Некоторые историко-научные уроки

П. Г. Светлов предложил у организмов с половым размножением особо выделять проэмбриональный период, который начинается со стадии формирования половых клеток и заканчивается оплодотворением При образовании яйцеклетки, наряду с мейозом, происходит детерминация хода развития будущей особи: морфологических осей, типа симметрии, кортикального слоя цитоплазмы и обособление ее участков, соответствующих будущим органам. По словам П. Г. Светлова, "в ооците имеется как бы каркас, отражающий наиболее общие черты архитектоники строящегося организма". Этот вывод подтвержден с открытием генов гомеобокса, материнская активность которых уже на уровне яйцеклетки определяет будущую архитектонику особи.

После оплодотворения во внутриутробном развитии плода выделяют три этапа-(Шабалов, 1995): бластогенез -- первые две недели после оплодотворения; эмбриогенез -- с момента имплантации бластоцисты до сформирования плаценты, с 16-ого до 75-ый день; фетогенез -- с 12-ой недели внутриутробной жизни до родов (с 76-ого по 280-ый день). Первичные половые клетки или гоноциты обнаруживаются уже в конце бластогенеза, а их детерминация происходит еще раньше. Таким образом, условия, в которых происходила беременность у бабушки, могут влиять на возникновение и проявление наследственных изменений у внучатого потомства!

Это обстоятельство экспериментально было доказано в модельных опытах П. Г. Светлова на мышах при исследовании характера выражения мутации микрофтальмии. Материнское влияние через цитоплазму яйцеклетки испытывает множество наследуемых признаков. Через цитоплазму экстрахромосомно могут наследоваться в потомстве изменения в проявлении и выражении разных генов, вызванные однократным внешним воздействием (раздел 5.2.2). Сходное наследственное изменение свойств цитоплазмы происходит под действием некоторых хромосомных генов, как это изучено для ситуации гибридного дисгенеза. Некоторые механизмы такого рода наследуемых по материнской линии изменений могут быть основаны на "внутриклеточной популяционной генетике" (Хесин Р. Б., 1984), например, на различиях в соотношении разного рода автономных и полуавтономных цитоплазменных элементов, органелл, плазмид, регуляторных нуклеопротеидных комплексов и белков.

Зигота на стадии двух пронуклеусов и первых делений имеет ослабленный "геномный иммунитет", она становится как бы промискуитетной для включения в геном чужеродных ДНК-носителей. В этот же период, видимо, с повышенной частотой происходит активация мобильных элементов и возникают инсерционные нестабильные мутации. Они возникают пучками еще на стадии стволовых клеток, приводя к гонадно-соматическому мозаицизму (Green, 1967; Golubovsky, Ivanov, Green, 1977; Golubovsky, 1980; Голубовский, 1985; Герасимова,. 1990).

Эти сведения важны для эпидемиологии мутационного процесса у человека, например, при оценке возможного увеличения частоты мутаций после вирусных пандемий. Вирусы и их нуклеиновые кислоты при попадании в клетку индуцируют инсерционные мутации. Можно ожидать, что при вирусной пандемии (например, эпидемии гриппа) частота соматических мутаций и разного рода аномалий развития повышена у лиц, родившихся в год или спустя год пандемии. Оценку же частоты генеративных мутаций (в гаметах) следует проводить уже во внучатом поколении. Это соображение вошло в учебник неонаталогии (Шабалов, 1995).

Переключение генов и импринтинг в аспекте медицинской генетики

Импринтинг представляет собой явление хромосомной памяти, когда геномы (в узком смысле этого термина -- наборы хромосом), отдельные хромосомы или определенные локусы "помнят" свое происхождение, пришли ли они от мужского или женского родителя. В более общем виде импринтинг определяют как зависимое от пола обратимое изменение характера активности геномов, хромосом или отдельных локусов, которое наследуется в ряду поколений (Баранов, 1988; Сапи-енца, 1990; Peterson, Sapienza, 1993). В зародышевом пути или в стволовых клетках -- предшественницах гамет следующего поколения старые отпечатки "стираются", а затем в ходе гаметогенеза снова происходит запоминание или запечатление в соответствии с тем полом, в котором образуются новые гаметы. Таким образом, пол-специфичные эпигенетические изменения опознаются, декодируются, а потом вновь кодируются по женскому или мужскому типу. Иными словами, это явление эпигенетической изменчивости, когда наследуемые изменения не затрагивают текста ДНК и являются обратимыми.

С середины 60-х годов, когда была сформулирована концепция генной регуляции, стало очевидным, что дифференциация клеток и тканей в онтогенезе основана на дифференциальной регуляции генной активности. В каждом эпигенетическом феномене обычно можно и нужно выделить три составляющих или регуляционную триаду: 1) сигнал, который действует на ген переключатель, 2) восприятие сигнала рецепторной областью гена-переключателя (switch gene) и выбор этим геном одного из альтернативных режимов функционирования; 3) поддержание выбранного состояния в ряду клеточных поколений с помощью батареи генов фактор (температура, плотность популяции, наличие цитобионта) либо генетический фактор, как, например, соотношение половых хромосом и аутосом или присутствие определенного гена-регулятора. До сих пор широко распространена неточность или ошибка -- говорить лишь о средовой регуляции, когда средовой фактор является лишь сигналом, упуская из виду всю триаду и непременностъ гена-переключателя. Примером может служить интересная статья Д. Гродницкого (2000), где обсуждается переопределение пола у равноногих ракообразных, когда генотипически мужские особи становятся самками в случае размножения в цитоплазме бактерии-цитобионта Wollbachia.

Типичным примером эпигенетической триады регуляции: сигнал -- восприятие сигнала локусом-переключателем -- поддержание выбранного состояния, являются детерминация пола, инактивация одной из X-хромосом в соматических клетках у самок млекопитающих и хромосомный (генный) импринтинг. Эти сложные события происходят по сходному эпигенетическому сценарию. Он включает иерархическую цепь или каскад явлений, запускаемых всего одним ключевым геном, способным находиться в разных состояниях.

Эпигенетика детерминации пола

В случае детерминации пола у дрозофилы цепь эпигенных изменений расшифрована до молекулярного уровня. Можно сравнить основные принципы генетики пола у дрозофилы и у человека. Сравнение весьма уместно, ибо, напомню, хромосомные болезни у человека были на четверть века ранее открыты и смоделированы на дрозофиле.

У дрозофилы самки имеют при оплодотворении генотип XX, а самцы XY. В Х-хромосоме локализован основной ген-переключатель Sxl, способный под действием генотипического сигнала быть в двух альтернативных состояниях. У самок продукт гена всегда активен, у самцов -- неактивен. Соответственно, самки имеют генотип Sxl⁺/ Sxl⁺, a самцы -- Sxl⁰ /Y. Делеционные, инсерционные или точковые мутации "утраты функции" (loss of function) гена-переключателя Sxl в гомозиготе детальны у самок, но жизнеспособны у самцов. И, напротив, конститутивные мутации типа "приобретение функции" (gain of function), когда Sxl не способен переходить под действием сигнала в неактивное состояние, -- летальны у самцов.

Переключатель Sxl имеет два промотора: ранний и поздний. При импульсной активации первого промотора под действием сигнала у самок синтезируется РНК-связывающий белок. Затем этот белок (по типу эпигена -- раздел 4.6.) регулирует правильный сплайсинг собственной РНК с позднего промотора. В итоге синтезируется функционально активный белок SXL. Этот белок, в свою очередь, регулирует правильный сплайсинг и синтез функционально активного ДНК-связывающего продукта гена tra, transformer -- первого в каскадной цепи пол-определяющих генов. У гомозиготных мутантных самок tra/tra происходит реверсия пола, а у самцов мутация никак не проявляется, ибо в норме у них ген не активен. Таким образом, активное состояние Sxl⁺ гена-переключателя передается по цепочке к генам, запускающим половую дифференцировку.

Еще на заре генетики было установлено, что сигналом для детерминации пола у дрозофил служит хромосомный баланс: соотношение половых хромосом и аутосом. В статье, красноречиво названной "Сигнал детерминации пола или как мухи считают до двух" Томас Клайн (dine, 1993) анализирует, современный смысл понятия "хромосомный баланс". В Х-хромосоме локализованы два особых гена (sisA и sisB), названных "нумераторы", которые кодируют ДНК-связывающие белки и доза которых имеет важное сигнальное значение для статуса гена-переключателя. Оба гена транскрипционно активны с самого начала развития и их продукты активируют Sxl во всех клетках сомы. Активация раннего промотора переключателя Sxl зависит от концентрации Sis-белков, количество которых в 2 раза больше у XX-эмбрионов, нежели у XY. Таким образом, несколько размытое понятие "хромосомный баланс" получает конкретное молекулярное истолкование. Оценивается число нумераторов через концентрацию их продуктов. Соответственно оценивается число Х-хромосом с нумераторами/

Если взять за основу эпигенетическую триаду: сигнал -- восприятие сигнала геном-переключателем -- поддержание выбранного состояния, то можно сопоставить механизмы детерминации пола у человека и дрозофилы. У обоих видов женский пол имеет конституцию XX, а мужской -- XY. Однако, у дрозофилы возникающие иногда при нерасхождении половых хромосом особи генотипа XXY имеют женский пол, а у человека -- мужской (синдром Клайнфельтера). Y-хромосома человека несет ген SRY, одно присутствие которого определяет развитие по мужскому типу (Lyon, 1993). Ген этот клонирован, показано, что он кодирует ДНК-связывающий белок и что повреждение гена ведет к реверсии пола у генотипически мужских особей XY.

До начала 90-х годов полагали, что присутствия нормального гена SRY необходимо и достаточно для детерминации мужского пола. Однако были обнаружены особи XX с реверсией пола, не несущие вовсе ДНК Y-хромосомы. Как объяснить их происхождение?

Критический анализ этой проблемы дан в работе группы французских генетиков (McElreavey, 1993). На основе изучения статуса гена SRY y почти 100 индивидов XX с реверсией пола, а также родословных, где выщепляются особи с реверсией, пола авторы предложили "регуляторную каскадную гипотезу" определения пола у человека и других млекопитающих. В основе лежит известная схема с иерархией действующих генов: сигнальный ген (негативный регулятор) -- основной ген-переключатель -- гены, дифференцирующие пол по мужскому или женскому типу. Предполагается, что, пол-детерминирующий фактор SRY, найденный у самцов всех изученных млекопитающих, есть на самом деле сигнальный ген. Его продукт представляет собой ДНК-связывающий белок, который относится к группе белков, регулирующих транскрипцию. Согласно гипотезе, SRY у самцов подавляет транскрипцию или резко снижает активность ключевого гена-переключателя, обозначенного как Z. Но если у дрозофилы сигналом переключения состояния гена Sxl служит соотношение Х-хромосом и аутосом, то у человека ген SRY является доминантным геном-супрессором, подавляющим активность аутосомного переключателя Z, и тем самым сдвигающим развитие зиготы в сторону мужского пола. Таким образом, оказывается, что основной ген-переключатель, от которого зависит выбор полового развития, у человека еще не найден!

Пол-детерминирующее действие гипотетического гена Z у человека принципиально сходно с аналогичным геном Sxl у дрозофилы. В обоих случаях переключатель должен быть активен у самок и выключен у самцов. Данная гипотеза дает возможность объяснить обширный спектр отклонений в развитии пола и делать предсказания. Например, загадочное появление фенотипических мужчин с кариотипом XX и отсутствием гена SRY, но с тестикулярными тканями или истинных гермафродитов может быть связано с разного рода мутациями гена Z. С другой стороны, если произошла мутация в гене Z, которая делает его нечуствительным к ингибирующему действию SRY, z,^insensitive, то следует ожидать реверсии пола среди мужских генотипов XY, SRY⁺; Z⁺/Zⁱ . Подобные мутации (их называют конститутивными) должны быть доминантными и проявлять свое действие уже в гетерозиготе.

Действительно, недавно была описана группа пациентов генотипа XY со специфическими скелетными аномалиями и реверсией пола, которые имели разного рода мутации в аутосомном гене SOX9 (хромосома 17q). Эти мутации были доминантными, как и следовало ожидать в соответствии с гипотезой. Кроме того, продукт данного аутосомного гена также как и гена SRY относится к группе ДНК-связывающих белков и функционально активен в гонадных клетках Сертолли. Возможно, найдены два первых гена в каскадной эпигенетической цепи, контролирующей детерминацию пола у человека (Sinclair, 1995).

Установлено, что область белка SXL, ответственная за связывание с ДНК у млекопитающих эволюционно консервативна. Поэтому поиск ключевого гена-переключателя происходит и на модельных животных объектах. У свиней, коз, лошадей, например, описаны рецессивные аутосомные мутации интерсексуальности с исходно женским генотипом XX. Этого следует ожидать в случае мутации в гипотетическом ключевом гене Z (McElreavey, et al., 1993).

Инактивация Х-хромосомы как эпигенетическое изменение

Другим примером эпигенетических изменений, протекающих по известному сценарию сигнал -- выбор одного из альтернативных состояний -- поддержание, является инактивация одной из двух X-хромосом у самок млекопитающих. Путем инактивации одной из X-хромосом у самок млекопитающих происходит компенсация дозы генов, локализованных в Х-хромосомах. Молекулярный механизм X-хромосомной инактивации, цитологически установленной в 1961 году, оставался загадкой вплоть до недавнего времени (детальный обзор: Нестерова, Закиян, 1994). В 1996 году молекулярно-генетическими методами была подтверждена правильность ранее высказанной гипотезы, что в основе явления инактивации Х-хромосомы лежат разные транскрипционные состояния одного гена-переключателя (Penny, et al., 1996; Lyon, 1996).

В Х-хромосоме имеется центр инактивации Xic (X-inactivation centre), от которого в обе стороны распространяется сигнал инактивации Х-хромосомы в генотипе самок. В пределах этого центра есть ген, обозначаемый у человека как XIST, а у мышей -- Xisi (X -- inactive specific transcript). Если этот ген-переключатель в хромосоме транскрипционно активен (состояние Xist⁺), то в данной хромосоме запускается центр инактивации, и затем инактивация распространяется в обе стороны от центра на всю ее длину (так называемая цис-регуляция). В итоге Х-хромосома с активированным центром становится генетически инертной, и тем самым дозы сцепленных с полом генов у двух полов выравниваются (феномен дозовой компенсации).

Если ген XIST в данной Х-хромосоме "молчит", то она не инактивируется. Как же происходит переключение состояния локуса? Сценарий здесь принципиально сходен с тем, как переключается состояние гена, детерминирующего пол у дрозофил (у самок дрозофил, имеющих генотип XX, ген Sxl включен, а у самцов XY -- выключен). С областью расположения центра инактивации Xic связаны три функции, контролируемые отдельными генетическими элементами: 1) оценка числа X-хромосом, которые должны быть инактивированы -- "счетный механизм", 2) выбор конкретных Х-хромосом, в которых запускается работа центра и 3) распространение процесса инактивации на всю X-хромосому.

Предполагается, что в нормально работающей Х-хромосоме центр инактивации с геном XIST выключен. В каждой клетке имеется ограниченное количество супрессирующего фактора, который, связываясь с рецепторным участком центра инактивации, "заглушает" работу центра. Когда с помощью делеции был удален участок в 7 т. п. о. в первом экзоне гена Xist у мышей, то такие Х-хромосомы с нулевым аллелем Xist⁰ оставались всегда активными. У самок-гетерозигот Xist/Xist⁰ проявлялись только те сцепленные с полом мутации, которые находились в хромосоме с нефункциональным геном Xist⁰ (Penny D. G., et al., 1996). В норме Xist локус не кодирует белок, но с него считывается РНК размером в 15-17 т. п. о. Эта РНК остается в ядре, будучи ассоциированной с неактивной Х-хромосомой и выступает в роли сигнала для цис-инактивации соответствующей Х-хромосомы.

Таким образом, в пределах центра инактивации есть рецепторный участок, который чувствителен к соотношению Х-хромосом и аутосом. Если оно равно 1:2, то запускается работа гена Xist. Его РНК-транскрипт подавляет активность Х-хромосомы, в которой расположен работающий XIST(Xist) ген.

У млекопитающих известны случаи неслучайной инактивации X-хромосомы. У австралийских сумчатых инактивируется отцовская X-хромосома. А у межвидовых гибридов полевок рода Microtus обычно инактивируется та Х-хромосома, которая содержит блок гетерохроматина (Нестерова, Закиян, 1994). Нельзя исключить, что подобные отклонения не могут возникнуть при некоторых мутационных изменениях генома у человека.

Геномный импринтинг и аномалии оплодотворения

Наиболее яркое выражение импринтинга у млекопитающих -- это функциональная некомплементарность мужских и женских геномов. В начале 80-х годов в лаборатории английского эмбриогенетика М. Сурани (М. Surani) из Кэмбриджа в опытах на мышах разработал микротехнику, позволяющую производить удаление и трансплантацию пронуклеусов на уровне оплодотворенной яйцеклетки. После удаления мужского или женского пронуклеуса восстанавливали диплоидность путем подавления первого деления дробления цитохалазином (см. обзоры: Баранов, 1988; Solter, 1988). Развитие таких гиногенот и андрогенот останавливалось на самых ранних стадиях. Если гаплоидному андрогенетическому зародышу трансплантировать другой мужской пронуклеус, развитие шло только до стадии нейрулы.

Поразительные по красоте и убедительности опыты были произведены в той же лаборатории с искусственным получением триплоидов в оплодотворенной яйцеклетке, и затем с избирательным удалением либо женского, либо мужского дополнительного ядра. У готовой к оплодотворению яйцеклетки млекопитающих мейоз блокирован на одной из конечных стадий (у человека, к примеру, на стадии метафазы II), и образование второго полярного тельца (конечная стадия мейоза) происходит после начала проникновения спермия в ооплазму. При искусственном подавлении второго полярного тельца в момент оплодотворения получали триплоидные зиготы с тремя пронуклеусами, из которых два женских и один мужской. Затем диплоидный набор восстанавливали, удаляя либо один из женских, либо мужской пронуклеус. В первом случае развитие шло нормально, тогда как во втором случае (вариант гиногенеза) зародыш мог достигать периода органогенеза, но затем неминуемо погибал.

Эти и другие сходные опыты убедительно показали, что у млекопитающих нормальное развитие возможно только при сочетании мужского и женского геномов, и что эти геномы, имея один и тот же набор генов, эпигенетически различны. Существенно прикладное значение этих данных для понимания ряда аномалий в репродукции человека. Следует иметь в виду, что: а) триплоидия -- самая частая геномная аномалия у человека; б) у человека при оплодотворении регулярно, с определенной частотой происходит естественный андрогенез; в) в основе злокачественного перерождения клеток трофобласта (хорионэпителиомы), лежат явления, связанные с эпигенетической наследственностью, геномным импринтингом.

Феномен импринтинга приводит к тому, что в клетках трофобласта преимущественно активен мужской геном. Поэтому партеногенетическое развитие останавливается прежде всего ввиду невозможности развития трофобласта. Выдвинута интересная гипотеза, что у женских особей млекопитающих риск хорионэпителиомы уменьшается вследствие инактивации в их ооцитах генов, необходимых для роста и развития трофобласта (Varmuza, Mann., 1992). Импринтинг -- это как бы механизм защиты самок от собственных яйцеклеток, у которых таким образом блокируется партеногенез.

Первое деление оплодотворенной зиготы является и первым делением созревания, так что особых сигналов к началу развития нет. Партеногенез и разные варианты оплодотворения и развития встречаются у большинства групп животных. Чемпионом, видимо, является палочник рода Bacillus, у которого, как обсуждалось в разделе 2.2.3 (рис. 1) в естественных условиях встречаются пять вариантов стратегии размножения: обычное половое, гибридогенез, партеногенез, гиногенез и андрогенез.

Относительно нормальным вариантом бесполого размножения у человека можно рассматривать образование из одной зиготы двух и более близнецов (монозиготные близнецы). На пути других вариантов размножения у млекопитающих в процессе эволюции возникли барьеры. Но они не абсолютны. В последние 15-20 лет выяснилось, что у человека достаточно регулярно происходит андрогенез в двух его вариантах -- диспермия и диандрия. Однако это приводит к аномалиям репродукции и развития в силу хромосомного и геномного импринтинга.

Среди аномалий кариотипа, приводящих к спонтанным абортам, триплоидия после трисомии и моносомии занимает третье место (Назаренко, 1993). Триплоидия -- наиболее частая геномная аномалия. С нею связаны 1,2% всех клинически распознаваемых беременностей и около 6% всех спонтаных абортов в первом триместре беременности (Lindor, et al., 1992). По данным исследования С. А. Назаренко (1993), в Томской области среди 200 спонтанных абортусов было найдено 12 случаев триплоидии (6%) и 5 диплоидно-тетраплоидных абортусов. Анализ происхождения дополнительного хромосомного набора у триплоидов оказался совершенно неожиданным и непредсказуемым. Примерно у 80% триплоидов дополнительный набор хромосом имеет отцовское происхождение.

Результат развития резко различен в зависимости от источника дополнительного набора хромосом. Эмбриогенез, хотя и аномальный, происходит только у тех триплоидных продуктов оплодотворения, у которых находятся два материнских набора и один отцовский. В случаях же диспермии, когда дополнительный набор хромосом пришел от отца, зародыш не развивается, а происходит кистозное разрастание ворсинок хориона (производных трофобласта), называемое пузырным заносом (hydatidiform mole или "гидатидиформный моль").

Цитогенетический анализ заносов принес новые неожиданности. Частота заносов довольно ощутима и в США составляет 1:500 родов, причем для женщин в возрасте старше 40 лет риск возрастает до 9% (Lindor, et al., 1992). Заносы по морфо-эмбриологическим критериям удалось разделить на две группы: частичные и полные. В первом случае гидрофобные разрастания захватывают лишь часть ворсинок. В случае же полных заносов не образуется ни зародыш, ни какие-либо эмбриональные ткани. Вместо них наблюдаются скопления наполненных жидкостью ворсинок хориона, напоминающие виноградные гроздья. Эти образования абортируются, однако отдельные клетки из них могут быть занесены кровотоком в другие ткани и органы и привести к злокачественному росту.

По данным С. А. Назаренко (1993), среди около 200 абортусов было найдено 4 случая полных и 8 частичных заносов, общая частота примерно 6%. Частичные заносы имеют обычно триплоидный кариотип с двумя разными отцовскими наборами (андрогенная триплоидия). Тогда как полные заносы имеют диплоидный набор хромосом, причем оба набора оказываются отцовскими по своему происхождению. То есть, налицо феномен регулярно происходящего естественного андрогенеза у человека! Здесь в полной мере проявляются феномен импринтинга и разные эпигенетические потенции мужского и женского геномов. Диплоидный андрогенез у человека, происходит двумя путями: 1) диспермия, когда зигота образуется при слиянии двух попавших в яйцеклетку спермиев -- таковы около 25% всех полных заносов; 2) андрогения, в остальных 75% случаев, когда проникший в ядро мужской пронуклеус претерпевает дополнительное митотическое деление и затем оба митотических гаплоидных продукта сливаются, восстанавливая диплоидию, в итоге образуются так называемые "гомозиготные" заносы. Они имеют генотип либо 46,ХХ, либо 46,XY.

Ниже приведены обобщенные сведения о характере развития зиготы при разных вариантах оплодотворения. Эти данные ясно указывают на действие импринтинга и эпигенетическую некомплементарность женских и мужских геномов (Ben-Shetrit A., et al., 1995).

Анализ цитогенетики, а в будущем и молекулярной генетики, разных форм заноса в целях пренатальной диагностики очень важен. При полном заносе риск хорионэпителиомы чрезвычайно велик, при частичном заносе риск такой же, как в норме. Для установления дифференцированного диагноза и выбора правильной формы лечения С. А. Назаренко (1993) разработал схему комплексного обследования беременных женщин при подозрении на пузырный занос.

Открытие естественного андрогенеза у человека ставит перед медицинскими генетиками, специалистами в области репродукции человека и педиатрами ряд проблем, которые еще ждут своего решения на основе современных методов. Каков конкретный механизм нарушений развития при триплоидии и пузырных заносах? Какую роль играет изменение в соотношении Х-хромосом и аутосом и как происходит в этом случае процесс Х-хромосомной инактивации? Как проявляется хромосомный и генный импринтинг в случае частичных и полных заносов, какова роль генотипа в аномалиях воспроизведения?

Оплодотворение -- это сложный многоступенчатый процесс, в который вовлечены гены, действующие уже на уровне гамет. Имеются косвенные данные о наличии наследственных факторов, которые передаются через отца функционируют в процессе оплодотворения в мужских гаметах и повышают вероятность диатермии и андрогении. На фенотипическом уровне это приводит к специфической аномалии воспроизведения, когда в некоторых родословных наблюдается прямое отцовское влияние на склонность к рождению близнецов с одновременным частичным бесплодием. В этих же родословных ожидается появление третьего типа близнецов: не моно- или дизиготных, а полуторазиготных; в то же время среди сибсов близнецов возможны первичные химеры (Голубовский, Голубовская, 1984; Голубовский, 1984, 1986).

Импринтинг хромосом и генов

Патогенез некоторых наследственных аномалий связан с импринтингом определенных хромосом и генов (Сапиенца К., 1990). Наиболее изученным примером заболеваний, этиологически связанных с импринтингом, являются синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана. Оба синдрома обусловлены изменениями дозы и противоположным импринтингом одного и то же района длинного плеча хромосомы 15. Делеция этого сегмента в материнской хромосоме, как и отцовская дисомия по хромосоме 15 (то есть когда обе хромосомы 15 у пациента от отца) приводят к синдрому Ангельмана (резкие судорожные движения, умственная отсталость, неадекватная смешливость). Напротив, дисомия материнской хромосомы 15 и делеция отцовской копии сегмента приводят к синдрому Прадера-Вилли (умственная отсталость, ожирение, низкий рост и непропорционально малый размер рук и ног). Эти два сопряженных в цитогенетическом смысле заболевания могут быть связаны с реципрокными различиями в импринтинге двух соседних генов, расположенных в районе сегмента 15q11-13. Один из генов, причастных к развитию синдрома Прадера-Вилли, был клонирован у человека и у мышей. Он кодирует один из полипептидов ядерного рибонуклеопротеина, вовлеченного в передачу сигнала между нейоронами. Ген имеет длину в 25 т. н. п., включает 10 экзонов. Он активно экспрессируется на хромосоме отцовского происхождения, но метилирован на материнской хромосоме (Пузырев, Степанов, 1997).

Использование трансгенных модельных животных, главным образом, мышей, где изучаемый ген, сцепленный с известным геном-репортером (его присутствие определяется по специфической окраске) и поставленный под контроль индуцируемого промотора (например, с помощью теплового шока), искусственно вводится в геном определенной линии, дало новые большие возможности для изучения импринтинга. На мышах установлен противоположный импринтинг двух соседних генов Igf2 и Н19 (Peterson, Sapienza, 1993: Ben-Shetrit, et al., 1995). Изменение характера активности гена Igf2 (инсулино-подобный ростовой фактор) драматически влияло на ход самых ранних этапов развития. В начальных стадиях развития материнский ген выключен и активен лишь отцовский ген. У мышей был получен дефектный аллельный вариант гена Igf, и показано, что если в гетерозиготу эта мутация привнесена со стороны отца, рождаются мыши-карлики с 40% редукцией веса тела. Тот же самый ростовой дефект наблюдается у мутантных гомозигот.

Аналогичный ген у человека, обозначаемый как IGF-I1, экспрессируется лишь в отцовской хромосоме. Продукт этого гена связан с пролиферацией клеток плаценты. Ген высокоактивен в тканях трофобласта из пузырного заноса. Критическую роль в период имплантации яйцеклетки у человека играет активность другого гена H19. Он тесно сцеплен с геном IGF-II (район 11р15.5), но импринтируется противоположным образом -- активен материнский аллель.

Получены данные об участии импринтинга в возникновении определенных видов детских раковых заболеваний -- эмбриональной рабдосаркомы, опухоли Вильмса (рак почек) и остеосаркомы. В этих случаев первичным механизмом в патогенезе является инактивация рецессивного антионкогена именно в отцовской хромосоме (Сапиенца, 1990). Импринтинг причастен и к хорее Гентингтона. Это неизлечимое нейродегенеративное заболевание, наследуемое доминантно, обычно поражает людей старше 40 лет. Однако, примерно в 10% случаев болезнь развивается еще в детском возрасте. При этом 9 из 10 больных детей получают мутантный ген от отца.

В процессах импринтинга предложено разделять гены импринтируемые и импринтирующие, то есть те, которые подвергаются импринтингу и те, которые контролируют импринтинг (Peterson, Sapienza, 1993). К последним относятся гены, продукт которых представляет собой ДНК-связывающие белки. Они присоединяются к рецепторным участкам импринтируемых генов и влияют на степень их метилирования или степень компактизации данного сегмента хромосом. Несомненна связь феномена импринтинга с известным в генетике эффектом положения генов.

Новый тип нестабильных мутаций

В рамках мобильной генетики установлены разные случаи направленных изменений генов. Хорошо известны регулярно происходящие в ходе онтогенеза перемещения иммуноглобулиновых генов при развитии В-лимфоцитов -- продуцентов антител. Механизм такого рода перемещений состоит в локальных рекомбинациях по сигнальным повторенным последовательностям (Хесин Р. Б., 1984).

Вообoе, можно считать за правило, что в пределах участков с повторенными блоками ДНК наблюдаются аномалии основных матричных процессов -- транскрипции, репликации или трансляции, а также аномалии основных генетических процессов -- рекомбинации, репарации и сегрегации (Прокофьева-Бельговская А. А., 1986; Хесин Р. Б., 1984). В отношении поведения подобных районов хромосом можно говорить об автогенезе на уровне ДНК (см. обсуждение в разделах 5.1 и 5.6). Хорошо изученны, например, упорядоченные изменения, связанные с повторами при селекции клеток в условиях повышенных доз цитостатиков. В этом случае можно предсказать последовательность событий. Участок хромосомы, где расположен ген устойчивости многократно умножается, амплифицируется, затем блоки тандемно повторенных генов могут отделиться от хромосомы и оказаться в цитоплазме как кольцевые плазмиды или линейные микрохромосомы (см. раздел 4.4.1).

Помимо Alu элементов геном человека насыщен микросателлитными последовательностями, состоящими из тандемных ди-, три- и тетрануклеоттидных повторов. Число их в геноме достигает 30-40 тыс., они встречаются в среднем через каждые 1000-1500 нуклеотидов (Nadir, et al., 1996; Баранов, 1996). В последнее десятилетие обнаружено, что нестабильное поведение некоторых генов, приводящих к довольно распространенным наследственным заболеваниям, связано со скоплением в кодирующих районах соответствующих генов определенных тринуклеотидных повторов. Среди этих заболеваний -- мышечная дистрофия Дюшена, болезнь Гентингтона, синдром ломкой Х-хромосомы. На примере последнего дефекта мы разберем некоторые интересные особенности этого типа нестабильности.

Экспансия повторов: парадоксы нестабильности

В 1943 была описана сцепленная с полом умственная недостаточность, поражающая в основном мужчин (синдром Мартина-Белл). В 1969 году обнаружено, что у многих пациентов в культуре клеток в условиях повышенного содержания фолатов Х-хромосома пациентов обладает повышенной ломкостью в определенном участке. В последующем этот участок был точно цитогенетически локализован в районе Xq27.3.

После синдрома Дауна синдром ломкой Х-хромосомы (или FraX -- Fragile X) является наиболее частым наследственным дефектом, приводящим к умственной отсталости. У мужчин он встречается с частотой 1/1500 и в более легкой форме поражает и женщин с частотой 1/2500. В 1991 г данный ген было клонирован и обозначен как FMR1 (FraX Mental Retardation -- умственная отсталость, связанная с ломкой Х-хромосомой). Молекулярный анализ показал, что необычные особенности наследования этого синдрома связаны с расположенным в гене блоком триплетных повторов CGG (Jordan В., 1991; Mandel J. L., Heitz, 1992; Reiss A. L., et. al., 1994).

Вначале полагали, что женщины, гетерозиготные по FraX хромосоме нормальны, но потом оказалось, что у 30% из них проявляется умственная отсталость. Одна из аномалий наследования этого дефекта носит название "парадокс Шермана": в 20% семей у мужчин-носителей FraX синдром не проявляется, но пройдя одно поколение через дочерей-гетерозигот, FraX-хромосома вызывает заболевание у внуков. Иными словами, происходит как бы автогенетическое предсказуемое усиление действия мутации в ряду поколений или антиципация (упреждение).

Клонирование гена во многом прояснило его необычное поведение и привело к необходимости помимо нормы и мутации различать состояние премутации. К норме относят индивидов с числом внутригенных тринуклеотидных повторов CGG от 6 до 46. Если число повторов составляет 52-100, такой генотип диагностируют как премутантный. Семейный анализ показал, что у носителей премутации разброс по размеру повторенного блока в следующих поколениях закономерно возрастает. Чем длиннее блок повторов, тем выше риск перехода в потомстве к полной мутации. Наконец, когда число повторов значительно превышает 200-250, это приводит к полной мутации: умственной отсталости у всех мужских носителей такого варианта гена и снижению умственной активности у примерно 50% женщин; ломкость X-хромосомы в культуре клеток повышается до 80-90%. Наблюдается нестабильность гена по числу повторов в соматических и половых клетках.

У полных мутантов триплетный блок CGG и весь район данного гена подвергается метилированию, что приводит к инактивации гена: отсутствию транскрипции и белка FMR1. Именно отсутствие нормального продукта гена FMR1, а не само по себе увеличение повторов приводит к фенотипическому дефекту, ибо были обнаружены редкие нормальные особи, у которых число повторов достигало мутантного уровня, однако по какой-то причине блок не был метилирован (Reiss, et. al., 1994).

Причины, приводящие к амплификации тринуклеотидного повтора неясны. Связь характера мутантного выражения гена с числом повторов дает возможность молекулярной пре- и постнатальной диагностики заболевания. Интересны результаты популяционного и семейного анализа молекулярного статуса FMR1 гена. Тестирование 977 генетически несвязанных индивидов по числу повторов у них и их потомков дало частоту премутации 1 на 510. Однако, некоторые варианты FMR1 гена с числом повторов более 46 не подвергались амплификации в следующем поколении (Reiss, et al., 1994). Это указывает на роль генотипа в контроле генной нестабильности, что хорошо установлено в модельных опытах на дрозофиле.

Молекулярный анализ необычного поведения нестабильных генов, вызванных экспансией тринуклеотидных повторов, интересен с позиций общей и эволюционной генетики. Впервые представление об особом лабильном состоянии наследственных факторов ввел создатель мутационной теории Гуго де Фриз. Его статья, опубликованная в 1913 г. "Типы скрещиваний у энотер" содержит раздел "Гипотеза о лабильных генах". Де Фриз сделал вывод, что помимо активного и неактивного состояния наследственных факторов следует выделять и лабильное состояние. Оно встречается гораздо реже, "находится в причинной связи с процессом мутирования" и характеризует случаи, где наблюдается повышенная мутабильность (Г. де Фриз, 1932, с. 116).

К сходному выводу в начале 50-х годов пришла Барбара МакКлинток в результате анализа супермутабильности у кукурузы (разделы 3.3, 4.6.3). Она впервые связала поведение нестабильных генов с подвижными контролирующими элементами и показала, что эти элементы, в частности Spm, могут находиться в разных динамических состояниях: активном, неактивном и третьем -- лабильном или программированном (McClintock, 1965, 1978, 1984; Федорофф, 1984).

Обнаружена молекулярная подоплека разных состояний Spm-элемента. В его промоторной области есть два регуляторных участка, составленные из повторов, которые способны метилироваться и блокировать транскрипцию элемента. Если все блоки повторов деметилированы, элемент неактивен. В лабильном состоянии метилирована только часть повторов, и в зависимости от степени метилирования меняется поведение и характер выражения Spm. Переход элемента из лабильного в активное состояние может происходить в ходе онтогенеза в соматических клетках, а также постепенно -- в ряду поколений (Fedoroff, et al., 1995).

Таким образом, и у кукурузы, и у человека нестабильность и появление предмутационных состояний связаны со сходной структурно-функциональной организацией локусов: наличием в их составе блоков повторов, их способностью к метилированию и зависимостью активности гена от уровня метилирования его повторов. Несомненно, что спектр явлений в области медицинской генетики, связанный с неканоническим наследованием будет расширяться. Надеюсь, что проведенный в данной работе концептуальный анализ эволюции взглядов в генетике на наследственность и изменчивость поможет читателю лучше ориентироваться в этой области.