Изотопный тест термодинамики живого

Изотопный тест термодинамики живого

И. Пригожин и другие представители брюссельской школы связывают процессы биологической самоорганизации исключительно с явлениями упорядочения (диссипативными структурами), отвечающими области нелинейной термодинамики необратимых процессов.

В биологической эволюции мы действительно находим немало событий, которые могут рассматриваться как бифуркации, как структурные упорядочения, вызванные нелинейными процессами вдали от равновесия.

Однако эти события -- лишь особые точки на пути эволюции. Основное же содержание ее, как нам представляется, это -- последовательное ограничение свободы взаимодействий в химических системах (производство низкоэнтропийного продукта), что мы рассматриваем как неотъемлемое свойство определенного рода природных систем, а именно, стационарных систем необратимых процессов, сопряженных с энергопоставляющими реакциями. Принцип минимального производства энтропии, на который мы опираемся, справедлив лишь в области линейной термодинамики, т. е. относится к процессам, не слишком удаленным от равновесия. Под близостью к равновесию нужно понимать присутствие заметной обратимости процессов. Обратимость ведет к равновесию. Химическое равновесие это смерть живой системы. Живые системы -- это стационарные системы необратимых реакций. Жизнь представляет непрерывную борьбу с тенденцией к переходу в равновесное состояние.

На первый взгляд, представление о какой-либо близости к равновесию кажется, совершенно несовместимыми с высокоупорядоченным и, следовательно, глубоко неравновесным обликом биологических систем. В действительности, однако, высокая упорядоченность биологических систем есть результат выработанной эволюцией специфической структуры взаимодействий. Инструкцию о том, какие ферменты должны возникнуть и какими реакциями они должны управлять, каждый организм получает из генетического прошлого, в котором эта инструкция формировалась миллиарды лет. Химическое же содержание развития организма в онтогенезе в принципе может представлять совокупность процессов, близких к равновесию, но осуществляемых в заданном инструкцией «силовом поле».

Система ферментов-катализаторов образует тот жесткий каркас ограничений, в рамках которого осуществляются химические реакции. Роль катализатора состоит в том, что, взаимодействуя с силовым полем атомов реагирующих молекул, он определяет путь перехода системы в одно из более устойчивых состояний. Присутствие катализатора изменяет рельеф потенциальной поверхности, характеризующей взаимодействия в системе. В этом смысле катализ является частным случаем проявления силовых полей в системе. Последние могут быть разнообразны по своей природе, начиная от внешних полей и кончая взаимодействием между атомами самих соединений, образующих систему. Ориентирующее действие зародыша в процессе кристаллизации или роль матрицы при воспроизведении копий в процессе репликации также можно рассматривать как проявление катализа в широком смысле.

Здесь нужно указать на то, что уникальным тестом термодинамического состояния биологических систем может служить соотношение изотопных составов биомолекул. Дело в том, что силовое поле молекул не изменяется при изотопном замещении. Изотопные формы молекул характеризуются одинаковым набором силовых постоянных. Соответственно силовое поле, в котором происходит превращение изотопных молекул в процессе катализа, неразличимо. Фракционирование изотопов происходит не потому, что различны силовые поля изотопных молекул, а потому, что различно поведение частиц (атомов) разной массы в одном и том же силовом поле. Поэтому в информационных молекулах не может быть заложено никакой инструкции относительно отбора тех или иных изотопных форм молекул. Изотопный состав биомолекул не может кодироваться. Нет изотопно-специфических ферментов.

Следовательно, та специфическая структура взаимодействий, которая инструктирует химическое поведение молекулярных структур в биологических системах, не распространяется на изотопное распределение. Поэтому, если линейность является существенной чертой химии биологических процессов, она должна проявиться в тенденции к равновесному распределению изотопов на фоне абсолютно неравновесного состояния вещества на элементном уровне.

Подобное явление действительно было обнаружено. Прежде чем привести соответствующие факты, изложим некоторые общие сведения, чтобы ввести читателя в круг соответствующих понятий.

§ 1. Введение в изотопную термодинамику

Под изотопным составом понимают относительную распространенность изотопов данного элемента, выраженную обычно в виде отношения малораспространенного изотопа к более распространенному изотопу. D/H, ¹³С/^|2С, ¹⁸0/^1бО и т.п. Изотопный состав определяет величину атомного веса в общем виде:

Х*/Х = R.

В современной научной литературе изотопный состав принято представлять в виде величины 6, представляющей собой отклонение (обычно в тысячных долях -- %о) от условного стандарта. Например, для углерода:

Обусловленное изотопным эффектом различие изотопных составов двух веществ (Х*/Х)_а и (Х*/Х)_ь представляют как их отношение:

Величину а называют коэффициентом фракционирования или коэффициентом распределения изотопов.

Хорошим приближением является также следующее соотношение:

Выраженную в величинах 6 разницу в изотопном составе обозначают буквой Д:

Через величины б коэффициент а выражается следующим образом:

Иногда используют логарифмическое приближение следующего вида:

Поскольку в ансамбле взаимодействующих частиц частицы меньшей массы обладают большей скоростью, молекулы, содержащие легкий изотоп, подвижнее, чем молекулы, содержащие тяжелый изотоп. Поэтому в процессах диффузии, испарения и т. п. молекулы, содержащие тяжелый изотоп, опережают молекулы, содержащие легкий изотоп.

Химические связи, образуемые тяжелым изотопом, прочнее, чем одноименные связи, образуемые легким изотопом. Энергия активации соответствующих реакций с участием изотопно-тяжелой формы выше, чем изотопно-легкой (Е* > Е). Поэтому в однонаправленных (неравновесных) реакциях продукт обогащается легким изотопом. Это явление имеет название кинетического

изотопного эффекта. Кинетический изотопный эффект химической реакции численно определяется отношением констант скоростей реакций изотопных форм:

где м -- приведенная масса молекулы; Т -- абсолютная температура; R ~ газовая постоянная.

Неравноценность свойств изотопов, помимо неравноценности их в кинетическом отношении, проявляется также в том, что соединение, имеющее в своем составе тяжелый изотоп, обладает меньшим запасом свободной энергии, чем изотопно-легкая форма того же соединения. Эта неравноценность изотопных форм неодинакова для различных соединений. Поэтому минимум свободной энергии системы в общем случае достигается при неодинаковом изотопном составе образующих эту систему соединений. Обусловленное этим различие изотопных составов компонентов представляет собой термодинамический изотопный эффект.

Перераспределение изотопа X* элемента X между компонентами системы можно выразить в виде реакции, которую называют реакцией изотопного обмена:

С другой стороны, величина константы равновесия определяется изменением свободной энергии в реакции

Статистическая термодинамика позволяет выразить свободную энергию (изобарно-изотермический потенциал) соединения

Константа равновесия этой реакции, как и любой другой, может быть выражена через концентрации исходных реагентов и продуктов:

через так называемую статистическую сумму по энергетическим состояниям (функцию распределения) Q:

Отсюда

Методы квантовой статистики позволяют выразить отношение статистических сумм через колебательные частоты изотопных форм (Urey, 1947).

где s и s* -- числа симметрии.

При помощи (5.13) можно вычислить отношения статистических сумм по состояниям, если известны колебательные частоты v₁, и v₁* изотопных форм молекул, а следовательно, и величину константы К.

Отсюда:

Таким образом, имеется возможность, исходя из колебательного спектра молекул, определить соотношение изотопных составов соединений в состоянии минимума свободной энергии реакции изотопного обмена -- изотопного равновесия.

Колебательные частоты молекул могут быть в принципе получены экспериментальным путем из спектров комбинационного рассеяния и инфракрасных спектров соответствующих соединений. Однако изотопические смещения для элементов тяжелее водорода невелики, и их трудно измерить с достаточной точностью. Поэтому изотопные колебательные частоты молекулы вычисляются теоретически.

Общий метод состоит в том, что решается в классическом приближении задача колебательного движения молекулы. Соответствующее уравнение в матричном виде записывается так:

\GF -- JA| = 0,

где G -- матрица кинетических элементов; F -- матрица силовых постоянных; I -- единичная матрица; А -- корень векового уравнения, который связан с колебательной частотой соотношением

vi (см^-1) = л^1/2.

Фактически в рамках этой реакции протекает совокупность реакций отдельных изотопных форм:

каждая из которых характеризуется константой равновесия

В случае многоатомных соединений реакция изотопного обмена приобретает следующую запись:

167

С другой стороны в соединении, содержащем несколько атомов элемента X, изотопы X* распределены по разным изотопным формам пропорционально степени их изотопной замещенности, и поэтому изотопный состав соединения в целом определяется соотношением

Соответственно вместо простого соотношения (5.2) изотопный эффект между соединениями АХn и ВХm выразится соотношением

где i и j -- числа замещенных атомов в изотопных формах обоих соединений, причем замещение должно производиться по всем сочетаниям неэквивалентных атомов в молекулах.

Экспериментально определить соотношение всех изотопных форм многоатомного соединения невозможно. Поэтому практически изотопный состав определяется иначе: переводят исследуемое многоатомное соединение в какое-либо более простое, содержащее один или два эквивалентных атома данного элемента (например, С0₂ -- при исследовании ^|3С/^|2С и ^|80/^|60). Анализ этой пробы дает величину (Х*/Х)_АХп, характеризующую отношение изотопов исследуемого элемента в исходном многоатомном соединении.

В этой записи в, обозначает в-факторы всех одноизотопно замещенных форм по данному элементу в молекуле (от 1 до п).

Каким образом в этом случае можно сопоставить измеренные значения а с расчетными величинами /3-факторов, характеризующих фракционирование изотопов в равновесной реакции (5.18)? Исследование этого вопроса показало (Галимов, 1971), что в весьма хорошем приближении при Х*/Х < 1, что справедливо для всех легких элементов, в частности, ¹³С/¹²С ~ 0,01, связь между а и в-факторами сводится к простому соотношению:

При этом часть значений в_i, отвечающих эквивалентным атомам, окажется одинаковой (вырожденной).

Очевидно, что величина в числителе и знаменателе (5.20) характеризует изотопно-термодинамические свойства сравниваемых соединений в целом. Обозначив их в_S, получим

Тогда а вновь предстанет как отношение в-факторов, подобно соотношению (5.16) для простых соединений. Величина в_Е, характеризующая соединение в целом, названа термодинамическим изотопным фактором соединения.

Между ним и термодинамическими изотопными факторами однозамещенных изотопных форм, как следует из (5.22) и (5.23), существует соотношение

связывающее молекулярные и внутримолекулярные изотопные эффекты.

Неэквивалентные атомы данного элемента в молекуле характеризуются разными величинами в_i. Следовательно, распределение изотопов между ними неравновероятно. Иначе говоря, многоатомные соединения, содержащие неэквивалентные атомы, будут характеризоваться внутримолекулярными термодинамическими изотопными эффектами. Разница в изотопном составе элемента в любых двух неэквивалентных позициях определится соотношением соответствующих внутримолекулярных термодинамических изотопных факторов:

Таким образом, для того чтобы описать как внутримолекулярное, так и межмолекулярное распределение изотопов в равновесных реакциях, необходимо и достаточно вычислить величины в_i-факторов, относящиеся ко всем атомам данного элемента, находящихся в разных структурных положениях реагирующих соединений. Это можно выполнить, используя выражение (5.13). Помимо постоянных Больцмана и Планка, оно содержит лишь температуру и колебательные частоты изотопных форм.

В тех случаях, когда необходимо указать элемент, распределение изотопов которого рассматривается, удобно употреблять символ в в сочетании с символом соответствующего изотопа, например в¹³С, в^|80 и т. п.

Частоты изотопных форм, как отмечалось выше, могут быть вычислены путем решения уравнения колебательного движения молекулы. Численные значения в^|3С-факторов ряда соединений, найденные таким способом, приведены в табл. 5.1. Термодинамические изотопные факторы зависят от температуры: уменьшаются с ее увеличением. Чтобы не загромождать таблицу, в ней представлены данные только для 300 К. Примеры температурной зависимости даны на графике (рис. 5.1).

Нахождение корней А векового уравнения представляет достаточно трудоемкую процедуру. Достаточно сказать, что определение в-факторов даже такого сравнительно простого соединения, как гексан, требует операций с матрицами 54 степени. Современная вычислительная техника позволяет справиться с математическими трудностями. Однако метод имеет ряд ограничений, которые проявляются особенно заметно при переходе к анализу сложных многоатомных соединений.

Принципиальное ограничение связано с неопределенностью силового поля молекулы. Дело в том, что силовые постоянные находят путем решения так называемой обратной спектральной задачи, т.е. уравнения GF -Iл = 0, разрешенного относительно элементов Fij. Однако, поскольку число силовых постоянных 1/2 N(N + 1) всегда больше числа исходных уравнений, равного числу 3N - 6, определить все силовые постоянные практически невозможно. Поэтому приходится делать допущения, что некоторые силовые постоянные пренебрежимо малы, другие равны друг другу, некоторые аналогичны родственным силовым постоянным из других молекул.

Таблица 5.1. Термодинамические изотопные факторы (в^|3С) некоторых соединений углерода, рассчитанные через колебательные частоты изотопных форм (Т = 300 К)

Соединение	в|3С	Ссылка
С02	1,1909 1,1882	[1] [2]
HCN	1,1206	[1]
СО	1,0970	[1]
СН4	1,122 1,1136	[3] [5]
с2н6	1,1317	[5]
СзНв	1,1385	[5]
QHjo	1,1419	[5]
Бензол	1,1533	[5]
Толуол	1,1527	[5]
СНзСООН	1,1680	[5]
СН3СНО	1,1512	[5]
Глицин	1,1788	[6]
Алании	1,1706	[7]
Карбамид	1,1844	[8]
Алмаз	1,1786 1,1838	[9] [2]
Графит	1,1736 1,1706	[9] [2

[1] - Urey (1947), [2] - Polyakov & Kharlashina (1995), [3] -

Craig (1953), [4] -- Галимов (1973, там же ссылки на отдельные работы),

5] - Поляков (1987), [6] - Поляков (1984), [7] - Bottinga (1969),

8] -- Поляков (неопубликовано)

Рис. 5.1. Зависимость в¹³ С-факторов некоторых соединений углерода от температуры (Richet al., 1976; Polyakov and Kharlashina, 1995)

Несколько уменьшить неопределенность (увеличить число уравнений для нахождения постоянных) можно, привлекая экспериментальные данные об изотопных частотах. Первоначально выбранную систему силовых постоянных последовательно корректируют путем сравнения расчетного спектра с экспериментальным до получения удовлетворительной сходимости. Вопрос о том, что считать удовлетворительной сходимостью, достаточно субъективен. Сами спектроскопические данные, служащие основой для сравнения, имеют ограниченную точность. Во многих случаях наблюдательные спектры неполны, т.е. нет сведений обо всех частотах, характеризующих молекулу, особенно в случае высокомолекулярных соединений. Источником погрешности является также модель гармонического приближения колебательного движения молекулы.

Значение указанных ограничений, как правило, возрастает с увеличением числа атомов и усложнением молекулярного строения соединения. Отсюда определение в¹³С-факторов сложных многоатомных соединений, к числу которых принадлежит большинство биологически интересных органических соединений, оказывается затруднительным.

В этой связи в свое время мы предложили простой метод оценки величины в-факторов, основанный на весьма общих соображениях (Галимов, 1972; Galimov, 1985; Галимов, 1982).

Величина в-фактора свободного атома тождественно равна единице. Иначе говоря, отличие в-фактора от единицы возникает только с появлением химической связи между атомами.

Отсюда следует, что термодинамический изотопный фактор можно в принципе представить в виде

где х -- член, зависящий от наличия и характера химических связей.

Известно, что если какой-либо параметр, относимый к данному атому в молекуле, зависит от характера окружающих атомов, то он сильнее всего зависит от ближайшего окружения, т.е. определяется прежде всего теми химическими связями, которые образуют данный атом. Это проявление известного в химии принципа локализации. С другой стороны, распространенное свойство аддитивности термодинамических величин делает вероятной линейную комбинацию инкрементов, характеризующих отдельные связи. Иначе говоря, можно попытаться представить х в виде Е2 Lj, где L, -- величина, характеризующая j-ю связь j=\ из числа п связей, образуемых г-м атомом, т.е.



Наконец, известно, что параметры, характеризующие химическую связь, в той или иной мере обладают свойством трансферабельности, т.е. сохраняют присущие им значения в разных химических соединениях. Этим свойством в какой-то степени должно обладать и Lj.

Влияние «дальнего окружения» может быть учтено дополнительными поправочными коэффициентами с индексами, соответствующими типам связей, образуемых атомам и-партнерам и данного атома углерода. Величина Д-фактора тогда определится при помощи выражения

где к нумерует связи, образуемые атомами, соседними с данными атомом углерода.

Надо заметить, что в литературе, особенно 70-х годов, было достаточно много попыток упростить трудоемкую процедуру расчета в-факторов, чтобы избежать необходимости решать в каждом случае полную систему уравнений колебательного движения. Хорошие приближения были предложены школой Дж. Бигеляйзена в США (Bigeleisen, 1975; Bigeleisen, Ishida, 1968; Bigeleisen et al., 1971; Ishida et al., 1969). Наш аддитивный метод изотопических чисел связей был не самым строгим, но, по-видимому, наиболее простым и удобным методом оценки в-факторов сложных соединений. Метод, развитый Дж. Бигеляйзеном с сотрудниками, представляет иной подход к оценке аддитивных свойств. Поэтому существенным было сделанное американскими исследователями заключение: «Приведенные числовые примеры дополняют предшествующие теоретические подтверждения (ссылки 8, 18 в цитируемой работе) метода Галимова оценки величин In (s/s*)f для широкого спектра соединений углерода путем суммирования чисел связей» (Bigeleisen et al., 1976).

Подробное изложение метода изотопических чисел связей имеется в работе (Galimov, 1985).

Принцип аддитивности, положенный в основу метода изотопических чисел связей и представления в-факторов посредством суммы инкрементов, логически связан с пониманием природы химической связи в рамках теории локализованных электронных пар. В соответствии с этим представлением связь между атомами возникает в результате перекрывания направленных атомных орбиталей, находящихся в валентном состоянии. Перекрывание s-орбиталей или sp-гибридизированных орбиталей приводит к образованию связи, в которой электронное облако вытянуто аксиально вдоль связи. Такая связь называется б-связью. Взаимное перекрывание негибридизированных р-орбиталей приводит к возникновению общего электронного облака, с двух сторон параллельного оси связи. Такая связь носит название 7г-связи. В молекуле этана, например, атомы углерода находятся в состоянии sp₃-гибридизации. Каждый из них образует связи с водородом, атомная орбиталь которого находится в s-состоянии. Электронное облако вытянуто аксиально вдоль связи. В дальнейшем примем следующее обозначение связи: в скобках указываем сначала символ атома, связь которого нас интересует, затем -- символ атома, с которым образована связь; рядом со скобкой указываем тип связи и в нижнем индексе -- состояние гибридизации рассматриваемого атома и атома, с которым он образует связь. Таким образом, связь углерода с водородом в этане обозначим (С--H)0-_SP3__S. Между собой атомы углерода в этане образуют связь (С--C)a_sP3__sPi. В молекуле этилена орбитали атомов углерода находятся в состоянии sp₂ -гибридизации. С водородом углерод образует а -связь: (С--H)a_spi-s. Между собой атомы углерода образуют одну (б-связь за счет перекрывания sр₂-орбиталей и дополнительно п-связь -- за счет перекрывания 2p_z-негибридизированных орбиталей. Таким образом, в этилене атомы углерода образуют связь

(C=C)бп_sP2-sp2.

Эта связь, поскольку в ее реализации участвует не два, а четыре электрона, является кратной -- двойной связью. Обычно для ее обозначения используют две черточки (валентных штриха).

Взаимодействие атомных орбиталей передает реальную структуру молекул. Тетраэдрическая конфигурация метильных групп этана, плоское строение молекулы этилена, угловое строение молекулы воды, также как пирамидальная структура молекулы NH₃ и линейность молекулы ацетилена -- непосредственное следствие строения атомных орбиталей в валентном состоянии атомов, образующих соответствующие молекулы. Связь может осуществляться путем как сочетания атомных орбиталей, каждая из которых содержит по одному электрону, так и сочетания заполненной атомной орбитали одного атома с вакантной атомной орбиталью другого. В последнем случае связь носит специальное название донорно-акцепторной. Электронное строение ее совпадает с электронным строением обычной б-связи. Они не отличимы химически и, как мы увидим, характеризуются одинаковым изотопическим числом связи. Следует отметить, что при традиционном изображении структурных формул химических соединений донорно-акцепторная связь часто отмечается двумя черточками (как двойная), хотя в действительности она является связью ординарной. Например, при изображении структурной формулы SO₄^2-, чтобы передать шестивалентный характер серы, ее связи с атомами кислорода иногда изображают как две двойные и две ординарные. На самом деле в сульфат-ионе атом серы, находящийся в состоянии sp_з-гибридизации, образует с атомами кислорода 4 связи одинакового электронного строения, две из которых являются обычными б-связями, а две другие -- связями донорно-акцепторного типа. Поскольку изотопическим числом мы условились характеризовать связь в том понимании, которое придается ей в рамках теории локализованных электронных пар, в-фактор шестивалентной серы в молекуле SO₄^2- определится суммированием четырех одинаковых чисел связей L_(S-0)б_SP3__SP3.

Напротив, в некоторых случаях следует различать (специализировать) фактически равноценные связи. Например, в карбонат-ионе атом углерода, находящийся в состоянии sp₂ -гибридизации, образует три равноценные связи с атомами кислорода. Однако с точки зрения метода локализованных электронных пар, здесь присутствуют два разных типа связи: бп-связь с sр₂-гибридизи-рованным атомом кислорода и две обычные а-связи с sp_з-гибридизированными атомами кислорода. Соответственно б¹³С-фактор СОз^2- должен определяться суммой

1 + L(C=C)бп_spi__spl + 2L(C-C)б_sp2-spr

Иначе говоря, при оценке величины в-фактора набор изотопических чисел связей должен определяться электронным строением химических связей в понимании метода локализованных электронных пар. Следует иметь в виду, что, несмотря на доказанную многими приложениями плодотворность этой концепции, она базируется на определенных приближениях, которые могут быть вполне приемлемы для одних случаев, но непригодны для других. Теория локализованных электронных пар не позволяет объяснить некоторые свойства соединений, например, окраску, магнитные свойства. В основе ее лежит представление о локализации электронов на связях, хотя физически строгим считается представление о полностью делокализованных молекулярных орбиталях. Коэффициенты гибридизации (отношение р-состояния к s-состоянию) рассматриваются как целочисленные: 3 -- при sp₃-гибридизации, 2 -- при sp₂-гибридизации, 1 -- при sp_i -гибридизации. Между тем фактически коэффициенты гибридизации отличаются от целочисленных значений; например, в молекуле этана (sp₃) -- 3,2, бензола (sp₂) -- 2,18, ацетилена (sр1) -- 1,30, и т. п. Представление о локализованных химических связях оказывается недостаточным для описания связей в молекулах с нечетным числом электронов, например NO, N0₂ и др. Эти ограничения в той или иной мере сказываются на применимости принципа аддитивности для оценки в-факторов соединений.

Более строгое квантово-статистическое рассмотрение метода изотопических чисел связей было сделано позже В.Б. Поляковым (Поляков, 1991).

Числовые величины изотопических чисел связей представлены в табл. 5.2, заимствованной из моей работы (Galimov, 1985). На рис. 5.2 показан пример расчета в_i¹³С-фактора и в_E¹³С-фактора молекулы аланина с использованием изотопических чисел связей. Справа в скобках для сравнения приведены данные, полученные В.Б. Поляковым (1984) путем прямого решения уравнения колебательного движения молекулы аланина.

Таблица 5.2

Изотопические числа связей углерода при 300 К

Рис. 5.2. Пример расчета в_i¹³С- и в_E¹³С-факторов молекулы аланина с использованием изотопических чисел связей. Справа в скобках указаны соответствующие значения, полученные В.Б. Поляковым (1984) путем решения уравнения колебательного движения молекулы

§ 2. Проявление тенденции к равновесному распределению изотопов углерода в биологических системах

Величины в-факторов характеризуют изотопные эффекты в состоянии равновесия изотопного обмена. Изотопный обмен, вообще, как правило, реализуется только между самыми простыми соединениями углерода. Многоатомные соединения обменивают изотопы, особенно изотопы углерода, образующие скелет органических молекул, очень медленно. Из геохимии изотопов известно, что органические соединения могут сохранять свой изотопный состав неизменным в течение многих миллионов лет.

Тем не менее, оказалось, что изотопные составы углерода биомолекул во многих случаях коррелируют с величинами соответствующих в^|3С-факторов.

Вышеупомянутый метод изотопических чисел связей разрабатывался с целью разобраться в характере фракционирования изотопов в природных углеводородных системах. В то время я занимался геохимией изотопов применительно к проблемам нефти и газа. Поэтому первые результаты исследований по изотопной термодинамике органических соединений были изложены в геологической по своему основному содержанию книге (Галимов, 1973).

Первые оценки в-факторов биомолекул (аминокислот, ли-пидов и т. п.) были сделаны скорее из любопытства, нежели в ожидании какого-либо осмысленного результата. Тем не менее, сравнение некоторых опубликованных данных по изотопному составу биосоединений с величинами их в^|3С-факторов показало существование корреляции между б^|3С и в¹³С. Имевшиеся в то время в литературе измеренные значения в^]3С биосоединений были разрозненными и крайне немногочисленными. Поэтому я предложил моему аспиранту В.Г. Ширинскому изучить изотопный состав углерода компонентов липидной фракции организмов нескольких видов так, чтобы покрыть возможно более широкий диапазон условий обитания и степени организованности, включая организмы многоклеточные и одноклеточные, морские и пресноводные, автотрофы и гетеротрофы, представителей наземной и водной флоры. Эти требования удалось совместить, отобрав для изучения, четыре объекта: морскую ламинарию и морские рачки (криль), речные синезеленые водоросли и луговой люпин (Галимов и Ширинский, 1975).

Результаты показаны на рис. 5.3-5.6 Между расчетными величинами в_E-факторов и измеренными значениями б¹³С имеется связь, характеризующаяся во всех исследованных случаях высокими коэффициентами корреляции. Для всех изученных организмов связь носит приблизительно одинаковый характер. Следует отметить, что результаты относятся к узкому диапазону вариаций как б¹³С, так и в¹³С. В пределах этого диапазона одна только ошибка масс-спектрометрических измерений, составлявшая (0,2-0,3)%о, способна обусловить заметную долю наблюдаемого на графиках разброса данных относительно линий регрессий. К этому следует добавить также погрешность, обусловленную несовершенством метода оценки в_Е -факторов, погрешности связанные с разделением липидов и т. п.

Рис. 5.3. Корреляция в_E¹³С--б¹³С компонентов липидной фракции синезеленой водоросли Anabaena variabilis

1 -- воска, углеводороды, эфиры стеринов; 2 -- триглицериды; 3 -- каротиноид (р-каротин); 4 -- жирные кислоты; 5 -- кароти-ноид (эхиненон); 6 -- стерины (р-ситостерин); 7 -- хлорофилл; 8 -- диглицериды; 9 -- каротиноид (миксоксанто-филл); 10 -- моноглицериды; 11 -- фосфатидилсерин; 12 -- сфингомиелин; 13 -- фосфатидилинозит; 14 -- лецитин; 15 -- кефалин

Рис. 5.4. Корреляция в_E¹³С--6¹³ С компонентов липидной фракции криля Euphausia superba

1 -- воска, углеводороды, эфиры стеринов; 2 -- триглицериды; 3 -- каротиноид (астацин); 4 -- жирные кислоты; 6 -- стерины (холестерин); 8 -- диглицериды; 10 -- моноглицериды; 12 -- сфингомиелин; 14 -- лецитин; 16 -- кардиолипин; 17 -- пигмент (эхиненон)

Рис. 5.5. Корреляция в_E¹³С--6¹³ С липидной фракции люпина Lupinis luteus

I -- воска, углеводороды, эфиры стеринов; 2 -- триглицериды; 4 -- жирные кислоты; 6 -- стерины (в-ситостерин); 7 -- хлорофилл; 8 -- диглицериды; 10 -- моноглицериды; 11 -- фосфатидилсерин; 14 -- лецитин; 15 -- кефалин; 18 -- моногалактозилглицерид

Рис. 5.6. Корреляция в_E¹³С--6¹³ⁱC липидной фракции ламинарии Lami-naria saccharina

1 -- воска, углеводороды, эфиры стеринов; 2 -- триглицериды; 3 -- каротиноид (фукоксантин); 4 -- жирные кислоты; 6 -- стерины (фукостерин); 7 -- хлорофилл; 10 -- моноглицериды

Несмотря на все эти источники дисперсии, связь достаточно очевидна. Следует отметить, что она не отвечает полному равновесию. В уравнениях регрессии всюду перед скобкой, содержащей значения в-факторов, есть коэффициент, варьирующийся в пределах 0,3-0,5, вместо единицы, что отвечало бы равновесию. Иначе говоря, термодинамический изотопный эффект редуцирован. Это была диссертационная работа В.Г. Ширинского. К сожалению, он рано умер.

Другую задачу решала М.П. Богачева: изучить внутримолекулярное распределение изотопов в хлорофилле. Хлорофилл содержит углеродные атомы, заметно отличающиеся величинами вi -факторов. Поэтому можно ожидать ощутимых изотопных сдвигов между углеродом в разных структурных положениях. Хлорофилл -- важное биологическое соединение. Он имеет также существенное геохимическое значение. Его фитольная часть является предшественником изопреноидных углеводородов, а тетрапиррольное ядро -- предшественником ископаемых порфиринов.

На рис. 5.7 показана связь внутримолекулярного распределения изотопов углерода в хлорофилле с величинами в_i-факторов (Богачева, Галимов, 1979). Эта работа стала частью диссертационного исследования М.П. Богачевой.

Рис. 5.7. Внутримолекулярное распределение изотопов углерода в молекуле хлорофилла (Богачева, Галимов, 1979)

Группа Л.А. Кодиной исследовала внутримолекулярное разделение изотопов углерода между ОСН₃-группой мономеров лигнина и остальной частью ароматического мономера. Метоксильная группа содержит кислород, однако, величина в_i-фактора ниже, чем величина в-фактора ароматической части молекулы. Поэтому представляло интерес определить направление внутримолекулярного сдвига по метоксильному углероду. Он оказался соответствующим соотношению в-факторов (Галимов и др., 1976). В той же исследовательской группе был впервые произведен сравнительный анализ внутримолекулярного распределения изотопов в органических соединениях, выделенных из биологических объектов и в их синтетических аналогах. Распределение изотопов оказалось принципиально различным (Виноградов и др., 1976). Академик А.П. Виноградов придавал большое значение этому направлению работы как обещающему открытие нового метода идентификации биогенных и абиогенных органических соединений.

В тот же период были опубликованы результаты исследований изотопного состава углерода биогенных соединений в некоторых других лабораториях (Meinschein et al., 1974; Di Marco et al., 1977; De Niro and Epstein, 1977). Интересный результат был получен группой Уоррена Мейншейна в Индианском Университете США. Американские исследователи проанализировали изотопный состав углерода во всех четырех позициях молекулы ацетоина (Rinaldi et al., 1974). Сопоставив величины б¹³С, полученные этой группой с величинами в¹³С- факторов, характеризующими углерод в соответствующих положениях, мы увидели отчетливую корреляцию (рис. 5.8).

Позже группа У. Мейншейна выполнила исследование внутримолекулярного распределения изотопов в малате (рис. 5.9) и нашла, что «содержание ⁱ³C в отдельных атомах углерода малоновой кислоты из яблока и сорго увеличивается в соответствии с их в-факторами, как предсказано Галимовым» (Meinshein et al., 1984, с. 346).

Корреляции являются линейными в силу физического смысла величины б^|3С и в¹³С. В равновесной системе они связаны соотношением

или

Из графиков видно, что линии регрессий характеризуются уравнениями вида

где < 1. Коэффициент показывает, в какой мере наблюдаемые изотопные сдвиги меньше их полной равновесной величины, определяемой непосредственно соотношением в-факторов. Редуцированная величина термодинамического изотопного эффекта является характерной чертой всех обнаруженных корреляций. Если распределение изотопов отвечает величинам /3-факторов, то это свидетельствует о существовании в той или иной форме изотопных равновесий или состояний близких к равновесию.

Понятно, что связь, установленная в упомянутых выше случаях и многих других не является случайной. Она присуща соединениям разного строения, компонентам, относящимся к разным биохимическим фракциям, наблюдается в организмах разной экологической и таксономической принадлежности и, что самое главное, проявляется как на межмолекулярном, так и на внутримолекулярном уровне.

В то же время немало случаев, когда эту связь не удается наблюдать. Например, в жирной кислоте все атомы СН₂-групп в углеводородной цепочке характеризуются практически одинаковыми в_i-факторами. Следовательно, изотопный состав их должен быть одинаков. С другой стороны биосинтез жирных кислот осуществляется таким образом, что в углеводородной цепочке жирной кислоты чередуются атомы, происходящие от метального и карбоксильного углерода ацетата. Если изотопный состав углерода предшественника оказывается определяющим, то следует ожидать, что изотопный состав соседних атомов углерода будет отличаться. К. Монсон и Дж. Хейс (Monson and Hayes, 1982) исследовали внутримолекулярное распределение изотопов в пальмитиновой кислоте и нашли, что имеет место последний случай.

Рис. 5.10. Внутримолекулярное распределение изотопов углерода в глюкозе. Экспериментальные данные Rossman et. al., (1991). Глюкоза выделена из двух культур: маиса (*) (растение с С-4 типом фотосинтеза, 6¹³C глюкозы в целом -- 10,3 %о) и сахарной свеклы (о) (растение с С-3 типом фотосинтеза, б^|3С глюкозы в целом -- 25,0 %о). Величины Д' С представляют собой отклонение величины 6¹³ С молекулы глюкозы в целом. Два одинаковых символа, соединенных прямой линией, отвечают двум разным методам, примененным для деградации молекулы глюкозы

В начале 80-х годов наша лаборатория в Институте геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского переключилась на другие проблемы и практически прекратила активные экспериментальные исследования изотопного фракционирования в биологических системах.

В последние 10-15 лет наиболее существенные исследования в области внутримолекулярного изотопного анализа были сделаны группой Г.-Л. Шмидта в Техническом университете в Мюнхене, Германии. Впервые, в частности, был измерен изотопный состав углерода во всех шести позициях углерода в глюкозе (Ross-man et. al., 1991). Глюкоза была выделена из двух источников, имеющих разный тип фотосинтеза: маиса (С₄-тип) и сахарной свеклы (С₃-тип). Как известно, растения С₃- и С₄-типа имеют существенно различный изотопный состав. В данном случае глюкоза из маиса имела в целом 6¹³= -10,3 %о, а из сахарной свеклы: б¹³С = -25,0 %о. Несмотря на столь принципиальное различие в величинах фракционирования изотопов между растением и средой, характер внутримолекулярного распределения изотопов для глюкозы из обоих источников оказался сходен.

Рис. 5.11. Корелляция величин в¹³С--б¹³С для лимонной кислоты. Экспериментальные данные из работы (Schmidt H. -L., Gleixner G., 1998)

Связь изотопного состава углерода с величинами в¹³С спектров, характеризующих углерод в соответствующих позициях, получается невыразительной (рис. 5.10). Атомы углерода со 2-го по 5-й характеризуются почти одинаковыми в¹³-факторам и, однако, изотопный состав их заметно варьирует.



Рис. 5.12. Внутримолекулярное распределение изотопов углерода в пуриновых алкалоидах (молекула кофеина) из разных географических районов: 1 -- Sri Lanca; 2 -- Darjeeling; 3 -- Assam; 4 -- China; 5 -- USSR (экспериментальные данные Weiiacher et. ai., 1996)

Правда, атом С-6, характеризующийся наиболее низкой величиной в¹³С-фактора, показывает устойчиво и наиболее низкие значения в^|3С. Но в целом для глюкозы корреляция в¹³С--б¹³С довольно низкая.

Хорошая корреляция, с коэффициентом n = 0,93, наблюдается для лимонной кислоты, если сопоставить ее в'³С-факторы с экспериментальными значениями б¹³С, полученными Г.-Л. Шмидтом и Г. Глейкснером (Schmidt, Gleixner, 1998) для всех шести ее атомов углерода (рис. 5.11).

Анализ сложной молекулы кофеина (рис. 5.12) был произведен для препаратов, полученных из разных географических пунктов (Weilacher et al., 1996). На рис. 5.13 в сопоставлении с соответствующими величинами их в_Е-факторов приведены данные, полученные Г. Глейкснером с соавторами (Gleixner et al., 1998) для разных соединений углерода из листьев и из клубней картофеля. На рис. 5.14 отдельно показана зависимость б^|3С--в^|3С для аминокислот из листьев картофеля. Можно было бы привести и другие примеры, но в целом приведенные данные достаточно передают уровень существующей корреляции б¹³С--в¹³С. В некоторых случаях корреляция лучше, в других -- хуже, но в целом присутствие этой зависимости в биологических системах очевидно. Авторы соответствующих экспериментальных работ обсуждают наблюдаемые различия в изотопном составе углерода в разных положениях биомолекул с точки зрения путей биосинтеза, зависимости от изотопного состава предшественников, изотопных эффектов, возможных на некоторых кинетических барьерах. Все эти факторы действительно могут иметь значение. Но мы не будем следовать за авторами экспериментальных работ в этих рассуждениях. Для нас интересен тот факт, что, несмотря на влияние всех этих факторов, в большом числе случаев явно проявляется зависимость 6¹³С--в¹³С, характеризующая наличие тренда к равновесному распределению изотопов. Все другие рассматриваемые факторы могут лишь

Рис. 5.13. Экспериментальные данные (Gleixner et. al., 1998) по изотопному составу органических соединений, выделенных из листьев (О) и клубней (®) картофеля.

Первые значки в скобках относятся к аминокислотам, вторые -- к остальным выделенным соединениям приводить к отклонениям от этого тренда, но никак не могут стать его причиной.

Мы покажем ниже, что наблюдаемые в биологических системах изотопные эффекты равновесной природы, проявляющиеся в корреляциях типа б^|3С--в^|3С, характерны для стационарных систем необратимых реакций, не слишком удаленных от равновесия.

Запишем ферментную реакцию в следующем виде:

где Е -- фермент, S₀ -- исходный субстрат, Р -- продукт, ES и ЕР -- фермент-субстратный комплекс в начальной и конечной форме (S или Р).

где v -- скорость процесса (скорость образования продукта), Е_т -- общая концентрация фермента:

[Et] = [E] + [ES] + [EP].

Подставляя в (5.33) величину [ES] из (5.34) и [ЕР] из (5.35), получим:

где к_е/к*_е как обычно характеризует изотопный эффект реакции

Для изотопно-замещенной формы соответствующее кинетическое уравнение имеет вид

Таким образом, изотопный эффект рассматриваемого процесса определяется соотношением

Подчеркнем, что а_е -- это кинетический изотопный эффект, но, как мы увидим, он содержит «термодинамическую» компоненту.

Вероятность физической диссоциации фермент-субстратного комплекса в сторону продукта или в сторону фермента является свойством фермента и, очевидно, не зависит от изотопного состава субстрата. Поэтому

Процесс абсорбции субстрата на ферменте в принципе может сопровождаться изотопным эффектом, но им можно пренебречь, т. е. принять

Отношение величин кинетических изотопных эффектов прямой и обратной реакции численно равно термодинамическому изотопному эффекту. Отсюда

Учитывая соотношение (5.49)--(5.51), получим

Множитель перед скобкой, описывающей термодинамический изотопный эффект, обозначим, как и прежде :

С этими обозначениями выражение (5.52) примет вид

Величина к_а/к*_а -- кинетический изотопный эффект превращения субстрата в продукт в фермент-субстратном комплексе. Множитель перед скобкой (к_а/к*_а -- 1) обозначим А:

Как видно из выражений (5.53) и (5.54), для величин и А существенными являются соотношения между к_ь и к₂ и между k_₁ и k₂. При этом возможны следующие предельные случаи:



Второй случай отвечает полностью необратимой (далекой от равновесия) реакции. В этом случае имеет место чисто кинетический изотопный эффект.

Третий случай отвечает полному равновесию реакции в фермент-субстратном комплексе. Изотопный эффект -- чисто термодинамический.

Наконец, последний случай отвечает необратимой реакции в условиях микроскопической обратимости, т. е. это как раз необратимая реакция, не слишком удаленная от равновесия.

В этом случае имеет место редуцированный изотопный эффект равновесной природы.

Мы рассмотрели частный случай уравнения Михаэлиса-- Ментен, но общий случай сводится к тому же выражению (5.55) (Галимов, 1985; Галимов, Поляков, 1990).

Выражение (5.55) характеризует возможный изотопный эффект между непосредственным предшественником и продуктом. Между тем корреляция между изотопными составами разных биомолекул или в разных положениях углерода внутри молекул означает нечто большее: существование зависимости типа (5.55) между любыми атомами углерода в биологических системах.

Соответствующую связь можно получить, если отдельные ферментативные реакции в организме образуют систему, изображенную на рис. 5.15.

Рис. 5.15. Последовательность необратимых реакций, каждая из которых находится в цикле, приводящем ее продукт некоторым путем к предшественнику

Как указывает А. Ленинджер (Ленинджер, 1974) «почти все метаболические реакции связаны между собой, поскольку продукт одной ферментативной реакции служит субстратом другой реакции, которая является следующим этапом данного процесса. Существование такой преемственности обуславливается специфическими особенностями ферментов» (с. 321).

В живом организме метаболические пути взаимосвязаны так, что метка, введенная в некоторое соединение, может быть через некоторое время обнаружена в непосредственном предшественнике этого соединения. Обобщенная модель подобного процесса изображена на рис. 5.15.

Можно показать, что для этой системы при условии ее стационарности справедливо следующее выражение

Мы не будем приводить вывод. Он сопряжен с громоздкими выкладками. Его можно найти в предшествующей работе (Galimov, 1985).

Здесь а_к+п/к -- коэффициент разделения изотопов между углеродом в любом k-том и (к + п)-ом положении; ^~ -- усредненный редуцирующий коэффициент для всего пути, соединяющего к и к + п положение; Д -- суммированные кинетические изотопные эффекты, эффекты переноса и другие эффекты фракционирования, приводящие к отклонению изотопного распределения от термодинамического.

Выражение (5.57) можно переписать в виде

Последнее -- не что иное, как уравнение регрессии в той форме, в какой оно в приведенных выше примерах характеризовало связь между измеренными экспериментальными значениями б^|3С биомолекул и расчетными величинами б^|3С-факторов.

Итак, мы получили теоретическое выражение, которое соответствует экспериментальным наблюдениям. Условиями его вывода были: 1) частичная обратимость процесса в фермент-субстратном комплексе (близость к равновесию, измеряемая величиной); 2) стационарность и взаимосвязанность цепи химических реакций. Следовательно, наблюдаемое проявление равновесной природы изотопных эффектов в биологических системах может рассматриваться как свойство, присущее находящейся в стационарном состоянии взаимосвязанной системе необратимых реакций, не слишком удаленных от равновесия.

На этом фоне могут иметь место глубоко необратимые реакции, нелинейные процессы, нестационарные состояния и т. п., обуславливающие разной степени отклонения от основной тенденции.

Близость к равновесию и стационарность биохимических процессов делает в некоторых случаях эффективным использование методов равновесной термодинамики (Гладышев, 1996). Это менее очевидно применительно к собственно эволюционным процессам. Однако, как мы указывали, биологическая эволюция представляет сочетание восходящей ветви, связанной с усложнением и упорядочением, и нисходящей ветви, которая характеризует процессы, ведущие к адаптации и видовому разнообразию, для которых равновесное состояние является аттрактором.