противовоспалительный IL-10 - популяцией Th2, то можно сделать заключение о сложном характере регуляторных взаимодействий тритерпеноидов с их молекулярными мишенями в клетке.

Таким образом, на основании приведенных данных можно предположить, что механизмы цитопротекторного действия лупановых тритерпеноидов могут обеспечиваться их регулирующим влиянием на внутриклеточную сигнальную трансдукцию, а также на клеточные и гуморальные факторы иммунной системы, контролирующие процессы воспаления и оксидативного стресса.

Оценка политаргетного действия тритерпеноидов в условиях цитостатическойполихимиотерапии СНОР у животных с перевиваемыми опухолями.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис (LLC) на фоне ПХТ.

В печени животных с перевитой карциномой Льюис выявлены морфологические изменения, связанные с общим и местным влиянием опухоли, а также изменения, обусловленные проведением ПХТ и введением изучаемых химических соединений.

У мышей всех групп наблюдались очаговые клеточные метастазы, часто в просвете синусоидов с активным делением в них опухолевых клеток.

У мышей с LLC (контрольная группа) отмечались в разной степени выраженности проявления регенераторно-пластической недостаточности гепатоцитов (дистрофия, атрофия некоторых клеток).

Ведущим типом поражения гепатоцитов была очаговая «опустошенность» цитоплазмы, ассоциированная с лизисом и секвестрацией гранул гликогена. В то же время вблизи портальных трактов отмечалась пролиферация гепатоцитов, появление небольших двуядерных клеток с ацидофильной цитоплазмой и гиперхромными ядрами.

Появление мелких двуядерных гепатоцитов в условиях метастазирования свидетельствует о сохранении их регенераторного потенциала.

Нарушения гемодинамики проявлялись в виде неравномерного полнокровия и частичной окклюзии просвета синусоидов. Стенки сосудов были PAS-положительными, толуидиновый синий вызывал их метахроматическое окрашивание, а при окраске по методу ван Гизона соединительная ткань в этих структурах не выявлялась.

На полутонких срезах в просветах синусоидов обнаруживались звездчатые клетки и полинуклеарные лейкоциты. ПХТ обусловливала массивную гибель гепатоцитов с формированием крупных очагов некроза.

Во многих гепатоцитах отмечалась крупно- и мелкокапельная липидная инфильтрация цитоплазмы (размеры жировых капель иногда были сопоставимы или превышали размеры ядер).

Гликоген в виде разной степени интенсивности PAS-положительных скоплений выявлялся преимущественно в гепатоцитах перипортальных зон; во многих гепатоцитах наблюдалось истощение запасов гликогена с формированием в этих участках «оптически» пустых пространств.

Отмеченные морфологические изменения гепатоцитов характерны и для действия других лекарственных препаратов и расцениваются некоторыми авторами как стереотипные (Непомнящих Г.И. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2010).

При проведении ПХТ на 88% возрастала доля моноцеллюлярных некрозов гепатоцитов в центролобулярных зонах (табл. 14). Доля синусоидов со свободными просветами уменьшалась на 21%.

Введение тритерпеноидов на фоне ПХТ обусловливало изменения структуры гепатоцитов и синусоидов. При введении БК и в-алаБК доля дистрофически измененных гепатоцитов существенно не изменялась по сравнению с контролем и ПХТ, но выраженность изменений была меньше: в гепатоцитах практически отсутствовали зоны «опустошения» цитоплазмы и липидная инфильтрация, отмечалась незначительная субплазмалеммальная вакуолизация цитоплазмы. Доля моноцеллюлярных некрозов после введения БК и в-алаБК уменьшилась соответственно на 42 и 53% при сравнении с ПХТ, но не с контролем. Введение мышам МеБК и Ме в-алаБК на фоне ПХТ не приводило к существенному снижению объемной плотности некротически измененных гепатоцитов по сравнению с ПХТ.

Сочетанное воздействие всех тестируемых соединений с ПХТ вызывало изменения синусоидального русла и перицеллюлярных пространств (пространств Диссе). В ряде случаев отмечалось склерозирование пространств Диссе с разрастанием пучков коллагеновых волокон вокруг гепатоцитов. Склеротические процессы сопровождались появлением в просветах синусоидов и перисинусоидально звездчатых клеток с липидными включениями в цитоплазме. Повреждение гепатоцитов и активация медиаторами воспаления звездчатых клеток, приводящая к усилению синтеза коллагена, являются основными факторами, вызывающими нарушение архитектоники и уменьшение (или прекращение) транссинусоидального обмена (Непомнящих Д.Л. и др., 2006; Жукова Н.А. и др., 2008; Молодых О.П. и др., 2008).

Коллагенизацию пространств Диссе и «капилляризацию» синусоидов после проведения ПХТ и введения тритерпеноидов можно рассматривать в качестве компенсаторно-приспособительного ремоделирования печени в ответ на действие токсических соединений. Снижение транссинусоидального обмена в условиях повышенного содержания в крови цитопатических агентов способствует уменьшению повреждения гепатоцитов, но одновременно замедляет приток пластических веществ и факторов роста, необходимых для внутриклеточной и клеточной регенерации.

ПХТ и ее сочетания с исследуемыми химическими агентами вызывали существенное уменьшение объемной плотности метастазов в просветах синусоидов. Наиболее значительно объемная плотность метастазов уменьшалась после сочетания ПХТ с тритерпеноидами: после сочетания с БК - на 50%, после сочетания с МеБК и Ме в-алаБК - на 43% по сравнению с LLC (p<0,05). Как следствие, введение БК, МеБК и Ме в-алаБК на фоне ПХТ способствовало увеличению объемной плотности синусоидов со свободными просветами как по сравнению с LLC (на 5 - 11%), так и по сравнению только с ПХТ (на 33 - 40%).

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию печени мышей с перевитой лимфомой RLS. Лимфома RLS является злокачественной неходжкинской крупноклеточной лимфомой, относительной резистентной к ЦФ. В печени всех животных выявлялись множественные метастазы, расположенные преимущественно перипортально. В центре и по периферии метастатических очагов наблюдались мелко- и крупноочаговые фибриноидные некрозы гепатоцитов, инфильтрированные мононуклеарами. Гепатоциты находились в состоянии дистрофии различной степени выраженности. Под влиянием комплекса цитостатиков в печени развивался гепатоз, сопровождавшийся ростом некротических повреждений гепатоцитов (на 28% по сравнению с контролем) (табл. 15). Объемная плотность синусоидов была снижена незначительно.

Введение тритерпеновых соединений на фоне ПХТ вызывало снижение, по сравнению только с ПХТ, количества гепатоцитов в состоянии некроза. При этом выраженность дистрофических изменений существенно уменьшалась. Указанные положительные сдвиги проявлялись наиболее ярко у мышей, которым вводили в-алаБК. По данным морфометрического анализа (см. табл. 15), под действием аланинамидного производного БК достоверно снижалась объемная плотность некрозов (на 63%) по сравнению с ПХТ. В группе с введением БК аналогичные сдвиги были незначительными. В обеих группах отмечена тенденция к росту объемной плотности синусоидов (на 28% для в-алаБК, на 10% для БК).

В отсутствии ПХТ в-алаБК не оказывал достоверного влияния на объемную плотность некрозов и дистрофий. По сравнению с ним БК достоверно снижала объемную плотность дистрофий (на 24%), но также не влияла на некробиоз. БК способствовала также увеличению объемной плотности синусоидов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что аланинамидное производное БК оказывает заметный гепатопротекторный эффект на мышей со злокачественной лимфомой, который выражается в уменьшении некробиотических повреждений паренхимы. БК на фоне ПХТ не оказывал заметного влияния на печень, хотя в отсутствии цитостатиков и вызывала сдвиги в отдельных показателях.

Результаты, полученные на животных с перевиваемыми опухолями, коррелируют с данными, установленными в модели экспериментальной полихимиотерапии на интактных крысах, которые свидетельствуют о снижении объемной плотности некрозов и дистрофий в печени под действием бетулоновой кислоты и ее аланиламидных производных. Наблюдаемое в условиях полихимиотерапии уменьшение метастатических поражений в синусоидах наряду с сокращением объемной плотности некрозов гепатоцитов, свидетельствует об активации тритерпеноидами апоптоза. Обнаруженная у этих соединений способность усиливать васкулопатию коррелировала с повышенной инфильтрацией синусоидов полинуклеарами. Возможно ремоделирование выстилки синусоидов связано с воздействием на нее продуктов секреции моноцитарных клеток, таких как цитокины, матриксные металлопротеиназы, коллагеназы, катепсин В (Mantovani A. Et al., 2008). Кроме того, нельзя исключить возможность активации под действием тритерпеноидов системы комплимента. Известно, что в результате повышения активности комплимента увеличивается продукция фактора С5а, который стимулирует нейтрофилы. Активированные нейтрофилы, накапливаясь в капиллярах, могут вызывать повреждение эндотелия путем выделения токсичных кислородных метаболитов (Козлов Л.В. и др., 2007).

Данные литературы свидетельствуют о том, что характер структурных и внутриклеточных изменений в тканях, наблюдаемых под действием лупановых тритерпеноидов, может быть непосредственно связан с их влиянием на продукцию реактивных кислородных соединений. На примере бетулиновой и некоторых производных олеоноловой кислот было показано, что в низких концентрациях тритерпеноиды оказывают цитопротекторное действие, уменьшая оксидативный стресс в клетках, а в высоких - способствуют накоплению реактивных продуктов окисления (Sporn M.B. et al., 2006; Liby K. et al., 2007). Последнее наблюдение непосредственно связано с механизмом их противоопухолевого действия. Известно, что тритерпеноиды запускают процессы гибели в опухолевых клетках внутренним путем апоптоза, связанным с нарушением проницаемости митохондриальной мембраны и последующим выходом апоптоз-стимулирующих факторов, которые, в свою очередь, сдвигают редокс-баланс в клетке в направлении оксидативного стресса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой LLC. В почках животных с LLC выявлены преимущественно морфологические изменения проксимальных канальцев в виде умеренно выраженных дегенеративно-некротических изменений эпителиоцитов. Изменения клубочков и интерстициальной ткани были минимальными. В отдельных клубочках выявлялись лишь незначительное расширение мезангиального матрикса и отложения фибрина в виде PAS-позитивной субстанции между петлями капилляров. Выявленные поражения почек у животных с перевитой опухолью (отсутствие метастазов, повреждение сосудов клубочков и интерстициальной ткани, минимальные патологические изменения в канальцах), позволяют сделать заключение о паранеопластическом характере нефропатии.

Введение комплекса цитостатиков по схеме CHOP привело к развитию у мышей тубулоинтерстициального нефрита в сочетании с мембранозной нефропатией. Основные патологические изменения выявлены в эпителиоцитах проксимальных канальцев: набухание цитоплазмы и фрагментация щеточной каймы, очаговая дистрофия и некрозы эпителиоцитов отдельных канальцев.

По данным морфометрического анализа, относительный объем эпителиоцитов с выраженными дистрофическими изменениями увеличился на 157%, на 77% уменьшилась доля эпителиоцитов со слабо выраженными дистрофическими процессами (табл. 16). На фоне ПХТ на 366% возрастала объемная плотность очагов некрозов эпителиоцитов. В просвете собирательных трубочек определялись гиалиновые цилиндры, в интерстициальной ткани развивались умеренное полнокровие и периваскулярный отек. Существенного изменения относительного объема интерстициальной ткани и просвета канальцев при проведении ПХТ не выявлено. ПХТ в данном эксперименте осложняла течение нефропатии и сопровождалась увеличением дегенеративно-некротических повреждений нефроцитов.

Введение БК, ее метилового эфира и двух в-аланиламидных производных БК снизило степень альтерации в проксимальных канальцах. Отмечено уменьшение объемной плотности эпителиоцитов в состоянии некроза (на 80 - 98%) и выраженной дистрофии (на 54 - 60%). Кроме того, увеличился объем эпителиоцитов с признаками слабо выраженной дегенерации на 170 - 180% (см. табл. 16). Под действием в-аланиламида БК и его метилового эфира просвет проксимальных канальцев увеличился на 50 - 75% вследствие уменьшения отека эпителиоцитов и щеточной каймы. Наиболее выраженная положительная динамика репаративных процессов наблюдалась на фоне введения в-аланиламида БК.

В отсутствии ПХТ лупановые тритерпеноиды снижали у мышей выраженность паранеопластической нефропатии. В проксимальных канальцах отмечалось уменьшение в среднем на 56% объемной плотности некрозов эпителицитов (см. табл. 16). Доля эпителиоцитов с мелковезикулярной липидной инфильтрацией и фрагментированной щеточной каймой уменьшилась в среднем на 8 - 13% по сравнению с контролем. Во всех группах после введения тритерпеновых соединений отмечалось уменьшение отека эпителиоцитов проксимальных канальцев и щеточной каймы, в результате чего просвет канальцев увеличился на 54%. Кроме того, в-аланиламид БК несколько уменьшил (на 22%) отек интерстциальной ткани. Следует отметить, что БК и ее производные не оказали заметного влияния на состоянии гломерулярного аппарата, где по-прежнему сохранялись утолщение базальной мембраны клубочков и увеличение объема мезангиального матрикса.

Влияние бетулоновой кислоты и ее производных на морфологию почек мышей с перевитой лимфомой RLS. После инокуляции клеток опухоли, в почках подопытных животных развивались мелкоочаговые метастазы, располагавшиеся в петлях капилляров клубочков, по ходу кровеносных сосудов в корковом веществе, а также в интерстициальной ткани на границе коркового и мозгового вещества. Метастазы четко отграничены от окружающих тканей. В нефроцитах, эпителиоцитах дистальных, проксимальных канальцев, собирательных трубочек наблюдалось развитие дегенеративных и некротических процессов. Просвет канальцев был расширен и заполнен слущенными клетками, детритом щеточной каймы, фибрином. В интерстициальной ткани отмечался выраженный отек, слабо выраженная инфильтрация мононуклеарами, полнокровие сосудов.

Введение цитостатиков приводило к развитию у мышей тяжелого некротического нефроза, сопровождавшегося увеличением некротических повреждений нефроцитов (на 35% по сравнению с контролем) (табл. 17). Клетки канальцевого эпителия отечные, просвет проксимальных канальцев полностью заполнен некротизированной щеточной каймой и клеточным детритом. Отмечалось незначительное (на 28% по сравнению с контролем) уменьшение объема интерстициальной ткани, обусловленное сохранением отечности.

Под влиянием изучаемых соединений, вводимых на фоне ПХТ, снижалась выраженность структурных повреждений почек за счет уменьшения очагов некроза и отечности интерстициальной ткани. Отмеченные сдвиги наиболее ярко проявлялились при введении амида БК. В этой группе животных достоверно снижалось (на 77%) количество некротизированных нефроцитов и возрастало (на 53%) количество клеток со слабо выраженной дистрофией по сравнению с ПХТ. Введение амида БК вызывало также уменьшение на 43% просвета канальцев.

В отсутствие полихимиотерапии амид БК проявлял значимый, хотя и менее выраженный, чем в комбинации с цитостатиками, нефропротективный эффект. У животных этой группы снижение некрозов канальцевого эпителия составило 53%, а увеличение количества клеток со слабо выраженной гиалиново-капельной дистрофией - 37% по сравнению с контролем; просветы канальцев уменьшились на 29%. Введение БК мышам с лимфомой в тех же условиях приводило к незначительным однонаправленным изменениям показателей объемной плотности зон дистрофических нарушений, просвета канальцев и интерстициальной ткани. Обращает на себя внимание увеличение количества некротических повреждений нефроцитов в этой группе животных.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что изучаемые тритерпеноиды снижают тяжесть повреждений почек мышей со злокачественной лимфомой, вызванную ПХТ, путем уменьшения дегенеративно-некротических изменений нефроцитов, отека интерстициальной ткани и просвета канальцев. в-аланиламид БК обладает выраженным нефропротективным действием, уменьшая степень некробиоза нефроцитов как на фоне полихимиотерапии, так и без нее. БК в тех же условиях не оказывала значимого эффекта.

Влияние агентов на показатели белой крови и костного мозга у мышей с перевиваемыми опухолями. Через 8 сут после ПХТ в лейкоцитарном профиле крови мышей с LLC выявлено достоверное увеличение общего количества лейкоцитов (в 1,5 раза), в том числе палочкоядерных нейтрофилов (в 1,8 раза). Повышение числа юных полиморфноядерных лейкоцитов, а также появление их предшественников метамиелоцитов свидетельствует о сдвиге лейкоцитарной формулы влево и может быть связано с активацией воспаления, вызванного некротизацией опухолевого узла под действием цитостатиков. На фоне увеличения общей клеточности белой крови отмечено угнетение ее лимфоцитарного ростка (в 1,5 раза), что свидетельствует о серьезных нарушениях процессов дифференцировки и созревания предшественников лимфоцитов в костном мозге и тимусе.

Введение БК и ее производных на фоне ПХТ не оказало влияния на выраженность лимфопении и сдвиги в соотношении полиморфноядерных гранулоцитов. Однако БК, в отличие от остальных тритерпеноидов, достоверно усилила (в 1,4 раза) лейкоцитоз в крови по сравнению с ПХТ. Ее метиловый эфир и оба аланиламида, напротив, снизили общее количество лейкоцитов. При этом для всех производных БК было характерно увеличение моноцитов в крови более чем в 2 раза относительно контроля. Максимальная выраженность моноцитоза отмечена для в-аланиламида БК, который значимо повышал данный показатель относительно ПХТ (в 1,9 раза).

Характер сдвигов в лейкоцитарном профиле крови мышей указывает на то, что в-аланиламид БК и в меньшей степени метиловые эфиры сохраняют модулирующее влияние на общую численность клеток белой крови, при этом у них отмечается стимулирующее влияние на моноциты крови. В условиях неопластического процесса и цитотоксического воздействия эти сдвиги могут быть направлены на снижение выраженности альтеративных процессов в тканях за счет регуляции макрофагами секреторных продуктов эффекторных клеток, участвующих в иммунном ответа и воспалении. Лейкоцитоз, вызванный БК на фоне ПХТ, свидетельствует об усилении воспалительного процесса в тканях.

Изменения в лейкоцитарной формуле крови животных с лимфомой RLS через 8 сут после ПХТ отражали те же тенденции, которые были отмечены выше у мышей с LLC. Это выражалось в сдвиге формулы влево, развитии моноцитоза и небольшой лимфопении. Введение БК и ее в-аланиламида не вызвало достоверного изменения этих показателей по отношению к группе ПХТ, однако привело дополнительно к снижению количества эозинофилов по сравнению с контролем.

Анализ миелограммы животных c LLC свидетельствовал о продолжительном угнетении под действием ПХТ эритроидного и мегакариоцитарного ростков в костном мозге. Количество эритробластов по сравнению с контролем значимо снижалось (в 1,4 раза), прежде всего за счет менее зрелых негемоглобинизированных форм (в 1,5 раза против контроля). В этих условиях БК и ее производные усиливали негативное влияние цитостатиков на эритрон, вызывая значимое уменьшение количества эритробластов относительно ПХТ. Через 8 сут после проведения ПХТ состояние гранулоцитарного звена костномозгового кроветворения у животных с LLC характеризовалось небольшим снижением низкодифференцированных форм и таким же повышением зрелых форм метамиелоцитов относительно соответствующих показателей в контроле. Ведение БК на фоне ПХТ не изменило показателей гранулоцитопоэза, тогда как ее производные вызвали значимое повышение количества зрелых лейкоцитов относительно группы ПХТ, а в-аланиламид БК также увеличивал продукцию незрелых миелоцитов. Клеточность эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов достоверно не отличалась от контроля. Следует отметить, что на фоне ПХТ лишь БК и ее в-аланиламид достоверно увеличили индексы созревания эритроцитов, а последний дополнительно повысил и индекс созревания гранулоцитов, что можно рассматривать как стимуляцию дифференцировки этих клеточных элементов гемопоэза.

Проведение ПХТ мышам с лимфмой RLS, так же как и у животных с LLC, привело к существенному падению (почти в 1,5 раза) числа эритробластов в костном мозге, особенно их более ранних форм. Введение обоих тритерпеноидов усилило негативный эффект цитостатиков на красный росток крови, вызывая дальнейшее двукратное снижение клеточности эритрона относительно ПХТ. Аналогичный синергизм с цитостатиками проявлялся у БК и ее амида в отношении лейкоцитарного звена гемопоэза. Оба агента достоверно увеличивали продукцию предшественников гранулоцитов, а также несколько повышали общее количество лейкоцитов относительно ПХТ. Введение тритерпеноидов в постцитостатическом периоде животным с RLS не оказало достоверного влияния на другие виды лейкоцитарных клеток, хотя следует отметить тенденцию к повышению количества плазматических клеток в 3 и 6,5 раз и снижении моноцитоза в 2,4 и 2 раза под влиянием соответственно БК и ее в-аланиламида.

Данные индексов созревания клеток костного мозга у мышей с лимфомой RLS, подвергавшихся воздействию цитостатиков и тритерпеноидов, подтверждают стимулирующее влияние БК и ее в-аланиламида в основном на гранулоцитарно-моноцитарный росток крови.

Стимулирующее влияние тритерпеноидов на дифференцировку гранулоцитарно-макрофагальных предшественников указывают данные других исследователей. S. Koschmieder et al. (2007), показали, что обработка клеток костного мозга больных миелоидной лейкемией тритерпеноидом олеонанового типа (CDDO) вызывала признаки повышения дифференцировки гранулоцитов и моноцитов: увеличение ядерно-цитоплазматического отношения, ядерной сегментации и уменьшение степени базофильности цитоплазмы. Эти же авторы сообщали о том, что повышение дифференцировки и фагоцитарной активности гранулоцитов и макрофагов достигается независимо от апоптозиндуцирующего действия CDDO и в дозах существенно меньших.

Антиоксидантное действие соединений на фоне ПХТ. Развитие окислительного стресса является неспецифическим осложнением опухолевого процесса и цитостатической химиотерапии. Способность лупановых производных снижать его интенсивность определяли по концентрации в крови ТБ-активных соединений - маркера вторичных продуктов окисления. У мышей с LLC, получавших ПХТ, концентрация ТБАС была повышена в 5 - 6 раз относительно интактных животных (рисунок).

Введение БК и ее в-аланиламидных производных уменьшало данный показатель соответственно в 2,7 и 4 раза, под действием пиперазиновых производных of-40 и of-41 его концентрация снижалась в 1,8 и 2,5 раз. Агент of-15 и производное бетулина of-3 в тех же условиях не проявили антиоксидантного эффекта у мышей с карциномой Льюис, однако у животных с лимфомой RLS они уменьшили выраженность окислительного стресса в постцитостатическом периоде в 3,5 и 1,5 раза соответственно. На фоне лимфомы в-аланиламид БК вызвал более чем двукратное падение ТБАС относительно группы ПХТ.

В то же время под действием изученных тритерпеноидов не наблюдалось достоверного снижения уровней АЛТ и АСТ в крови животных-опухоленосителей, получавших ПХТ. Высокий уровень трансаминаз можно рассматривать как результат интенсивного цитолиза вследствие некротических процессов в опухоли и других тканях, а также нарушений в метаболическом статусе клеток в терминальной фазе развития опухоли.

Таким образом, у производных лупана выявлена способность снижать интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.

Влияние лупановых тритерпеноидов на противоопухолевый эффект полихимиотерапии. Наблюдения за динамикой роста трансплантатов LLC во время введения лупановых производных показало, что они не стимулируют опухолевый рост на фоне химиотерапии. У протестированных соединений - аланиламидных и пиперазиновых производных БК, ее диоксиимино метилового эфира и диникотината бетулина - не зафиксировано случаев достоверного увеличения объема опухолевых узлов в период введения агентов вслед за ПХТ. Кроме того, у некоторых из этих агентов была выявлена способность потенцировать противоопухолевый эффект самой химиотерапии.

Влияние тритерпеноидов на уровень вторичных продуктов перекисного окисления (ТБАС) в сыворотки крови мышей с карциномой легких Льюис и лимфомой RLS в конце периода введения агентов

Введение -аланиламида БК и его метилового эфира на фоне ПХТ привело к усилению цитостатического эффекта химиопрепаратов с сохранением высокой противоопухолевой активности в конце периода введения. Противоопухолевое действие ПХТ максимально потенцировалось к 6-м суткам введения амида, содержащего фрагмент -аланина, при этом размеры опухолевых узлов уменьшались почти в 1,5 раза по сравнению с ПХТ. У его метилового эфира достоверный противоопухолевый эффект на фоне ПХТ проявился в конце опыта.

в-Аланиламид и диникотинат бетулина уже через двое суток достоверно повышали противоопухолевую эффективность ПХТ и сохраняли ее до конца введения. Индекс торможения роста опухоли в этих группах вырос соответственно в 1,3 и 1,5 раза. Диоксиимино метиловый эфир БК в первые 4 сут потенцировал эффект ПХТ в 1,6 раз, затем его вклад уменьшался. В то же время у мышей, которым в постцитостатическом периоде вводили БК и ее метиловый эфир, изменений в активности цитостатиков не обнаружено. Метиловые эфиры в-аланиламида и пиперазинового производного БК также не оказывали влияния на активность противоопухолевой терапии, а сульфопроизводное БК достоверно уменьшало противоопухолевое действие ПХТ.

В условиях злокачественной лимфомы в-аланиламид и диоксиимино метиловый эфир БК, а также диникотинат бетулина подтвердили свою способность увеличивать противоопухолевый потенциал цитостатической химиотерапии. Торможение роста опухоли на 7-е сутки повышалось соответственно в 1,7, 1,7 и 1,3 раз. БК в этом случае также проявляла потенцирующий эффект, повышая в 1,3 раза индекс торможения роста опухоли.

Влияние тритерпеноидов на антиметастатический эффект ПХТ. Анализ показателей метастазирования карциномы легких Льюис выявил высокую антиметастатическую активность самой цитостатической химиотерапии. Во всех группах с введением цитостатических препаратов наблюдалось существенное (в 3,8 - 7,5 раз) снижение объемной и поверхностной плотностей метастазов в легких относительно контроля. Однако показатели метастазирования достоверно не отличались от контроля.

Введение лупановых соединений на фоне ПХТ оказывало различное влияние на ее антиметастатический потенциал. в-Аланиламид и его метиловый эфир повышали эффективность химиотерапии LLC путем снижения объемной плотности метастатических поражений, а в-аланиламид еще и частоты метастазирования в легких. В результате ИИМ в этих группах повышался в 1,4 и 1,2 раза относительно эффекта ПХТ.

Введение б-аланиламидных производных вызывало незначительное снижение антиметастатического потенциала ПХТ, выражавшееся в увеличении площади метастатических поражений и частоты метастазирования. Однако эти изменения не были статистически достоверными и не привели к существенному изменению ИИМ, который оставался высоким благодаря значительной разнице показателей объемной плотности метастазов в этих группах по сравнению с контрольной.

Влияние БК и ее сульфо- и метилпиперазинового производных на показатели метастазирования ПХТ выражалось в увеличении объемной плотности метастазирования LLC соответственно в 3,4, 3,4 и 1,2 раза и частоты метастазирования в 1,6 - 1,7 раз по сравнению с ПХТ. В случае метилпиперазинового производного снижение ИИМ составило 1,1 раза, тогда как под действием сульфопроизводного БК величина ИММ уменьшилась в 2, а под влиянием БК - в 7 раз по отношению к ПХТ. Введение агента of-41 на фоне ПХТ не приводило к существенным изменениям ее антиметастатического эффекта, в отличие от его аналога of-40 и БК, которые заметно снижали этот эффект.

ВЫВОДЫ

1. Бетулоновая кислота и ее производные с аланиламидными, диоксидииминовым, метилпиперазиновым заместителями, а также никотинат бетулина являются перспективными агентами-модификаторами биологических реакций с политаргетным механизмом, в котором сочетаются цитопротекторное действие на неповрежденные клетки и цитотоксическое - на неопластические. Цитопротекторные свойства реализуются через противовоспалительную и антиоксидантную активность, цитотоксические - через стимуляцию сигнальных путей некроза и апоптоза.

2. При моделировании циклофосфановых поражений в-аланиламид в отличие от бетулоновой кислоты оказывает корригирующее влияние на массу тимуса, селезенки, печени, почек и легких. Оба тритерпеноида модулирует содержание нейтрофилов и мононуклеаров в периферической крови. При воспроизведении доксорубициновых повреждений в-аланиламид и бетулоновая кислота вызывают коррекцию массы тимуса и содержания лейкоцитов в периферической крови.

3. Бетулоновая кислота и ее в-аланиламид при изолированном введении интактным животным оказывают одновременно умеренное цитотоксическое и стимулирующее действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера). По данным ультраструктурного анализа, цитотоксическое действие бетулоновой кислоты и ее амида проявляется в изменении тонкой структуры митохондрий гепатоцитов, секвестрации гликогена и усилении аутофагических процессов (субплазмалеммальной вакуолизации цитоплазмы), появлении некробиотически измененных гепатоцитов и эндотелиоцитов. Амид бетулоновой кислоты модифицирует тонкую структуру митохондрий (появление крупных органелл в разреженным матриксом и неравномерно расширенными кристами). Стимулирующее влияние бетулоновой кислоты и ее амида на гепатоциты, эндотелиоциты и клетки Купфера (моноциты) проявляется в виде усиления их эндоцитозной (пиноцитозной) активности. В синусоидальной выстилке доминируют функционально активные формы эндотелиоцитов и клеток Купфера.

4. При изолированном введении бетулоновая кислота и ее в-аланиламид вызывают сходные с цитостатиками (циклофосфаном и доксорубицином), но менее выраженные изменения ультраструктуры отдельных кардиомиоцитов. К таким изменениям относятся лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, умеренные расширения межмембранного околоядерного пространства и цистерн агранулярной саркоплазматической сети. Амид бетулоновой кислоты вызывает также значительные изменения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки).

5. Бетулоновая кислота и ее в-аланиламид, вводимые на фоне цитостатиков (циклофосфамида и доксорубицина), проявляют политаргетное действие на клеточные популяции печени (гепатоциты, эндотелиоциты синусоидов, клетки Купфера) и миокарда (кардиомиоциты и эндотелиоциты), потенцируя цитотоксическое действие цитостатиков в отношении одних клеток и стимулируя регенераторные реакции - в других. Восстановление ультраструктуры гепатоцитов и кардиомиоцитов при комбинированном применении цитостатиков и тритерпеноидов происходит быстрее. В гепатоцитах последовательное применение цитостатиков и тритерпеноидов активизирует эндоцитозную и трансцитозную активность и способствует сохранению гладкой цитоплазматической сети. В кардиомиоцитах тритерпеноиды также активизируют эндоцитозную активность и стимулируют процессы внутриклеточной регенерации (появление многочисленных полисом в участках лизиса миофибрилл).

6. К общецитологическим цитопротекторным свойствам бетулоновой кислоты и ее в-аланиламида как при изолированном, так и комбинированным с цитостатиками применении относится их способность усиливать эндоцитозную (пиноцитозную) активность клеток и стимулировать в них процессы внутриклеточной регенерации. Оба агента не подавляют клеточные формы регенерации гепатоцитов и кардиомиоцитов. К общецитологическим цитотоксическим свойствам обоих тритерпеноидов относится их способность вызывать умеренные литические изменения цитоплазматического матрикса, деструктивные изменения органелл и усиление аутофагических процессов. Амид бетулоновой кислоты вызывает однотипную модификацию ультраструктуры митохондрий в разных клетках - увеличение размеров органелл, разрыхление их матрикса и расширение крист.

7. При моделировании полихимиотерапии СНОР на здоровых животных корректорный эффект тритерпеноидов выражается в ослаблении ее угнетающего эффекта на тимус и более раннем восстановлении костномозгового кроветворения. Регулирующее влияние агентов направлено преимущественно на клетки моноцитарного, а не гранулоцитарного ряда. Под действием тритерпеноидов происходит коррекция цитотоксических повреждений в печени и почках: снижение некробиотических повреждений гепатоцитов и эпителиоцитов извитых канальцев, улучшение микроциркуляции, повышение пластических резервов.

8. Курсовое внутрижелудочное введение мышам-опухоленосителям -аланиламида бетулоновой кислоты, его метилового эфира, в-аланиламида, диоксииминометилового эфира бетулоновой кислоты и диникотината бетулина повышает противоопухолевый эффект полихимиотерапии СНОР. Выраженность эффекта зависит от вида перевиваемой опухоли. Производные с б-аланиламидным и метилпиперазиновым заместителем не стимулируют диссеминацию опухоли на фоне полихимиотерапии; в-аланиламид и его метиловый эфир повышают антиметастатическую эффективность СНОР.

9. Введение в-аланиламидных производных бетулоновой кислоты мышам с перевиваемыми опухолями на фоне полихимиотерапии уменьшает выраженность лейкоцитоза и стимулирует моноцитарное звено периферической крови.

10. Курсовое введение бетулоновой кислоты, ее метилового эфира и в-аланиламидных производных на стадии прогрессии опухоли существенно подавляет ее диссеминацию в печени; бетулоновая кислота уменьшает выраженность дистрофических изменений гепатоцитов, а в-аланиламид - усиливает дегенеративные изменения гепатоцитов. На фоне полихимиотерапии СНОР бетулоновая кислота и ее в-аланиламид снижают выраженность дистрофических изменений гепатоцитов и уменьшают объемную плотность очагов некроза гепатоцитов по сравнению с полихимиотерапией. Эфирные производные не оказывают существенного положительного влияния на состояние печеночной паренхимы.

11. Бетулоновая, [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислоты и их метиловые эфиры оказывают протективное действие на морфологию почек животных, как на фоне полихимиотерапии, так и без ее воздействия. Все исследуемые тритерпеноиды обладают способностью уменьшать на фоне полихимиотерапии степень деструктивно-некротических процессов только в канальцах почек.

12. Бетулоновая кислота, ее в-аланиламидные и пиперазиновые производные, а также диоксииминометиловый эфир бетулоновой кислоты и диникотинат бетулина понижают интенсивность перекисного окисления в условиях цитостатической полихимиотерапии.

13. Бетулоновая кислота является новой перспективной тритерпеноидной платформой для синтеза соединений с высокой гепатопротекторной, кардиопротекторной, нефропротекторной, антиоксидантной, противовоспалительной и противоопухолевой активностью, а в-аланиламидное производное бетулоновой кислоты предложено для доклинических испытаний в качестве корректора цитостатической химиотерапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г, Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита // Научный вестник Тюменской медицинской академии. - 2003. - № 1. - С. 60 - 62.

2. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Бубнова Е.Б., Петренко Н.И., Шульц Э.Э. Антиоксидантные свойства амидов бетулоновой кислоты // Материалы 2-го съезда Рос. науч. общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». - М., 2003. - Ч. 1. - С. 186.

3. Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Узенкова Н.В., Грек О.Р., Позднякова С.В., Толстиков Г.А.. Бетулоновая кислота и ее производные - новая группа агентов, снижающих побочное действие цитостатиков// Доклады академии наук. - 2004. - Т. 399, № 2. - С. 274 - 277.

4. Sorokina I.V., Tolstikova T.G., Zhtsukova N.A., Petrenko N.I., Shults E.E., Uzenkova N.V., Grek O.R., Poszdnjakova S.V., Tolstikov G.A. Betulonic acid and its derivatives - a new group of agents reducing side effects of cytostatic drugs // Doklady Biological Science. - 2004. - Vol. 399. - P. 434 - 437.

5. Августинович Д.Ф., Коваленко И.Л., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г Этологическое исследование антидепрессивного эффекта флуоглизина в условиях хронического социального стресса у мышей // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2004. - Т. 137, № 1. - С. 99 - 103.

6. Коваленко И.Л., Августинович Д.Ф Сорокина. И.В., Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г. Влияние хронического введения флуоглизина на биохимические показатели крови у мышей, находящихся в условиях социального стресса // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2004. - № 11. - С. 44 - 47.

7. Толстиков А.Г. Толстикова Т.Г, Сорокина И.В., Долгих М.П., Толстиков Г.А., Федосеева Л.А. Лекарственное средство для лечения различных форм депрессий «флуоглизин». Патент РФ № 2232574, Бюл. №20 от 12.10.2004.

8. Сорокина И.В., Бубнова Е.Б., Толстикова Т.Г., Жукова Н.А., Узенкова Н.В., Петренко Н.И., Шульц Э.Э., Позднякова С.В., Грек О.Р. Коррекция побочных эффектов цитостатической полихимиотерапии аланинамидными производными бетулоновой кислоты // Материалы XII международн. конф. «Медицина XXI века». - Словакия, Низкие Татры, 2004. - С. 21 - 22.

9. Сорокина И.В., Жукова Н.А., Волкова Е.Б., Толстикова Т.Г., Шульц Э.Э., Позднякова С.В., Грек О.Р. Новые пептидные производные бетулоновой кислоты - корректоры токсических эффектов цитостатиков // Материалы Всерос. конф. «Химия и технология растительных веществ». - Саратов, 2004. - С. 161 - 163.

10. Жукова Н.А., Сорокина И.В., Толстикова Т.Г., Шульц Э.Э., Позднякова С.В., Грек О.Р., Николин В.П., Каледин В.И., Попова Н.А. [ 3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-амино-пропионовая кислота-новое производное бетулоновой кислоты с противовопухолевой активностью // Материалы международ. конф. и дискуссионного науч. клуба «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Украина, Ялта-Гурзуф, 2004. - С. 20.