Сущность и структура растворимых белковых соединений

Введение

Расшифровка и анализ геномов организмов предоставили важную информацию о механизмах функционирования живых систем. Однако этих данных оказалось недостаточно для полного понимания всех процессов, происходящих в клетке. Следующим шагом в развитии системной биологии стала протеомика, в задачи которой входит изучение белкового состава клетки, а также локализации, функций и взаимодействий белков. Эукариотическая клетка содержит огромное количество различных белков, поэтому идентификация протеома целой клетки затруднена. В связи с этим целесообразным является разделение такой сложной смеси белков на подмножества - протеомы органелл.

Протеом митохондрий сердца: анализ растворимых белков

Митохондрии являются жизненно важными органеллами клетки и играют большую роль в жизнедеятельности организма. Нарушения функций митохондрий могут привести к серьезным последствиям для клетки и целого организма. Успех работы по идентификации протеома митохондрий позволит найти новые молекулярные мишени для терапевтического вмешательства при лечении различных болезней, поможет создать новые более эффективные лекарства.

Для достижения более полного определения белков митохондрии дополнительно разделяли на три фракции: внешние и внутренние мембраны, а также растворимые белки матрикса и межмембранного пространства. Целью данного этапа исследований являлась идентификация растворимых белков митохондрий миокарда сердца Bos taurus. Эти белки анализировали двумя способами: 1) поиск белков по фингерпринтам пептидных масс; 2) стратегия многомерной идентификации белков MudPIT.

Согласно первому методу, были получены индивидуальные белки с помощью двумерного гель-электрофореза, вырезаны точки, соответствующие белкам на геле, и проведено триптическое расщепление на пептиды. Далее пептидные гидролизаты анализировали с помощью МАЛДИ-времяпролетной масс-спектрометрии, и по полученным фингерпринтам были определены белки.

Во втором эксперименте обессоленные белки обрабатывались трипсином, из смешанного триптического гидролизата выделялись цистеин-содержащие пептиды с помощью аффинной хроматографии на колонке с тиопропилсефарозой. Пептиды, не сорбированные на колонке, идентифицировали с помощью масс-спектрометра, оснащенного ИЭР и ионной ловушкой, совмещенного «онлайн» с двумерной хроматографией. Цистеин-содержащие пептиды элюировали с аффинной колонки в-меркаптоэтанолом, модифицировали иодацетамидом и фракционировали с помощью обращеннофазовой ВЭЖХ. Полученные образцы анализировали на МАЛДИ-времяпролетном масс-спектрометре. В результате было определено около 220 белков.

Структурные исследования белка гемолизина

Bacillus cereus - широко распространенный в окружающей среде грам-позитивный спорообразующий микроорганизм, условно-патогенный для человека, отдельные штаммы которого способны вызывать пищевые отравления, в том числе с летальным исходом, а также ряд других заболеваний. Патогенные свойства B.cereus определяются синтезом многочисленных белковых токсинов. В настоящее время в литературе описано только три регулятора, участвующих в контроле экспрессии генов токсинов B.cereus. В их числе - HlyIIR, специфичный транскрипционный регулятор цитотоксина гемолизина-II. Ранее было показано, что HlyIIR способен специфично связываться с оператором гена гемолизина II и негативно регулировать его экспрессию. Однако молекулярная логика работы данного регулятора, а значит и детали регуляции экспрессии гемолизина-II, оставались не выясненными.

Данная работа посвящена структурным исследованиям белка HlyIIR. Нами была исследована олигомеризация HlyIIR in vitro с помощью методов химической сшивки, гель-фильтрации и седиментации, и in vivo с использованием бактериальной гибридной системы “CI fusion”. Были получены дифрагирующие кристаллы нативного HlyIIR, его селено-метионинового производного и мутантной формы. Методом рентгеноструктурного анализа была экспериментально определена структура HlyIIR и его мутанта, компьютерный анализ позволил выяснить детали его функционирования.

В результате проделанной работы установлено, что HlyIIR существует в виде гомодимера как в растворе, так и в бактериальных клетках, и не способен к образованию других олигомерных форм. Анализ пространственной структуры HlyIIR, определенной с разрешением 2,4 Е, показал, что этот белок относится к TetR-семейству транскрипционных регуляторов. На основании структуры был создан мутант HlyIIR с удаленной неупорядоченной областью L170-E185. Мутант обладал улучшенными кристаллизационными свойствами, однако из-за перестройки сегмента P161-D168 в районе димеризационного интерфейса мутант сформировал альтернативный димер. Данное наблюдение позволяет сделать вывод о важности сегмента P161-D168 для поддержания нативной структуры димера HlyIIR.

Кроме того, выявлена удивительная способность HlyIIR к образованию альтернативных белок-белковых контактов на одном и том же интерфейсе. Анализ пространственной структуры нативного HlyIIR выявил важную особенность структуры - наличие гидрофобной полости объемом 550 Е3.

Транcпортный белок с белком ядрышка фибрилларином

Функция клеточных белков в транспорте вирусов в зараженном растении представляет значительный интерес. Недавно было показано, что для транспорта умбравируса мозаики арахиса по проводящей системе растения необходим белок ядрышка фибрилларин. Белок дальнего транспорта умбравируса транспортируется в ядра, проходит в ядрышки, где колокализуется с фибрилларином, а затем возвращается назад в цитоплазму. Этот процесс сопровождается перемещением фибрилларина в цитоплазму и абсолютно необходим для формирования в цитоплазме вирусных рибонуклеопротеидных частиц (вРНП), требующихся для дальнего транспорта вируса. Выявлено прямое взаимодействие между белками in vitro, которое необходимо как для экспорта фибрилларина из ядра, так и для образования транспортного вРНП. Наши данные указывают на возможность реализации аналогичного механизма у другой таксономической группы вирусов - гордеивирусов.

С помощью стандартных методов клонированы полноразмерные гены вирусного и клеточного белков и их делеционные варианты. Рекомбинантные белки экспрессировали в E. coli и очищали с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. Белок-белковые взаимодействия изучали Фар-Вестерн методом, взаимодействия белок-РНК - методом задержки в геле.

Показано, что рекомбинантный фибрилларин, экспрессированный в E. coli, взаимодействует с транспортным ТБГ1 белком гордеивируса полулатентного вируса мятлика (ПЛВМ), который, как и транспортный белок умбравируса, способен локализоваться в ядре и принимает участие в формировании вРНП. С помощью серии делеционных мутантов фибрилларина и ТБГ1 белка ПЛВМ локализованы участки гетерологичных белок-белковых взаимодействий в составе клеточного и вирусного белков. Ими оказались глицин-аргинин-богатый домен фибрилларина и участок в составе N-концевой части ТБГ1 белка. Возможно, что именно взаимодействие ТБГ1 белка с фибрилларином и участие последнего наряду с ТБГ1 белком в образовании вРНП комплексов необходимо для реализации функции дальнего транспорта гордеивирусов.

Протеом митохондрий сердца мембранных белков

Расшифровка протеома эукариотической клетки в настоящий момент представляет собой практически неразрешимую задачу из-за сложности белкового состава. В связи с этим митохондрии являются идеальным объектом для протеомного анализа, так как имеют не слишком высокий уровень белковой организации. При этом митохондрии играют важную роль в жизнедеятельности клеток и целого организма. Известно, что митохондриальные дисфункции, связанные с дефектами митохондриальных белков, приводят к развитию более 40 различных заболеваний человека. В данной работе в качестве объекта исследования были выбраны митохондрии сердца Bos taurus.

С целью упрощения белкового состава анализируемого объекта был разработан метод выделения митохондриальных компартментов в качестве индивидуальных фракций. Данное сообщение посвящено анализу белков фракции внутренних мембран митохондрий. Для этого использовали сочетание различных методов расщепления белковой цепи с последующим фракционированием полученных пептидов хроматографическими методами. Для идентификации пептидов и соответствующих белков использовали тандемную масс-спектрометрию и специализированные программные продукты. В результате было идентифицировано более 170 индивидуальных белков, для которых проанализировано распределение по локализации в клетке и по функциям.

Отдельной задачей исследования было получение информации о топологии идентифицированных мембранных белков. Решение трехмерной структуры мембранных белков представляет собой сложную задачу. Методы рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии довольно трудоемки, дорогостоящи и требуют больших затрат времени. В то же время результаты таких исследований не всегда дают представление о нативной структуре белка. Существующие в настоящее время вычислительные методы оценки топологии мембранных белков недостаточно точны.

Получение информации о топологии мембранных белков протеомными методами имеет очевидные преимущества перед вышеперечисленными методами: меньшие затраты времени, высокая чувствительность и точность, нативность анализируемых белков, высокая производительность. Для изучения топологии белков внутренней мембраны митохондрий был разработан метод получения пептидов, относящихся к экстрамембранным («немембранные») и трансмембранным («мембранные») участкам белковой цепи, в виде отдельных фракций, которые далее анализировали протеомными методами независимо.

По идентифицированным пептидам определяли белки, для которых затем можно было определить экстрамембранные участки и трансмембранные тяжи, сравнивая «немембранные» и «мембранные» пептиды с последовательностью целого белка. Для проверки достоверности получаемой информации среди идентифицированных белков выбрали те из них, для которых трехмерная структура была определена методами рентгеноструктурного анализа или ЯМР-спектроскопии. Результаты наших исследований сравнивали с известной трехмерной структурой отобранных белков. Была показана высокая достоверность идентификации и хорошая степень совпадения экспериментальных данных и трехмерной структуры.

Пространственная организации домена белков

В хромосомах эукариот ДНК организована в большие петли, фиксированные основаниями на ядерном матриксе. В задачи нашей работы входило проанализировать пространственную организацию домена б-глобиновых генов кур в лимфоидных клетках линии DT40, пролиферирующих эритроидных клетках HD3 и терминально дифференцированных эритроидных клетках - эмбриональных эритроцитах. Нами было продемонстрировано, что в лимфоидных, не экспрессирующих глобины клетках, домен альфа-глобиновых генов организован в несколько петель, фиксированных основанием на элементах ядерного скелета. В делящихся эритроидных клетках пространственная организация резко отличается от лимфоидных клеток: большая часть домена коллапсирована и на препаратах развёрнутого хроматина (гало) наблюдается в виде точечного сигнала. Картирование участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу подтверждает сделанное наблюдение.

При равном уровне экспрессии глобиновых генов в делящихся и терминально дифференцированных эритроидных клетках пространственная организация домена отличается принципиальным образом. Подавляющее большинство сигналов имеет вытянутую форму, домен не организован в петли и не коллапсирован.

Эксперименты по иммуноокрашиванию антителами к РНК-полимеразе II демонстрируют, что терминальная дифференцировка ведёт к перераспределению РНК-полимеразы II в ядре клетки. В терминально дифференцированных клетках РНК-полимераза II вытесняется из хроматина в межхроматиновое пространство. В нашей работе мы показали, что пространственная организация домена б-глобиновых генов зависит как от транскрипционного, так и от пролиферативного статуса клеток. Терминальная дифференцировка ведёт к утрате участков прикрепления и вытеснению РНК-полимеразы II из хроматина в межхроматиновое пространство.

Заключение

Сравнительный анализ показал, что данная полость является лиганд-связывающим сайтом, а связывание предполагаемого лиганда модулирует ДНК-связывающие свойства HlyIIR, обеспечивая тонкую настройку регуляции гена гемолизина II. Проделанная работа позволяет расширить наше понимание молекулярных механизмов функционирования белков-регуляторов и логику регуляции экспрессии токсинов B.cereus.

Список литературы

1. Фаттахов С.Г., Резник В.С., Коновалов А.И. (2007) Мелафен - перспективный регулятор роста растений для сельского хозяйства и биотехнологии. Сборник материалов Всероссийского семинара-совещания «Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста растений нового поколения «мелафен» в сельском хозяйстве и биотехнологии», Казань, 3-12.

2. Kratz W.A., Myers J. (2008) Nutrition and growth of several blue-green algae. Am. J. Bot. 42.

3. Симаненков В.И. (2007) Психосоматические расстройства и их коррекция в кардиологии. Реализация вековых традиций народной медицины в современных седативных и анксиолитических средствах. Материал сателлитного симпозиума 7 Российского конгресса «Человек и лекарство» 2-е изд. - М.: Айвэкс Фармасьютикалс С.Р.О.

4. Короленко Н.Я. (2008) Психофизиология человека в экстремальных условиях. Л.: Медицина.

5. Кривощеков С.Г., Леутин В.П., Чухрова М.Г. (2008) Психофизиологические аспекты незавершенной адаптации ков. Новосибирск.

6. Хрисанорова, Е.Н. (2009) Основы геронтологии (Антропологические аспекты): Учеб. для студ. высш. учеб. Заведений. М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС.

7. Ханин Ю.Л. (2006) Краткое руководство к применению шкалы реактивной и личностной тревожности Ч. Д. Спилбергера. М.

8. Ильин Е.П. (2008). Дифференциальная психофизиология. СПб.: Питер.

9. Айдаркин Е.К., Огарев М.И, Покуль С.Ю, Щербина Д.Н., Айдаркина Е.С. (2008) Разработка методов контроля текущего состояния обучающегося в динамике решения арифметических задач // Валеология, № 4, стр. 69-77.

10. Ильин Е.П. (2008) Психомоторная организация человека. - СПб.: Питер.

11. Фотекова Т.А., Ахутина Т.В. (2009). Диагностика речевых нарушений школьников с использованием нейропсихологических методов: Пособие для логопедов и психологов. // М.: АРКТИ.

12. Nagarajan S., Mahncke H., Salz T., Tallal P., Roberts T., Merzenich M.M. (2009). Cortical auditory signal processing in poor readers. // PNAS, Vol. 96.

13. F. Ullen, H. Fossberg, H.H. Ehrsson. (2007) Neural Networks for the Coordination of the Hands in Time. J. Neurophysiol., 89.

14. Шиффман Х. (2008) Ощущение и восприятие. СПБ: Питер.