Изменение клеток выведенными бактериями и антителами

Введение

Биосинтез рибосом в Escherichia coli является координированным процессом, который регулируется многочисленными механизмами таранскрипционного и трансляционного контроля синтеза отдельных компонентов рибосомы. Транскрипция рибосомных РНК (рРНК) чувствительна к условиям среды, в то время как синтез рибосомных белков (р-белков) тесно связан с уровнем рРНК в клетке по механизму отрицательной обратной связи, называемому аутогенной регуляцией.

Консервативность регуляторных элементов

Картирование 5'-конца rpsB мРНК методом удлинения праймера на тотальной РНК E.coli показало, что транскрипция начинается за 162 нуклеотида до инициаторного AUG кодона rpsB с единственного промотора, который принадлежит к редкому классу удлинённых -10 промоторов TGTGG TATAAA. Удлинённый -10 элемент промотора E.coli отделён от места начала транскрипции GC-богатой областью, характерной для промоторов находящихся под строгим контролем. Последовательность промотора в сочетании с GC-богатой последовательностью перед стартом транскрипции является высоко консервативной среди г-протеобактерий. Экспериментально подтверждено, что фрагменты ДНК из E.coli, Y.pestis, H.influenzae и P.aeruginosa несущие предполагаемый удлинённый rpsB промотор, 5'-нетранслируемую область (5'-НТО) и начало кодирующей части rpsB-гена, слитые в рамке с lacZ-геном, обладают промоторной активностью и управляют синтезом репортерного lacZ-гена в E.coli.

Также была изучена аутогенная регуляция экспрессии гена rpsB белком S2 in trans (синтезируемым с плазмиды экспрессирующей ген rpsB). Оказалось, что белок S2 из E.coli способен ингибировать экспрессию rpsB'-`lacZ даже в тех случаях, когда эти конструкции содержат фрагмент rpsB из Y.pestis, H.influenzae и P.aeruginosa. Это наблюдение показывает, что механизмы регуляции оперона rpsB-tsf в г-протеобактерях высоко консервативны.

При значительном различии в длине 5'-НТО rpsB у разных видов г-протеобактерий компьютерное моделирование вторичной структуры РНК показало высокую консервативность укладки, что вероятно играет важную роль в регуляции.

Несколько специфических элементов последовательности в 5'-НТО оказались универсально консервативными, что предполагает их непосредственное участие в аутогенном контроле. Это предположение было подтверждено экспериментально. Филогенетическая консервативность структур мРНК, участвующих в аутогенной регуляции р-белков в г-протеобактериях была показана ранее для оперонов rpsA, S10 и spc. Наши исследования показывают, что мРНК rpsB является ещё одним примером подобной консервативности.

Получение антител к узловой

Ковалентные соединения вирусных геномов с терминальными белками широко представлены в природе: у пикорнавирусов, потивирусов, бактериофагов, аденовирусов и др. к 5'-концу РНК или ДНК ковалентно присоединен белок, играющий важную роль в инициации репликации вирусного генома. Есть основания считать, что подобные по структуре соединения образуются и в неинфицированной клетке. Для изучения инициации репликации подобных вирусных геномов и поиска новых клеточных комплексов нуклеиновых кислот с белками необходима разработка новых инструментов, позволяющих специфически определять ковалентные соединения нуклеиновых кислот и белков. Одним из инструментов для определения ковалентных соединений этого типа являются антитела к узловой структуре фосфодиэфирной связи между нуклеиновой кислотой и белком.

В настоящей работе был впервые получен препарат антител к синтетическому модельному соединению, имитирующему структуру «узла связи» между 5'-концевым остатком уридиловой кислоты РНК и тирозином терминального белка VPg пикорнавирусов. Проводили иммунизацию кролика модельным соединением, конъюгированным с яичным лизоцимом, и получали антисыворотки.

Для получения антител проводили сульфат-аммонийное фракционирование антисывороток, ионообменную хроматографию, антитела очищали на протеин А сефарозе и на аффинном сорбенте с модельным соединением в качестве лиганда. На всех стадиях очистки специфичность антител определяли методом «иммунозолото» на нитратцеллюлозных и нейлоновых мембранах. Было показано, что антитела к модельному соединению специфически узнают геномы пикорнавирусов (вируса энцефаломиокардита и вируса Менго). Антитела к узлу связи между РНК и терминальным белком пикорнавирусов могут быть использованы для изучения процесса инициации репликации вирусного генома и для поиска клеточных ковалентных соединений РНК и белка.

Изучение барьерной активности

Инсуляторами называют регуляторные элементы в геноме высших эукариот, которые обладают двумя основными свойствами: во-первых, инсулятор, находящийся между промотором и энхансером, способен блокировать активирующее действие энхансера на данный промотор; во-вторых, инсулятор способен предотвращать распространение гетерохроматина. Последнее свойство инсуляторов получило название барьерной активности. Барьерная активность инсуляторов может выражаться как в способности блокировать репрессионные сигналы, идущие от сайленсеров, так и в свойстве защищать трансгенные конструкции от «эффекта положения».

Мы протестировали недавно открытый в нашей лаборатории инсулятор WARI, находящийся непосредственно за геном white у Drosophila melanogaster, на способность блокировать репрессию генов yellow и mini-white, опосредованную известным сайленсером PRE Ubx. Мы показали, что WARI-инсулятор может блокировать действие сайленсера PRE Ubx, причем барьерная активность зависит от расстояния между инсулятором и защищаемым промотором. Более того, мы обнаружили, что мутации по генам su(Hw) и e(y)2 влияют на способность WARI-инсулятора нейтрализовать действие сайленсера, но не играют роли в энхансер-блокирующей активности инсулятора.

Инактивация фактора транскрипции клетках

В естественной среде обитания доступные бактериям источники азота различаются по количеству и химическому составу. Для их эффективной ассимиляции микроорганизмы выработали различные системы регуляции, которые отвечают на изменение доступности азотсодержащих соединений и контролируют экспрессию определенных групп генов. Результатом этого является синтез различных вне- и внутриклеточных ферментов и белков, а также изменение азотного метаболизма внутри самой клетки. Ключевыми белками-регуляторами азотного метаболизма в клетках бацилл являются фактор транскрипции TnrA и его структурный гомолог GlnR - репрессор глутаминсинтетазы (ГС). TnrA активен в условиях лимитации азотом, GlnR является его антагонистом и функционирует при росте с избытком легкодоступного источника восстановленного азота.

Активность фактора TnrA регулируется не фосфорилированием, а образованием белкового комплекса с ГС. В активном состоянии TnrA находится в комплексе с мембраносвязанным белком NrgB. Белки NrgB и NrgA в клетках B.subtilis формируют аппарат транспорта аммония в клетки. При этом белок NrgA является транспортным, а NrgB - сенсорным. Было обнаружено, что возможен другой способ регуляции активности фактора транскрипции TnrA - путем его внутриклеточного протеолиза. При переносе отмытых клеток из бедной азотом среды (фактор TnrA активен) в среду без источника азота этот белок исчезает в течении 15 минут. В то же время этого не наблюдается в клетках дефектных по генам nrgA и nrgB, что свидетельствует об участии этих белков в передаче сигнала о наличии азота, доступного клетке. Мы провели протеолиз in vitro очищенного белка TnrA грубым экстрактом клеток B.subtilis, а также его мембранной и цитоплазматической фракциями. Эксперименты показали, что протеолитическая активность, гидролизующая белок TnrA, локализована в цитоплазме. По-видимому, данная протеаза относится к вегетативным белкам клетки: TnrA подвержен протеолизу экстрактом, полученным из клеток до и после их переноса в среду без источника азота. Обнаруженная протеаза высоко специфична по отношению к регуляторным белкам: внутриклеточные ферменты, участвующие в синтезе аминокислот (ГС и NAG-киназа), не подвержены протеолизу клеточным экстрактом в условиях in vitro, в отличие от регуляторного белка NrgB и фактора TnrA.

Исследовали влияние различных ингибиторов на протеолитическую активность клеточного экстракта. Показано, что при инкубации в течение 20 мин клеточного экстракта с ингибитором сериновых протеаз PMSF (5мМ) активность подавляется полностью, с ингибитором трипсиноподобных сериновых протеаз бензамидином (5мМ) - на 60-80%. ЭДТА (10mM) не оказывает влияния на протеолитическую активность. Эти результаты позволили сделать заключение, что обнаруженная нами протеаза относится к классу сериновых протеаз. Был установлен рН-оптимум по гидролизу очищенного белка TnrA. Максимум активности наблюдается при рН 7.0, при значениях рН 8.0 и выше остаточная активность составляет 5-10%. Наши дальнейшие исследования будут направлены на очистку и идентификацию протеазы, осуществляющей протеолиз фактора транскрипции TnrA.

Пространственно-временная экспрессия

Малые ГТФазы семейства Rho - Rho, Rac, Cdc42 являются важными участниками регуляционных путей в раннем развитии организма. Основной темой проекта является исследование множественных путей молекулярных взаимодействий, инициированных сигналом извне и приводящих к активации Rho-ГТФаз и их мишеней, а также роли этих путей в развитии.

В нашей лаборатории исследуется активация Rho факторами обмена гуаниловыми нуклеотидами (RhoGEF), содержащими RGS-домен, с помощью которого RhoGEF регулируются гетеротримерными G-белками. Проводится работа по определению места этих белков в системе молекулярных взаимодействий сигнального каскада лиганд - рецептор - G-белок - GEF - Rho-ГТФаза на модели раннего развития Xenopus laevis, а также выясняется их роль в регуляции процессов раннего морфогенеза Xenopus laevis. Конкретной задачей данного исследования являлось определение экспрессии фактора обмена гуаниловыми нуклеотидами xLARG и гетеротримерного G-белка хGб13 на различных стадиях развития Xenopus laevis, а также на полюсах эмбриона.

При анализе постадийного паттерна экспрессии генов xLARG и xGб13 у зародышей Xenopus методом гибридизации in situ было установлено, что на стадиях дробления и бластулы в анимальном полушарии присутствует транскрипт материнского происхождения. С началом зиготической экспрессии генома на стадии 8,5 развития количество транскрипта xGб13 сохранялось, а уровень экспрессии xLARG имел тенденцию к снижению к концу гаструляции.

Новая волна экспрессии генов xLARG и xGб13, локализованная преимущественно в головном отделе, начиналась в период нейруляции, и количество транскрипта равномерно нарастало на стадиях нейрулы-хвостовой почки вплоть до последней исследованной стадии (стадия 40). Результаты были проверены и подтверждены методом исследования кинетики амплификации, а также высокочувствительным методом ПЦР с радиоактивной меткой с последующей количественной обработкой результатов.

Аналогичные методические подходы были использованы при исследовании распределения материнских транскриптов в различных зонах зародыша на стадии развития 8. Было показано, что, несмотря на высокое содержание желтка в вегетативных клетках, относительное содержание мРНК xGб13 во всех зонах зародыша одинаково. В то же время относительное содержание мРНК xLARG на вегетативном полюсе в десятки раз ниже, чем в анимальной, дорсальной и вентральной зонах.

Из приведенных результатов сделано заключение, что xGб13 имеет более равномерный характер распределения, чем xLARG. В настоящее время планируется взять для исследования еще один белок из подсемейства RGS-содержащих RhoGEF - xRhoGEF11. Белок xRhoGEF11 содержит тот же набор функциональных доменов, что и xLARG: DH-PH, PDZ и RGS - а потому также может быть членом сигнального каскада с участием Gб13. Планируется провести исследование пространственно-временного паттерна экспрессии xRhoGEF11 в раннем развитии Xenopus laevis.

Сайт-специфическая никаза

Сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции представляют собой прекрасную модельную систему для изучения аспектов специфического ДНК-белкового взаимодействия. Сайт-специфическая ДНК-никаза N.BspD6I представляет собой одну из субъединиц гетеродимерной сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции R.BspD6I. Она несет функцию узнавания специфического сайта двухцепочечной ДНК и расщепления одной из ее цепей на расстоянии 4 п.о. в стороне от сайта узнавания. Структура никазы N.BspD6I была определена нами ранее методом рентгеноструктурного анализа.

Настоящая работа посвящена изучению олигомерного состояния растворенной никазы при высокой концентрации, и ее способности в этих условиях связывать ДНК-дуплекс. Работа выполнена в рамках проекта по кристаллизации комплекса с ДНК сайт-специфической никазы N.BspD6I. В работе использовались методы нативного электрофореза в ПАА-геле, гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex200 10/300 и методом динамического светорассеяния (DLS). В ходе работы оптимизирована методика индукции клеток штамма-продуцента, а также модифицирована техника выделения белка. При выделении использовалась аффинная хроматография на гепарин-сефарозе и Ni-NTA-агарозе, в результате чего был получена никаза N.BspD6I c чистотой 95% и выше. Выход составил ~4 мг/л культуры. Установлено, что в растворе при концентрации от 0.04 мг/мл никаза N.BspD6I образует димеры, тримеры и более высокомолекулярные конгломераты, причем молекулярный вес конгломератов прямо пропорционален концентрации никазы в растворе. Присутствие специфического дуплекса разбивает эти конгломераты - образуется комплекс мономерной никазы и дуплекса. Для образования гомогенного комплекса достаточно превышения концентрации дуплекса над концентрацией никазы в 1,3 раза в молярном соотношении при концентрации никазы 1,5 мг/мл. Исследовано влияние 2-валентных ионов (Ca2+, Mg2+, Mn2+) на поведение белка в присутствии дуплекса.

Показано, что в присутствии ионов Ca2+ образуется пререакционный комплекс никазы и ДНК, тогда как в присутствии ионов Mg2+ образуется постеакционный комплекс; после внесения разрыва в цепь ДНК никаза остается связанной с дуплексом, а не покидает его, как это показано для сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции типа IIP. Получены комплексы никазы с дуплексами 18 п.о. и 21 п.о. длиной. Комплексы сконцентрированы до концентрации 14 и 20 мг/мл соответственно и использованы для получения кристаллов методом сидячей капли.

Заключение

В большинстве оперонов р-белков один из генов кодирует белок-регулятор, который, если синтезируется в избытке по отношению к рРНК, способен действовать в качестве аутогенного репрессора, связываясь с собственной мРНК и подавляя трансляцию. Для многих оперонов механизм регуляции детально изучен. Исключение составляет оперон rpsB-tsf, кодирующий рибосомный белок S2 и фактор элонгации трансляции Ts, для которого даже положение промотора оставалось неизвестным. Наша работа посвящена исследованию регуляции этого жизненно важного для бактерий оперона.

Список литературы

1. Хрисанорова, Е.Н. (2009) Основы геронтологии (Антропологические аспекты): Учеб. для студ. высш. учеб. Заведений. М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС.

2. Ханин Ю. Л. (2006) Краткое руководство к применению шкалы реактивной и личностной тревожности Ч. Д. Спилбергера. М.

3. Ильин Е.П. (2008). Дифференциальная психофизиология. СПб.: Питер.

4. Айдаркин Е.К., Огарев М.И, Покуль С.Ю, Щербина Д.Н., Айдаркина Е.С. (2008) Разработка методов контроля текущего состояния обучающегося в динамике решения арифметических задач // Валеология, № 4, стр. 69-77.

5. Ильин Е.П. (2008) Психомоторная организация человека. - СПб.: Питер.

6. Фотекова Т.А., Ахутина Т.В. (2009). Диагностика речевых нарушений школьников с использованием нейропсихологических методов: Пособие для логопедов и психологов. // М.: АРКТИ.

7. Nagarajan S., Mahncke H., Salz T., Tallal P., Roberts T., Merzenich M.M. (2009). Cortical auditory signal processing in poor readers. // PNAS, Vol. 96.

8. F. Ullen, H. Fossberg, H.H. Ehrsson. (2007) Neural Networks for the Coordination of the Hands in Time. J. Neurophysiol., 89.

9. Шиффман Х. (2008) Ощущение и восприятие. СПБ: Питер.

10. Баскова И.П., Исаханян Г.С. «Гирудотерапия. Наука и практика». М.: 2009.

11. Воронина Т.А. Отечественный препарат нового поколения «Мексидол». Основыне эффекты, механизм действия, применение. М., 2008.

12. Меринг Т.А. Условнорефлекторная деятельность в процессе старения у белых крыс // Журн. высш. нервн. деят. 2008.

13. Тушмалова Н.А., Прагина Л.Л., Баскова И.П., Басанова А.В., Завалова Л.Л. Улучшение выработки и воспроизведения рефлекса пассивного избегания у крыс под влиянием пиявита // Журн. высш. нервн. деят. 2008.

14. Абрамова Ж.И., Оксендлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества/Ж.И. Абрамова, Г.И. Оксендлер- Л.: Наука, 2007.

15. Акатов В.С. Противоопухолевый эффект острой гиперксии./В.С. Акатов, Ю.Н. Корыстов, Л.Н. Кублик, М.Х. Левитман, В.В. Шапошникова, Э.И. Лежнев// Эксперимен онкология, 23, 2, 2008.

16. Гродзинский Д.М. Надежность и старение биологических систем [Текст] /Д.М. Гродзинский, В.П. Войтенко, Ю.А. Кутлахмедов, В.К. Кольтовер - Киев: Наукова думка, 2007.