Клеточные механизмы коррекции цитотоксических полиорганных повреждений тритерпеноидами класса лупана (бетулоновой кислотой и ее производными)

Введение тритерпеноидов на фоне ЦФ не оказало значимого влияния на вызванные им сдвиги в количестве тромбоцитов и эритроцитов. Динамика изменений показателей гематокрита и гемоглобина в группе с ЦФ и тритерпеноидами была аналогична динамике изменения количества эритроцитов.

Анализ лейкоцитарной формулы показал, что лейкопения, выявленная у крыс через 4 дня после введения ЦФ, обеспечивалась в основном за счет значительного угнетения гранулоцитарного ростка крови, прежде всего сегментоядерных нейтрофилов, количество которых снизилось в 3,4 раза относительно контроля (табл. 7). БК и ее в-аланиламид, вводимые на фоне цитостатика, оказали в тот же период корригирующий эффект, достоверно снизив вызванную им нейтропению соответственно в 2,5 и 1,9 раз. К 14-му дню опыта во всех группах, которым вводили ЦФ, содержание гранулоцитов в крови нормализовалось. Обращает на себя внимание появление палочкоядерных нейтрофилов в группах с сочетанным введением ЦФ и обоих тритерпеноидов, свидетельствующее о стимуляции гранулопоэза в костном мозге. Следует отметить, что сами по себе тритерпеноиды не вызвали достоверных изменений в гранулоцитарном профиле в течение всего периода наблюдений.

В условиях цитостатического воздействия были выявлены определенные сдвиги в количестве циркулирующих мононуклеаров. После введения ЦФ у крыс наблюдалось тенденциозное повышение моноцитов, а также небольшой лимфоцитоз, который компенсировался к 14-му дню опыта. На этом фоне в-аланиламид БК уже в ранние сроки нормализовал количество моноцитов (снижение в 1,6 раз), тогда как БК достигла такого же эффекта в конце эксперимента. Ведение тритерпеноидов в изолированном режиме не влияло на содержание моноцитов - оно было близко к норме в течение всего опыта. Содержание лимфоцитов в группах с введением БК и ее в-аланиламида в целом не имело достоверной разницы с контролем.

Выявленная динамика изменения клеточного состава крови подтверждается литературными данными, описывающими состояние костномозгового кроветворения после введения ЦФ (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, Дыгай А.М. и др., 2009). Известно, что через сутки после введения цитостатика в максимально переносимой дозе, происходит значительное угнетение гранулоцитарного ростка костного мозга, что сопровождается резким уменьшением количества гемопоэтических островков. К 5-м суткам количество нейтрофилов возрастает, достигая максимума к 8 - 12-му дню (Гольдберг Е.Д. и др., 1999, Дыгай А.М. и др., 2009). Эти данные согласуются с наблюдавшимся нами увеличением количества лейкоцитов в крови через 14 дней после введения цитостатика, существенно превышавшим их число в контроле. В то же время в крови сохранялись признаки угнетения эритрона.

Выявленные сдвиги в состоянии периферической крови, а также в массе селезенки и тимуса, вызванные действием ЦФ, в целом соответствовали описанной в литературе картине морфофункциональных изменений в системе кроветворения. Выраженность гематотоксического эффекта ЦФ в нашем опыте определялась введенной дозой препарата, которая составляла Ѕ от максимально переносимой. В этих условиях гемопротекторное действие БК и ее в-аланиламида было направлено преимущественно на гранулоцито-моноцитарный росток и выражалась в модуляции патологических сдвигов, вызванных ЦФ.

У аланиламида БК дополнительно было установлено протекторное действие в отношении тимуса и селезенки, которое выражалось в поддержании их нормальной массы в течение опыта. Это обстоятельство позволяет предположить сохранение под действием в-алаБК клеточного пула Thy1,2+, и сделать вывод о иммунопротекторном действии агента. Кроме того, сохранение функциональной активности тимуса могло способствовать активизации процессов дифференцировки предшественников в костном мозге, что не потребовало дополнительной стимуляции кроветворной функции селезенки. БК не оказала корректирующего влияния на депрессивный эффект ЦФ в отношении как тимуса, так и селезенки.

Морфологические изменения печени через 3 сут после введения ЦФ проявлялись в виде мелкоочаговых некрозов паренхимы, распространявшихся от портальных трактов. Отмечались нарушения гемодинамики - неравномерное полнокровие синусоидов, центральных и портальных вен. В расширенных просветах синусоидов находились многочисленные мононуклеарные клетки, преимущественно клетки Купфера. К гепатотоксическим эффектам ЦФ следует отнести и выраженную субплазмалеммальную «вакуолизацию» цитоплазмы гепатоцитов. Регенераторные реакции гепатоцитов проявлялись в усилении их митотической активности, особенно в перипортальной зоне, где возрастало количество двуядерных гепатоцитов.

К 14-м суткам после введения ЦФ происходило нарастание воспалительноклеточной инфильтрации, развивался тромбоз и обтурирование (особенно клетками Купфера) просветов синусоидов, центральных и портальных вен. Регенераторные реакции гепатоцитов в этот срок проявлялись в усилении цитокинеза двуядерных клеток (уменьшении их числа) и увеличении популяции «мелких» одноядерных гепатоцитов, направленных на восстановление общей численности гепатоцитов. Некробиотические изменения гепатоцитов и стимуляция их регенераторных реакций были наиболее выраженными в перипортальных зонах. Портальный и перипортальный склероз, выявляемый в более поздние сроки после введения ЦФ, свидетельствовал о наиболее выраженных повреждениях цитотоксическими агентами клеточных популяций портальных зон печени.

В печени животных после введения ЦФ и БК отмечалось уменьшение степени полнокровия как в крупных сосудах, так и в синусоидах. В гепатоцитах как центролобулярных, так и перипортальных зон выявлялась очаговая дистрофия. Отмечались некрозы отдельных гепатоцитов. После введения ЦФ и амида БК сохранялось более выраженное, по сравнению с ЦФ и БК, полнокровие сосудов. По всей паренхиме выявлялись коагуляционные некрозы отдельных гепатоцитов. В то же время регистрировались гепатоциты, находившиеся на разных фазах митотического цикла, и двуядерные клетки. В группах животных получавших БК и амид БК в режиме изолированного введения гистологическое строение печени существенно не отличалось от контроля. Однако при введении амида БК отмечалась более значительная активация эндотелиоцитов синусоидов, чем при БК. К признакам корректорного влияния амида на фоне ЦФ можно отнести усиление регенераторных процессов в печени в виде повышения митотической активности гепатоцитов и увеличения количества двуядерных клеток.

По данным ультраструктурного анализа, внутриклеточная реорганизация гепатоцитов после однократного введения ЦФ определялась выраженными изменениями тонкой структуры митохондрий, транзиторными изменениями гранулярной цитоплазматической сети (расширениями профилей и частичной дегрануляцией), значительной редукцией гладкой цитоплазматической сети, гиперплазией и гипертрофией структурных элементов комплекса Гольджи. Характерной особенностью внутриклеточной реорганизации гепатоцитов обеих зон через 3 сут после введения ЦФ были лизис и секвестрация гранул гликогена, которые регистрировались во всех клетках, но различались по интенсивности. В наибольшей степени эти процессы были выражены в гепатоцитах перипортальной зоны.

Значительным изменениям подвергалось микроциркуляторное русло печеночной дольки. Через 3 сут после введения ЦФ регистрировалась гетерогенность эндотелиоцитов синусоидных капилляров, которая была обусловлена преимущественно присутствием в эндотелиальной выстилке активированных форм клеток и некробиотически измененных клеток. Через 14 сут после введения ЦФ ультраструктурные изменения гепатоцитов усиливались. В первую очередь это касалось тонкого строения митохондрий и скоплений гранул гликогена. Тонкая структура митохондрий была значительно изменена, они содержали, как правило, электронно-плотный матрикс, но кристы в них практически не различались; отмечалась «осмиофильная» дегенерация митохондрий с образованием остаточных телец. Выстилка синусоидов была представлена как активированными, так и дегенеративными формами эндотелиоцитов. Важной особенностью поражения печени после введения ЦФ можно считать массивную обтурацию синусоидов клетками Купфера и лимфоцитами с образованием тромботических масс, носивших распространенный характер.

При изолированном введении БК и ее амида отмечались сходные изменения ультраструктуры гепатоцитов. Через 3 сут ультраструктура гепатоцитов в обоих случаях была близка к норме, но отмечалось нарушение тонкой структуры митохондрий. Митохондрии, как правило, были с электронно-плотным матриксом, в котором плохо различались кристы. При этом усиливалась эндоцитозная и трансцитозная функции гепатоцитов: на синусоидальном полюсе регистрировалось большое количество эндоцитозных (пиноцитозных) везикул, на билиарном полюсе - многочисленные везикулы гладкой цитоплазматической сети, гипертрофированный комплекс Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными, в них присутствовали небольшие осмиофильные структуры. Вблизи желчных капилляров часто встречались остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью.

Повышенная эндоцитозная (пиноцитозная) активность также была характерна для активированных форм эндотелиоцитов и клеток Купфера. В синусоидах часто располагались переходные формы моноцитов - клетки с большим бобовидным ядром, электронно-прозрачной цитоплазмой, в которой присутствовали многочисленные укороченные трубочки гранулярной цитоплазматической сети, первичные лизосомы, комплекс Гольджи, небольшие митохондрии и вакуоли с гомогенным содержимым; плазмалемма формировала множественные эндоцитозные/пиноцитозные везикулы. Усиление эндоцитозной (пиноцитозной) активности гепатоцитов, эндотелиоцитов и клеток Купфера (моноцитов) было наиболее манифестным при действии амида БК. После введения БК практически во всех клетках Купфера содержалось большое количество фагосом с осмиофильной зернистостью, эти же мельчайшие частицы диффузно распределялись по цитоплазме клеток и представляли собой фагоцитированные частицы БК.

В то же время при действии обоих тритерпеноидов отмечался некроз и некробиоз отдельных гепатоцитов и эндотелиоцитов, преимущественно в перицентральной зоне, формирование пристеночных скоплений клеточного детрита.

Через 14 сут после введения БК и ее амида ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Хорошо была развита гладкая цитоплазматическая сеть, везикулы которой встречались как на билиарном, так и на синусоидальном полюсах. В гепатоцитах присутствовали небольшие поля гликогена, отмечалась его умеренная секвестрация. В некоторых клетках отмечалось неравномерное расширение профилей гранулярной цитоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства. Во всех гепатоцитах сохранялась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы. Для амида БК характерным было появление в некоторых гепатоцитах крупных митохондрий с просветленным матриксом. Эндотелий синусоидов был представлен в основном активированными формами, но после введения амида БК отмечалось также появление некротизированных эндотелиоцитов. В обоих случаях наблюдалась значительная обтурация просветов синусоидов мононуклерами.

Через 3 сут после введения ЦФ и БК ультраструктура гепатоцитов была сходна с таковой после введения только одного ЦФ. В гепатоцитах присутствовало большое количество гликогена, который был подвержен лизису и секвестрации, субплазмалеммально локализовались липидные включения и вакуоли с осмиофильным содержимым. Профили гранулярной цитоплазматической сети были неравномерно расширены, гладкая цитоплазматическая сильно редуцирована. Изменения тонкой структуры митохондрий касались частичной редукции крист. На билиарном полюсе часто регистрировались вторичные лизосомы и остаточные тельца с мелкой осмиофильной зернистостью. В этот срок эксперимента в просветах синусоидов и перисинусоидально располагалось большое количество клеток Купфера с многочисленными фагосомами с мелкой осмиофильной зернистостью. В отличие от введения только одного ЦФ в данном случае отмечалась выраженная эндоцитозная активность синусоидальной плазмолеммы гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отмечался выраженный полиморфизм митохондрий, которые были представлены часто крупными формами с разрыхленным матриксом. В гепатоцитах часто выявлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети, преимущественно на билиарном полюсе. Отмечались гиперплазия и гипертрофия структурных элементов комплекса Гольджи. Желчные капилляры, как правило, были расширенными и содержали осмиофильную субстанцию. Отмечалась высокая эндоцитозная активность гепатоцитов и клеток Купфера.

Через 14 сут после введения ЦФ и БК отмечалась нормализация ультраструктуры одних гепатоцитов и усиление повреждения - других. В первых при этом сохранялись изменения тонкой структуры митохондрий, но появлялись везикулы гладкой цитоплазматической сети. Во вторых отмечались субплазмалеммальные скопления вакуолеобразных остаточных телец и выраженная секвестрация гликогена. Наблюдался некроз отдельных гепатоцитов. В некоторых случаях регистрировалось нарушение плотных контактов между соседними гепатоцитами, формирование апоптотических телец, которые попадали в просветы синусоидов, где резорбировались макрофагами. Через 14 сут после введения ЦФ и амида БК ультраструктура гепатоцитов была близка к норме. Отличительной чертой ультраструктурной организации гепатоцитов при действии амида БК было присутствие большого количества крупных митохондрий с неравномерно расширенными кристами. Биологические эффекты обоих тритерпеноидов проявлялись в усилении эндоцитозной активности как гепатоцитов, так и эндотелиоцитов и клеток Купфера. В обоих случаях сохранялся тромбоз части синусоидов мононуклеарами.

Морфологические изменения миокарда через 3 сут после введения ЦФ заключались в увеличении количества кардиомиоцитов с контрактурными повреждениями. Наблюдались умеренный интерстициальный отек и диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами. Через 14 сут в этой группе животных мозаичность повреждений сохранялась, нарастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы. Усиливалась фенотипическая гетерогенность кардиомиоцитов - встречались как атрофированные, так и гипертрофированные клетки. Последнее обстоятельство способствовало восстановлению массы сердца. Сохранялись гемодинамические расстройства, в некоторых случаях происходило усиление интерстициального и периваскулярного отека. Абсолютная численность кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ существенно не изменялась, что свидетельствовало о сохранении клеточной формы регенерации кардиомиоцитов. В то же время следует отметить заметное уменьшение (на 31%) доли одноядерных кардиомиоцитов и увеличение (на 10%) доли двуядерных клеток. В миокарде крыс в этот срок эксперимента появлялись кардиомиоциты, в которых происходило митотическое деление ядер.

Через 14 сут после введения ЦФ нарушения гемодинамики сохранялись. Практически у всех животных кровеносные сосуды и капилляры кроме форменных элементов крови содержали плазму, наблюдались также явления плазморрагии. Количество кардиомиоцитов с литическими и вакуолеобразными изменениями цитоплазмы возрастало. В то же время общее количество кардиомиоцитов через 14 сут после введения ЦФ возрастало на 50%, при этом доля одноядерных клеток также возрастала, но оставалась уменьшенной (на 13%) по сравнению с контролем.

При введении ЦФ и БК в миокарде животных через 3 сут более выраженной была мозаичность повреждений кардиомиоцитов, чем при введении только ЦФ. Возрастало количество клеток с контрактурными повреждениями. Как и при введении ЦФ, отмечались выраженные нарушения гемодинамики. Через 14 сут сохранялась мозаичность повреждений миокарда. Возрастало количество кардиомиоцитов с литическими изменениями цитоплазмы (у некоторых животных их доля составляла 30 - 40%). Количественные изменения популяции кардиомиоцитов через 3 сут после введения ЦФ и последующего введения БК были такими же, как и после введения ЦФ. Через 14 сут эксперимента в миокарде животных в отличие от группы крыс, которым вводили только ЦФ, изменений в количественном соотношении одно- и двуядерных кардиомиоцитов не происходило.

При введении ЦФ и амида БК через 3 сут эксперимента также манифестировали контрактурные и литические повреждения кардиомиоцитов. Одновременно присутствовали кардиомиоциты, в саркоплазме которых наблюдались многочисленные вакуолеобразные расширения. Через 14 сут усиливались проявления некробиоза и атрофии одних кардиомиоцитов и гипертрофия других; сохранялась мозаичность повреждения мышечных сегментов. Нарушения гемодинамики манифестировали, выраженность отека стромы варьировала. Наблюдалась диффузная инфильтрация стромы мононуклеарами, количество которых возрастало также в адвентиции интрамуральных артерий. Выявлено уменьшение общей численности кардиомиоцитов (на 26%) через 3 сут эксперимента при сохранении соотношения одно- и двуядерных клеток. К 14-м суткам эксперимента происходило восстановление общей численности кардиомиоцитов в сердце, но при этом уменьшалась (на 35%) доля одноядерных клеток и возрастала (на 19%) доля двуядерных клеток.

В группе с изолированным введением БК и амида БК через 3 сут наблюдались сходные изменения кардиомиоцитов: сочетание контрактурных и литических повреждений. Через 14 сут в миокарде животных, получавших БК, отмечено увеличение количества атрофированных и некробиотически измененных кардиомиоцитов при одновременном увеличении количества гипертрофированных клеток. Гемодинамические нарушения сопровождались умеренной диффузной инфильтрацией стромы миокарда мононуклеарами; у некоторых животных отмечался мелкоочаговый кардиосклероз. Через 14 сут после введения амида БК происходило усиление литических повреждений отдельных кардиомиоцитов. Отмечалось развитие диффузного и мелкоочагового кардиосклероза. Введение крысам БК и ее аланинового амида не вызывало заметного изменения общей численности кардиомиоцитов в сердце во все сроки эксперимента. Однако через 3 сут после введения амида БК выявлено увеличение на 92% доли одноядерных кардиомиоцитов и уменьшение доли дву- и многоядерных клеток. Через 14 сут после введения БК и ее амида происходило достоверное уменьшение доли одноядерных кардиомиоцитов соответственно на 39 и 28%.

По данным электронно-микроскопического анализа, введение ЦФ вызывало через 3 сут эксперимента умеренно выраженный преимущественно очаговый лизис миофибриллярных пучков, расширение везикул гранулярной и агранулярной саркоплазматической сети и деструкцию митохондрий с образованием миелиноподобных остаточных телец. При действии ЦФ в кардиомиоцитах сохранялось большое количество гликогена, наблюдалась его секвестрация. Ультраструктурные изменения ядер кардиомиоцитов проявляются преимущественно в изменении их формы, значительных инвагинациях ядерной оболочки и транслокации в субсарколеммальную зону. Через 14 сут после однократного введения ЦФ происходило восстановление ультраструктуры большинства кардиомиоцитов.

БК и ее амид при изолированном введении вызывали сходные с ЦФ, но менее выраженные изменения ультраструктуры кардиомиоцитов. К наиболее значимым повреждениям ультраструктуры относились лизис саркоплазматического матрикса, особенно в околоядерной зоне, умеренный лизис миофибриллярных пучков, расширения везикул агранулярной саркоплазматической сети. Литические изменения миофибриллярных пучков были незначительными, в этих участках всегда локализовались полисомы, наблюдалось новообразование миофиламентов. Важно отметить, что при действии БК отмечалось формирование сарколеммой эндоцитозных везикул и кавеол. К особенностям амида БК относится его способность вызывать в некоторых клетках значительные повреждения тонкой структуры митохондрий (диффузный лизис митохондриального матрикса, редукцию крист и нарушение их упаковки), которые манифестировали на протяжении всего эксперимента. Следует отметить, что эти изменения были наиболее выраженными также в первые 3 сут эксперимента, восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при использовании тритерпеноидов происходило быстрее, чем после воздействия ЦФ.

При последовательном применении ЦФ и тритерпеноидов в первые 3 сут воздействия проявлялся их синергизм в отношении основных видов ультраструктурных изменений кардиомиоцитов - литических повреждений миофибрилл, расширениях везикул саркоплазматической сети и межмембранного околоядерного пространства (основных ультраструктурных маркеров регенераторно-пластической недостаточности кардиомиоцитов). Восстановление ультраструктуры кардиомиоцитов при комбинированном применении ЦФ и тритерпеноидов происходило быстрее. Во многих кардиомиоцитах в саркоплазме присутствовали многочисленные полисомы, в околоядерной зоне отмечалась гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи.

Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что изучаемые соединения вызывают морфофункциональные изменения в миокарде, сходные с ЦФ.

Литические и некробиотические повреждения кардиомиоцитов обусловлены цитотоксическим действием исследуемых агентов. Наиболее выраженными эти изменения были при сочетанном введении ЦФ и амида БК, что обусловило наиболее значительное уменьшение массы сердца на 3-и сутки эксперимента и снижение общей численности кардиомиоцитов. В то же время, при использовании только одного амида БК происходило увеличение массы органа к 14-м суткам эксперимента и наиболее значительное возрастание пула одноядерных кардиомиоцитов.

Использование тритерпеноидов в то же время стимулировало процессы внутриклеточной регенерации кардиомиоцитов. Эти данные свидетельствуют о том, что БК и ее амид могут потенцировать как цитотоксические эффекты ЦФ, так и выступать в качестве индукторов регенераторных реакций миокарда.

Исследование клеточных механизмов коррекции бетулоновой кислотой и ее в-аланиламидом цитотоксических эффектов доксорубицина (ДОК) у интактных животных. Известно, что одним из основных проявлений токсичности антрациклиновых антибиотиков, наряду с кардиотропным эффектом, является развитие гипо- и апластических состояний кроветворения (Дыгай А.М. и др., 2009).

В результате анализа коэффициентов массы внутренних органов установлено снижение под действием ДОК массы тимуса к 14-му дню опыта (табл. 8).

Этот эффект частично компенсировался при совместном введении цитостатика и тритерпеноидов, что выразилось в отсутствии, по сравнению с контролем, значимых изменений данного показателя в группах с введением БК и аланиламида БК на фоне ДОК. В то же время при изолированном введении БК и в-алаБК не влияли на массу вилочковой железы.

Колебания массы селезенки во всех группах не выходили за пределы статистически значимых изменений с контролем, однако можно отметить в виде тенденции ее увеличение на 14-й день в группах с изолированным введением ДОК и в-аланиламида БК (в 1,8 раза). Что касается массы сердца, поражение которого стоит на первом месте среди побочных эффектов ДОК, то в данном опыте не отмечено достоверных изменений его массы ни в одной из групп.

В картине периферической крови (табл. 9) подопытных животных не выявлено статистически значимых сдвигов в содержании эритроцитов и тромбоцитов. К концу опыта отмечено снижение гематокрита во всех группах с введением ДОК, а также с изолированным введением в-алаБК. Кроме того, в те же сроки понизилось содержание гемоглобина у крыс, получивших только один цитостатик.

Введение ДОК вызвало у животных лейкоцитоз в конце эксперимента (увеличение лейкоцитов в 1,4 раза относительно контроля). В группах с введением тритерпеноидов на фоне ДОК количество лейкоцитов достоверно не отличалось от контроля.

Показатели лейкоцитарной формулы крови во всех группах статистически значимо не отличались от контроля в течение всего опыта (табл. 10). Однако в группе с изолированным введением ДОК можно отметить как тенденцию увеличение к 14-му дню количества сегментоядерных нейтрофилов (в 1,8 раз) и моноцитов (в 1,4 раза). Введение тритерпеноидов на фоне ДОК оказывало небольшой корректирующий эффект, снижая нейтрофилез и моноцитоз соответственно в 1,3 и 1,2 раза (относительно группы с ДОК).

Полученные результаты показали, что введение цитостатика в дозе 7 мг/кг не оказывает существенного патологического влияния на картину периферической крови. Введение ДОК вызвало лишь изменение со стороны белой крови в виде достоверного лейкоцитоза к 14-м суткам наблюдения. При этом соотношение форменных элементов в лейкоцитарной формуле не отличалось от контроля. Тем не менее, БК и в-алаБК на фоне ДОК проявили тенденцию к нормализации показателей белой крови, что коррелировало с результатами, полученными в опыте с ЦФ. Отмеченные выше сдвиги в белой крови под действием ДОК согласуются с литературными данными об абортивном увеличении зрелых форм нейтрофилов в костном мозге к 4 - 7-м суткам после введения препарата в максимально переносимой дозе (Гольдберг Е.Д. и др., 1999).

Описанные в литературе механизмы коррекции функций лимфоидных органов после воздействия ЦФ и ДОК в целом одинаковы и связаны с ролью Т-лимфоцитов в восстановлении костномозгового и селезеночного кроветворения. В представленной работе характер и степень выявленного гематотоксического эффекта ДОК определялись величиной введенной дозы, которая составляла половину от максимально переносимой. В этих условиях не удалось достичь значимого токсического действия цитостатика на кроветворную систему и, соответственно, выявить корректорное действие лупановых агентов. Однако в данном случае, так же как и в опыте с ЦФ, наблюдалась тенденция к нормализации лейкоцитов крови и массы тимуса при сочетанном введении ДОК и тритерпеноидов, свидетельствующая о иммунопротекторном действии БК и ее аланиламида.

Морфологические изменения печени. Повреждения печени после введения ДОК проявлялись в виде умеренной жировой дистрофии гепатоцитов (преимущественно мелкокапельной) и значительных литических изменениях цитоплазмы («опустошении» цитоплазмы, как правило, это был лизис больших скоплений гликогена). Гемодинамические нарушения, проявлявшиеся в ранние сроки эксперимента полнокровием и окклюзией синусоидов (многие сосуды были заполнены плазмой), усиливались к 14-м суткам наблюдения. К концу эксперимента в печени развивался венозный застой, который был также следствием гемодинамических нарушений в большом круге кровообращения. На этом фоне регистрировались преимущественно перицентральные некрозы гепатоцитов и инфильтрация очагов некроза мононуклеарными клетками в основном лимфоидного ряда.

Наблюдалось также нарушение поглотительной, накопительной и экскреторной функции гепатоцитов, ультраструктурными маркерами этих изменений были снижение количества эндоцитозных/пиноцитозных везикул и числа микроворсинок плоть до сглаживания поверхности гепатоцитов на синусоидальном полюсе и спавшиеся диктиососмы комплекса Гольджи. В то же время в других гепатоцитах отмечалось увеличение площади синусоидальной поверхности за счет сокращения латеральной поверхности и образования микроворсинок, отражающего усиление трансмембранного обмена.

Ультраструктурный анализ синусоидальной выстилки и пространства Диссе показал, что токсическое действие ДОК вызывало окклюзию микрососудов и синусоидных капилляров печени клетками крови. В пространство Диссе мигрировали многочисленные клетки лимфо- и моноцитарного ряда, плазмоциты разной функциональной активности. Наблюдалось значительное расширение синусоидов, заполненных гипертрофированными макрофагами (клетками Купфера). При этом свободный (полезный) просвет синусоидов сужался; во многих синусоидах наблюдался некроз эндотелиальных клеток.

Следует особо подчеркнуть, что в данной модели доксорубицинового повреждения печени не отмечалось развитие перицеллюлярного фиброза во все сроки эксперимента, звездчатые клетки встречались очень редко. Основной клеточной популяцией среди соединительнотканных клеток были клетки Купфера, которые часто содержали гетерогенные липидные включения. К 14-м суткам в синусоидах появлялись сегментоядерные нейтрофилы, активированные плазмоциты с хорошо развитой цитоплазматической сетью и активные формы клеток Купфера с обилием лизосом, фагосом и остаточных телец. Миграция нейтрофилов в печень в эти сроки была связана с некрозами гепатоцитов.

Через 3 сут после введения ДОК с последующим введением БК и ее амида морфологические изменения печени были сходными. Отмечались умеренная субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, некроз отдельных гепатоцитов, венозное и синусоидальное полнокровие, более выраженное при применении амида БК. В обоих случаях отмечалась умеренная миграция моноцитов (в основном клеток Купфера) в перисинусоидальные пространства. Через 14 сут после введения ДОК и БК сохранялась субплазмалеммальная липидная инфильтрация гепатоцитов, в которых при этом отмечались массивные накопления гликогена. После применения ДОК и амида БК липидная инфильтрация гепатоцитов была более выраженной (по характеру как мелко-, так и крупнокапельная), при этом отложения гликогена были менее значительными, чем после применения БК. При использовании обоих тритерпеноидов регистрировалось неравномерное полнокровие сосудов. В этот срок эксперимента усиливалась мононуклеарная инфильтрация печеночной дольки.

Ультраструктурные изменения гепатоцитов через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК и ее амида заключались в усилении секвестрации гликогена, частичной деструкции митохондриальных крист и усилении аутофагоцитоза. Через 14 сут подобные изменения регистрировались в отдельных гепатоцитах. Следует отметить, что при сочетанном применении ДОК и тритерпеноидов так же, как и в случае с ЦФ, усиливалась эндоцитозная активность гепатоцитов, отмечалась гипертрофия и гиперплазия структурных элементов комплекса Гольджи. Синусоидные капилляры во все сроки эксперимента были обтурированы мононуклеарами и клеточным детритом.

Морфологические изменения миокарда после введения ДОК были более значительными при сравнении с ЦФ. Через 3 сут после введения ДОК отмечались литические изменения саркоплазмы и ультраструктур кардиомиоцитов. Литические изменения миофибрилл при доксорубициновом повреждении чаще носили диффузный характер. В изменениях ядрышек чаще манифестировали явления сегрегации фибриллярного и гранулярного компонентов нуклеолонемы. Практически во всех кардиомиоцитах наблюдались расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. В то же время изменения митохондриального компартмента были незначительными и заключались в основном в неравномерном расширении крист. Важно отметить, что при доксорубициновых, как и при циклофосфановых повреждениях кардиомиоцитов, в очагах лизиса миофибрилл в этот срок эксперимента всегда регистрировались полисомы и наблюдались хаотично расположенные новообразованные миофиламенты, что свидетельствовало об активации процессов внутриклеточной регенерации.

Через 14 сут после однократного введения крысам ДОК литические и деструктивные изменения отдельных кардиомиоцитов усиливались (выявлялись очаговые и диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и расширенные везикулы агранулярной саркоплазматической сети). В этот срок эксперимента манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства, отмечались явления аутофагоцитоза (особенно в околоядерной зоне).

В группе крыс, получавших ДОК и в последующем БК или ее амид, ультраструктурные изменения кардиомиоцитов были более выраженными, чем в аналогичных группах с циклофосфановыми повреждениями. Через 3 сут после введения ДОК и последующего введения БК во многих кардиомиоцитах выявлялись значительные диффузные литические повреждения миофибриллярных пучков и саркоплазматического матрикса, в результате чего саркоплазма клеток выглядела разреженной. Манифестировали также расширения межмембранного околоядерного пространства и саркоплазматической сети. Во многих кардиомиоцитах эти изменения были даже более выраженными, чем при введении только ДОК. К 14-м суткам общий характер изменений кардиомиоцитов сохранялся, но значительно уменьшалась выраженность литических изменений миофибриллярных пучков, отмечалось более компактное расположение органелл в клетках. Одновременно в некоторых клетках наблюдались значительные вакуолеобразные расширения межмембранного околоядерного пространства, в которых часто регистрировались мембранозные образования. Следует также отметить, что в кардиомиоцитах часто встречались единичные митохондрии со значительным лизисом матрикса и выраженной редукцией крист.

В кардиомиоцитах крыс, получавших ДОК и в последующем амид БК, через 3 сут эксперимента также регистрировался весь спектр отмеченных выше ультраструктурных изменений: диффузные литические изменения миофибриллярных пучков и митохондриального компартмента, расширения межмембранного околоядерного пространства и агранулярной саркоплазматической сети. Отмечался выраженный полиморфизм ядер, в которых содержались фрагментированные и сегрегированные ядрышки. В саркоплазме кардиомиоцитов наблюдалось большое количество равномерно распределенных полисом. Через 14 сут в кардиомиоцитах значительно снижалась выраженность литических изменений миофибрилл и митохондрий; реже встречались клетки с расширенным межмембранным околоядерным пространством. Регистрировался полиморфизм ядер кардиомиоцитов, в которых содержались фрагментированные ядрышки или ядрышки с преимущественно гранулярным компонентом.

В миокарде при введении ДОК и тритерпеноидов в первые 3 сут отмечен их синергизм с цитостатиком в отношении выраженности ультраструктурных изменений основных компартментов кардиомиоцитов, но без длительного подавления процессов внутриклеточной регенерации и более быстрым восстановлением тонкой структуры клеток. Участие амида БК в стимуляции регенераторных резервов клеток показано на примере восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов после однократного введения ЦФ (Лушникова Е.Л. и др., 2007, 2008). При этом для амида БК характерны более выраженные изменения ультраструктуры митохондрий, чем для БК. Выраженные изменения ультраструктуры митохондрий под действием амида БК косвенно свидетельствуют о возможной активации проапоптотических факторов, обеспечивающих внутренний митохондриальный механизм клеточной смерти, который является ведущим механизмом для тритерпеноидных соединений.

Полученные нами данные косвенно указывают на наличие у амида БК апоптоз-индуцирующей активности, что, вероятно, связано с его противоопухолевым действием. Важнейшей особенностью действия амида БК, выявленного нами в условиях цитостатического воздействии, является активация им репаративных сигнальных путей, с которыми связана стимуляция пластических резервов клетки. Признаками такой стимуляции были повышение на фоне сочетанного введения амида и ЦФ регенераторного резерва печени и сердца в виде увеличения пула двуядерных гепатоцитов и одноядерных кардиомиоцитов, а также более быстрое восстановления ультраструктуры кардиомиоцитов на фоне ДОК. Протекторное действие БК в условиях цитотоксического воздействия ЦФ менее выражено, оно проявилось лишь в виде стимулирующего влияния на гранулоцитарный росток крови. БК в меньшей степени, чем ее амид, снижала некрозогенное действие ЦФ в печеночной паренхиме, а также демонстрировала большую выраженность литических повреждений миофибрилл кардиомиоцитов на фоне ДОК.

Установлено, что вызываемая тритерпеноидами олеонанового типа (CDDO CDDO-Me) митохондриальная дисфункция предшествует гибели опухолевых клеток путем аутофагии (Samudio I. еt al., 2008). При этом в клетках клонированной хронической миелоидной лейкемии с помощью трансмиссионной электронной микроскопии было выявлено интенсивное образование везикул, окруженных двойной мембраной. Кроме того, иммуногистохимическими методами было обнаружено увеличение окрашивания белка LC3B, обычно связанного с аутофагосомами. Развитию аутофагии предшествовало резкое увеличение реактивных кислородных частиц, истощение пула внутриклеточного глутатиона и уменьшение потребления клетками кислорода. Причем если в субтоксических дозах тритерпеноиды нарушают процессы дыхания в опухолевых клетках, то в токсических вызывают быстрое падение митохондриального потенциала, окислительный стресс и гибель в результате апоптоза или аутофагии.

Исследование коррекции бетулоновой кислотой и ее производными цитотоксических эффектов комбинированного введения цитостатиков по схеме СНОР у интактных животных

В данной серии экспериментов изучались корректорные свойства БК и двух ее аланиламидных производных (в-алаБК и Ме-в-алаБК).

Исследование морфологической картины периферической крови после введение крысам комплекса химиотерапевтических препаратов (ПХТ) выявило угнетение эритроцитарного и лейкоцитарного ростка. К 5-м суткам после цитостатического воздействия количество лейкоцитов крови снизилось на 42% и удерживалось на этом уровне в течение 10 дней. Уменьшение числа циркулирующих эритроцитов было небольшим 6-9%. Содержание тромбоцитов в циркулирующей крови достоверно не отличалось от контроля во всех группах с ПХТ. Введение БК на фоне ПХТ не оказало заметного корригирующего влияния на численность клеток белой крови. Ее аланинамидные производные, напротив, задержали развитие лейкопении и несколько снизили ее тяжесть. Так в группе с введением в-алаБК количество лейкоцитов в крови на 5-й день после ПХТ уменьшилось на 28%, а в группе с его эфирным аналогом на 10-й день опыта - на 15%. В конце постцитостатического периода содержание эритроцитов и лейкоцитов в группах с введением аланинамидных производных оставалось ниже нормы, бетулоновая кислота повысила лишь уровень красных кровяных клеток. Показатели гемоглобина во всех группах коррелировали с количеством эритроцитов. Уменьшение гематокрита в первые 10 дней после ПХТ было связано с падением клеточности крови в этот период.

В результате анализа лейкоцитарной формулы, установлено достоверное снижение лимфоцитов в ответ на ПХТ (на 14 - 22% относительно контроля), сохранявшееся на протяжении всего постцитостатического периода. Введение БК и ее производных не оказало заметного влияния на выраженность лимфопении, однако Ме-в-алаБК в первые 5 дней после ПХТ частично купировал этот эффект, повысив уровень лимфоцитов на 6%. Кроме того, тритерпеноиды оказали корригирующий эффект в отношении моноцитоза, развившегося под влиянием цитостатиков. В первые 5 дней после ПХТ в группах с введением БК и Ме-в-алаБК количество моноцитов оставалось в норме, в то время как в группе с изолированным введением цитостатиков их уровень повысился в 1,6 раза. В конце постцитостатического периода отмечена тенденция к более быстрому восстановлению содержания моноцитов в крови под действием всех тритерпеноидов.

На фоне вызванной цитостатиками лимфопении у крыс наблюдалось достоверное увеличение сегментоядерных нейтрофилов (максимально в 2,0 раза на 10-й день после ПХТ). В конце цитостатического периода данный показатель снижался, однако оставался в 1,5 раза выше по сравнению с контролем. Введение БК и ее аланинамидных производных не оказало заметного корригирующего влияния на выраженность нейтрофилеза, вызванного ПХТ. Тритерпеноиды также не влияли на уровень эозинофилов в крови, превысивший норму во всех группах с ПХТ в конце постцитостатического периода.

Следует отметить, что в конце постцитостатического периода во всех опытных группах и в референсной группе с ПХТ наблюдалось постепенное восстановление показателей периферической крови и различия между группами уменьшались. Так на 14-й день введения тритерпеноидов на фоне ПХТ, их влияние выражалось в небольшом подъеме эозинофилов и уменьшении моноцитоза, в то время как количество нейтрофилов и лимфоцитов в основном соответствовала показателям референсной группы.

Таким образом, корректорный эффект тритерпеноидов в условиях ПХТ выражался в ослаблении ее угнетающего эффекта на лейкоцитарный росток крови в раннем постцитостатическом периоде. При этом регулирующее влияние агентов было направлено преимущественно на моноциты, а не гранулоциты.

Анализ препаратов костного мозга через 15 дней после цитостатического воздействия показал, что во всех группах с ПХТ в целом происходит восстановление костномозгового кроветворения. Содержание стромальных и миелоидных клеток у крыс не выходило за пределы аналогичных показателей в контроле.

Соотношение предшественников и зрелых миелоцитов (индекс созревания) соответствовало норме. Вместе с тем, в костном мозге крыс с изолированным введением цитостатиков отмечалось увеличение количества эозинофильных и моноцитарных клеток (в 1,3 и 1,7 раз относительно контроля).

В группах с введением БК и -алаБК происходила коррекция этих элементов до уровня контроля. Эфир амида подобным эффектом не обладали.

Аланинамидные производные БК нормализовали также количество плазматических клеток, которое возрастало после введения цитостатиков. Состояние гемопоэтических предшественников эритроцитов и тромбоцитов свидетельствовало о завершении восстановительного периода эритро- и мегакариоцитопоэза через 15 дней после ПХТ. Достоверно не отличалось от контроля и количество костномозговых лимфоцитов у всех животных после ПХТ, хотя содержание эритроцитов и лимфоцитов в циркулирующей крови в эти сроки еще не достигало нормы.

Данные анализа костного мозга свидетельствуют о более ранней нормализации основных клеточных элементов под действием тритерпеноидов с преимущественным влиянием на клетки моноцитарного ряда.

Отмеченные ранее особенности корректорного действия тритерпеноидов в опытах с циклофосфаном и доксорубицином проявились также на фоне экспериментальной химиотерапии по схеме СНОР. В частности, выявленный тимус-протекторный эффект агентов подтвердился в результате морфологического исследования ткани этого лимфоидного органа.

Показано, что через 15 дней после цитостатического воздействия в тимусе наблюдается мелкоочаговая гипоплазия лимфоидной ткани, которая проявлялась в виде относительного снижения плотности его лимфоклеточной популяции, сужения корковой части, увеличения числа телец Гассаля в мозговом веществе (табл. 11).

По литературным данным, в результате воздействия противоопухолевых препаратов наступает дезорганизация тимуса, которая характеризуется истончением коркового вещества, инверсией окраски коркового и мозгового слоев и сопровождается сокращением массы тимуса.

При этом количество Thy1,2+ в костном мозге животных резко сокращается (Гольдберг Е.Д. и др., 1999).

В нашем эксперименте под влиянием СНОР корково-мозговой индекс снизился в 1,6 раз относительно контроля.

Это указывает на уменьшение поступления из костного мозга в корковую зону тимуса низкодифференцированных лимфоцитов, что может являться следствием как угнетения костномозгового кроветворения, так и гипоплазии самого тимуса.

Последнее предположение подтверждается данными морфологического анализа, выявившим увеличение числа телец Гассаля, которые являются продуктами дегенерации медулярных клеток тимуса и содержат в основном кератины.

Введение тритерпеноидных агентов на фоне СНОР привело к повышению корково-мозгового индекса и снижению количества телец Гассаля в паренхиме тимуса. Наиболее выраженный тимус-протекторный эффект проявил -алаБК, увеличивший тимический индекс в 1,8 и снизивший число телец Гассаля в 2,2 раза.

Соответствующее корректорное действие его метилового эфира и самой БК проявилось слабее (см. табл. 11).

Морфологическое исследование почек, проведенное через 15 дней после введения комплекса цитостатиков, выявило развитие альтеративных процессов, как в паренхиме, так и клубочках.

На гистологических срезах наблюдалось полнокровие сосудов, отек интерстиция, расширение мезангия, сужение просвета капсулы Шумлянского-Боумена, дистрофические и атрофические изменения эпителиоцитов канальцев.

На всем протяжении канальцевой системы, в том числе и в собирательных трубочках, расширенный просвет был заполнен белково-клеточными массами, встречались гиалиновые цилиндры.

На 15-е сутки после ПХТ СНОР у животных референсной группы объемная плотность нефроцитов, находящихся в состоянии дистрофии, превышала соответствующие показатели в контроле в 37,5 раз, в состоянии некроза - в 3,2 раза. Сужение просвета капсулы составляло 27% от контроля (табл. 12).

Оценка влияния изучаемых соединений на альтеративные процессы в почках, вызванные СНОР, показала, что тритерпеноиды существенно ослабляли нефротоксическое действие цитостатических препаратов. Введение крысам БК и ее производных вызывало снижение объемной плотности нефроцитов в состоянии дистрофии по сравнению с изолированным введением цитостатиков. На фоне БК объемная плотность нефроцитов проксимальных канальцев в состоянии дистрофии уменьшилась на 72%, на фоне в-алаБК - на 65%, Ме-в-алаБК- на 69%. Объемные плотности некрозов снижались у животных, получавших в-алаБК - в 2,4 раза, Ме-в-алаБК - в 2,5 раза, тогда как под влиянием БК существенного снижения не наблюдалось. Все тритерпеноиды, кроме Ме-в-алаБК, способствовали восстановлению просвета капсулы (табл. 16).