Особенности технологии рекомбинантных ДНК

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации

ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава»

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат

по биотехнологии

Использование рестриктаз и лигаз в технологии рекомбинантных ДНК. Создание липких концов

Исполнитель:

студентка 6 курса 64 группы

Николаев Николай Максимович

Руководитель:

зав. кафедрой фармацевтической технологии, доктор фармацевтических наук, профессор Первушкин С.В.

Самара, 2009

Содержание

Введение

1. Использование рестриктаз и лигаз в технологии рекомбинантных ДНК

2. Создание «липких концов»

Заключение

Список литературы

Введение

Технология рекомбинантных ДНК (также молекулярное клонирование, или генная инженерия) -- это совокупность экспериментальных процедур, позволяющих осуществлять перенос генетического материала (ДНК) из одного организма в другой.

В настоящее время можно вырезать отдельные участки ДНК, получать нуклеотиды на ДНК-синтезаторах (приборах для автоматического химического синтеза ДНК) практически в неограниченном количестве, определять последовательность нуклеотидов (разделяя, секвенируя их) сотнями в сутки, изменять выделенный ген, вводить его вновь в геном культивируемых клеток или эмбриона животного, где этот измененный ген начинает функционировать.

Эксперименты с рекомбинантными ДНК используют крупномасштабно в промышленном производстве БАВ.

Эксперименты по клонированию включают следующие этапы:

Рестриктазное расщепление из организма-донора нужных генов нативной ДНК (клонируемая ДНК, встраиваемая ДНК, ДНК- мишень, чужеродная ДНК).

Быстрая расшифровка всех нуклеотидов в очищенном фрагменте ДНК, позволяющая определить точные границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую геном.

Обработка рестрикционными эндонуклеазами вектора для клонирования, который может реплицироваться в клетке-хозяине.

Сшивание ДНК-лигазой двух фрагментов ДНК с образованием новой рекомбинантной молекулы - конструкция «клонирующий вектор - встроенная ДНК».

Введение этой конструкции в клетку хозяина (реципиента), где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией. После трансформации бактериальная клетка воспроизводит фрагмент клонируемой ДНК миллионами идентичных клеток.

Идентификация и отбор клеток, несущих рекомбинантную ДНК (трансформированные клетки).

Получение специфичного белкового продукта, синтезированного клетками-хозяевами.

1. Использование рестриктаз и лигаз в технологии рекомбинантных ДНК

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов - обязательного и незаменимого инструмента практически всех этапов этого сложного процесса, прежде всего ферментов рестрикции (рестрицирующих эндонуклеаз, рестриктаз).

Рестриктазы являются составной частью системы рестрикции - модификации прокариотических клеток. Эта система связана с защитой клеток от проникновения чужеродной ДНК.

Система модификации осуществляет метилирование собственной ДНК в сайтах ее узнавания немедленно после репликации; чужеродную ДНК, проникающую в клетку, бактерии гидролизуют с помощью рестриктаз.

Различают три основных класса рестриктаз:

1)рестриктазы класса I разрывают молекулы ДНК в произвольных точках, рестриктазы I и III классов обладают метилирующей и эндонуклеазной активностью.

2) ферменты II класса, которые и используются в генной инженерии, состоят из двух отдельных белков: рестрикционной эндонуклеазы и модифицирующей метилазы.

В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы.

Для их культивирования необходимы оптимальные условия (температура, состав и рН среды, концентрация кислорода и т.д.).

С целью повышения продуктивности и стандартизации процесса получения этих ферментов клонируют гены рестрицирующих эндонуклеаз в Е. соli.

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенных участках (сайтах).

2. Создание «липких концов»

Каждый фермент рестрицирующих эндонуклеаз «опознает» в ДНК специфическую последовательность из 4-6 нуклеотидов.

Многие рестрицирующие эндонуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, располагаясь наискось друг от друга. В результате образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из 4-х нуклеотидов в каждом («липкие» концы).

Кроме рестриктаз, расщепляющих нуклеотидную цепь с образованием липких концов, существуют рестриктазы, вносящие разрывы в цепи строго друг против друга с образованием ДНК с «тупыми концами».

Одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.

Для устранения разрыва в сахарофосфатном остове молекулы служит фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе при спаривании липких концов.

ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

Таким образом, одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая - содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.

Кроме того, при ДНК-рестрикции образуются разнообразные фрагменты и после их лигирования (соединения фосфодиэфирной связью) с векторной ДНК появляется множество различных комбинаций фрагментов, например, объединяющих между собой фрагменты донорной ДНК и векторные ДНК.

Для уменьшения количества последних рестрицированную векторную ДНК обрабатывают щелочной фосфатазой.

Заключение

Важным предварительным этапом работы генного инженера является подбор вектора. Векторы, используемые при работе с микроорганизмами, конструируются чаще всего на основе умеренных фагов или плазмид. Преимущество плазмид перед фагами заключается в отсутствии лизиса клетки, возможного при работе с умеренными фагами.

При создании нового рекомбинантного продуцента ключевым моментом в работе генного инженера является встраивание гена в вектор, точнее в ДНК векторной молекулы, например, в плазмиду. Это становится возможным, благодаря тому, что в распоряжении генных инженеров имеется большой набор разных рестриктаз.

Все системы клонирования должны отвечать двум основным требованиям:

Наличию нескольких сайтов для клонирования;

Возможности достаточно простой идентификации клеток с рекомбинантными ДНК.

Для всех рутинных процедур молекулярного клонирования широко используется Е. соli в качестве клетки-хозяина. Клетки, способные поглощать чужеродную ДНК, называются компетентными; компетентность Е.соli повышают, используя специальные условия культивирования. Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соli была сконструирована плазмида, содержащая сильный промотор; селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов -- полилинкер.

Эффективными методами трансформации Е. соli плазмидами является электропорация (воздействие на клеточные мембраны электрическим током для увеличения их проницаемости). Для введения клонированных генов в соматические клетки также применяют микроинъекции и микроукалывания или слияние с клеткой нагруженных ДНК мембранных везикул (липосом).

Список литературы

1. Биотехнология: Учебное пособие для вузов в 8 кн. /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987.

2. Дебабов В.Г. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. Биотехнология. Кн. 2: учебное пособие для вузов / В.Г. Дебабов, В.А. Лившиц. - М.: Высш. шк. - 1998. - 208 с.

3. Иммобилизованные клетки и ферменты. Биотехнология. / Под ред. Дж. Вудворта ; пер. с англ. - М.: Мир, 2008. - 288 с.

4. Инженерная энзимология. Биотехнология / под ред. И.В. Березина. - М.: Высш. шк.- 1997. - 159 с.

5. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. 2-е изд. М: Наука, 1974.

6. Производство белковых веществ. Биотехнология. Кн. 5 : учеб. пособие для вузов / [В.А. Быков и др.]. - М.: Высш. шк. - 1987. - 142 с.

7. Сазыкин Ю.О. Биотехнология: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева; под ред. А.В. Катлинского. - 3-е изд., стер. - М.: Издательский центр «Академия», 2008.

8. Северин С.Е. Биохимия и медицина - новые подходы и достижения / С.Е. Северин. - М.: Русский врач, 2006. - 94 с.