Новинки биотехнологий

Колледж Западно-Казахстанского государственного университета им. М. Утемисова

РЕФЕРАТ

на тему: «Новинки биотехнологий»

Выполнил: студент М-112

Днекешев А.А.

Проверила преподаватель:

Есеналиева М.К.

Уральск-2008

План

1. Введение

2. Основная часть

2.1 Биотехнология XXI века: Стволовые клетки

2.2 Использование эмбриональных стволовых клеток

2.3 Стволовые клетки взрослых

2.4 Прозенхимные плюрипотентные клетки (ППК)

3. Заключение

4. Список использованной литературы

1. Введение

Конец XX -- начало XXI в. -- это время, когда в клеточной и молекулярной биологии ученые достигли небывалых успехов. Одно из крупнейших достижений последнего времени -- получение вне организма изолированных линий эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека и животных. Жизненный путь этих клеток (а они исчисляются миллионами) можно переориентировать, спровоцировав их специализацию в любом направлении. Налажено на промышленном уровне производство бластоцист человека, получаемых в процессе искусственного оплодотворения из банка спермы и яйцеклеток. Считается, что изолирование ЭСК человека в лабораторных условиях -- третье по важности открытие биологии XX в. после открытия двойной спирали ДНК и полной расшифровки генома человека.

Понятие «ЭСК» существовало давно. Считалось, что эти клетки мигрируют из эпибласта в энто-, экто- и мезодерму, дают начало стволовым клеткам всех типов тканей человека и животных. Благодаря наличию стволовых клеток в тканях и органах их клетки могут регенерировать в случае повреждений и обновляться в течение жизни. Исключение составляют лишь клетки сердечной мышцы и нейроны, предшественники которых утрачивают способность к делению в течение первых лет жизни, хотя сейчас начинают пересматриваться и эти представления.

2. Основная часть

2.1 Биотехнология XXI века: Стволовые клетки

Научные эксперименты с яйцеклетками, зиготами и бластомерами млекопитающих и человека начались в 70-х гг. XX в. Тогда ученые пытались получить бессмертные перевиваемые клеточные линии. Однако их усилия до сих пор не увенчались успехом. Прорыв в этой области произошел после того, как стали использовать в экспериментах бластоцисты. Бластоцисты млекопитающих и человека получают в лабораторных условиях, используя зрелые неоплодотворенные яйцеклетки, извлеченные из половых путей. Из таких яйцеклеток микроманипулятором удаляется их собственное ядро, и на его место переносится ядро соматической клетки, предварительно определенным образом подготовленное. Образуется зигота с диплоидным набором хромосом соматической клетки. Зиготу стимулируют к делению, доводят развитие до бластоцисты, до такого ее состояния, когда она готова к имплантации в матку. Рассмотрим бластоцисту на примере бластоцисты мыши (см. рисунок). Это округлое образование, имеющее полость, слой клеток трофобласта и многослойный эмбриобласт.

Схема строения бластоцисты мыши в разрезе. 1 - эмбриобласт, 2 - трофобласт, 3 - полость бластоцисты.

Клетки трофобласта выделяют в полость бластоцисты ростовые факторы, необходимые для деления плюрипотентных клеток внутреннего зародышевого слоя (под плюрипотентностью понимают способность клеток дифференцироваться в разнообразных направлениях). Кроме того, трофобласт выделяет вещества, предотвращающие неконтролируемое деление клеток, а также их преждевременную дифференцировку и гибель.

В состав эмбриобласта в очень небольшом количестве (1--2% от общей массы клеток) входят тотипотентные клетки, которые, с одной стороны, способны к бесконечному делению, с другой -- могут дифференцироваться в любую специализированную клетку взрослого организма человека и животных. Задача ученых состояла в том, чтобы выделить тотипотентные клетки из эмбриобласта, стимулировать к размножению в искусственных условиях вне бластоцисты, нарушив их взаимосвязь между собой, и, наконец, стимулировать дифференцировку в нужном направлении.

Первые экспериментальные подходы к получению ЭСК были разработаны в 80-е гг. XX в. Суть их в том, что, используя микротехнику и микроинструменты, ме-ханически отделяют эмбриобласт от трофобласта. Затем эмбриобласт осторожно измельчают. Мельчайшие фрагменты эм-бриобласта, состоящие из 10 -- 15 клеток, помещают во флаконы с жидкой ростовой средой, в которои предварительно выра-щен слой эмбриональных фибробластов (фибробласты достаточно легко получить из абортируемого материала). Ростовая среда также содержит факторы, стимулирующие тотипотентные клетки к делению. Ростовые факторы относятся к группе цитокинов. Происходит наращивание клеточной массы тотипотентных клеток. Эти клетки не распластываются на поверхности слоя эмбриональных фибробластов. Они остаются в виде небольших групп сферической формы. При длительном их культивировании в специальной кондиционированной среде небольшая часть тотипотентных клеток приобретает способность к бесконечному делению. Клетки сохраняют нормальный кариотип, и при создании соответствующих условий их можно переключить на дифференци-ровку в любых направлениях и получить нужные клеточные формы взрослого организма. Так, например, была создана технология получения нейронов человека в лабораторных условиях.

В 1998 г. получены первые бессмертные линии ЭСК. Биотехнологические компании продают эти клетки порциями по 2--3 млн в партии. Институт репродуктивной биологии в Канаде наладил производство бластоцист человека из банка спермы и яйцеклеток, применяемых для процедуры искусственного оплодотворения. Бластоцисты для продажи используют после сложной процедуры замораживания -- размораживания, что предотвращает возможность их имплантации в гормонально под-готовленную матку суррогатной матери. Процедура замораживания предимплантационных бластоцист -- обязательное требование биоэтики при использовании остатков бластоцист после операций искусственного оплодотворения.

Первичное выращивание клонов клеток эмбриобласта происходит в течение 9 -- 15 дней. Клетки в культуре интенсивно делятся, формируя новые клоны по периферии первичных сфер. Затем однородные колонии осторожно собирают пипеткой, вновь разрушают до структур из нескольких клеток и переносят в новые флаконы с подложкой из монослоя эмбриональных фибробластов. Через 5--7 суток образуются новые клоны в виде микросфер. Каждый клон переносят в специальную пластиковую планшетку с множеством небольших ячеек. Используя определенные условия выращивания, каждый клон культивируют отдельно, доводя его до состояния 40-- 50 клеток. Процедуру повторяют несколько раз. В результате получают несколько линий ЭСК, которые через 100--120 повторов описанных процедур сохраняют высокий темп клеточных делений, мини-мальный белковый фенотип, характерный для недифференцированных клеток, высокую активность теломеразы, обычную для бластомеров, и потентность генома к дифференцировке в разнообразные соматические клетки.

ЭСК имеют более низкую частоту мутаций по сравнению с соматическими клетками, что объясняется особым строением хроматина. Это качество ЭСК детально изучено методами генной инженерии. Все незрелые эмбриональные клетки имеют на своей поверхности рецепторы для росто-вых факторов. При взаимодействии рецептора с соответствующим ростовым фактором трансмембранный сигнал передается в ядро клетки. Благодаря этому сигналу блокируется выход клеток из клеточного цикла, что связано с дифференцировкой. Сигнал способствует нахождению клетки в интерфазе, вступлению ее в 8-период, обеспечивающий удвоение ДНК, необходимое для клеточного деления.

Полученные линии ЭСК -- это не клоны одной единственной клетки. Все они выделены из группы клеток эмбриобласта.

Смена жизненного пути клеток осущест-вляется при условии изменения характера их культивирования. Клетки помещают во флаконы, не имеющие слоя эмбриональных фибробластов. Из среды убирают ростовые факторы и добавляют сыворотку крови. В ответ на это воздействие клетки прикрепляются к подложке и формируют цитоскелет, обеспечивающий им определенную форму. Качество подложки во многом определяет направление дифференцировки клеток.

2.2 Использование эмбриональных стволовых клеток

В организме взрослого человека в разных тканях и органах наблюдается специализация клеток в 250 различных направлениях. В простых условиях культивирования незрелые ЭСК под действием набора химических веществ можно превратить в высокодифференцированные клетки: нейроны, клетки сердечной мышцы, печени, островки Лангерганса поджелудочной железы, продуцирующие инсулин, и т.д. Ученым удалось из ЭСК мыши получить формирование элементов тонкой кишки, слоя гладко-мышечных клеток, нейронов, а также эмбриональных тканей -- эктодермы и мезодермы. Этот процесс происходит без органогенеза, в клеточной культуре. Для развития нейрональных стволовых клеток эпендимы развивающегося мозга необходимо совместное культивирование ЭСК с клетками хориоидного сплетения. Для развития стволовых клеток мезенхимы совмещают культивирование ЭСК с эндотелиальными клетками или капиллярной сетью.

Пересадка ЭСК в органы на уровне целого организма также изменяет их фенотип, в результате чего они приобретают тканеспецифичность. Введение суспензии ЭСК в организм человека способствует восстановлению мышц при миодистрофии, блокирует фиброз и почечную недостаточность. Пересадками ЭСК пытаются регенерировать иммунную систему в случае иммуно-дефицита, лечить обширные поражения головного мозга после инсультов, цирроз печени, последствия травм спинного и головного мозга, а также нейродегенеративные заболевания.

В ткани органа пул ЭСК обеспечивает смену постаревших аномальных клеток на новые здоровые популяции. Изношенные клетки убираются с помощью апоптоза, сложного процесса, обусловленного особой программой гибели клеток. Одновременно с замещением поврежденных клеток ЭСК мигрируют в другие органы. Это тоже способствует поддержанию баланса клеток в пересаженном клоне.

Особое свойство ЭСК -- их полная иммуносовместимость с клетками и тканями другого организма. Их геном так же, как и геном зиготы, находится в так называемой нулевой точке. Из этой точки могут стартовать две противоположные программы развития: гаструляцш и органогенез. Работа этих программ обеспечивается примерно пятью тысячами генов эмбриогенеза. Сами ЭСК содержат большое количество разнообразных мРНК (более 1000), образованных за счет работы ключевых генов эмбриоге-неза. Перераспределение этих мРНК между ядром и цитоплазмой -- ключевая часть реализации программы жизненного пути ЭСК. В ядрах ЭСК активно идет альтернативный сплайсинг исходных предшественников мРНК. Это позволяет клеткам синтезировать разнообразные белки без изменения экспрессии генов. Малые мРНК, образованные в результате сплайсинга, могут участвовать в регуляции транскрипции, быть корепрессорами транскрипции, что способствует сохранению активной упаковки хроматина и в то же время -- неактивному состоянию генов.

Переориентация жизненного пути ЭСК с многократного деления на дифференцировку--сложный процесс, который до конца не изучен. В настоящее время открыты гены контроля рестрикционного созревания, ко-торые обеспечивают дифференцировку ЭСК в обход органогенеза, как это обычно происходит в развивающемся эмбрионе. Предполагается, что мРНК могут быть маркерами этих функций. Показано, что регуляция процесса дифференцировки связана с потоком мРНК не только из ядра в цитоплазму, но и наоборот: из цитоплазмы в ядро. Поток мРНК характерен именно для ЭСК. Кроме того, описаны гены, обеспечивающие миграцию ЭСК в другие органы науровне организма. Эти гены работают именно в ЭСК.

В последние годы линии ЭСК, помимо эмбрионов человека, были выделены из эмбрионов коров, крыс, приматов, свиней. Все они имели близкое строение и универсальный набор антигенов на своей поверхности. Эти антигены -- универсальные маркеры тотипотентных ЭСК. Их выявление - обязательный тест, гарантирующий свойства ЭСК.

2.3 Стволовые клетки взрослых

В 70--80-е гг. XX в. наш соотечественник А. Я. Фриденштейнс сотрудниками показал, что в строме гематогенной ткани взрослых мышей и человека находятся самообновляющиеся плюрипотентные клетки. Эти клетки можно выделить из ткани и в клеточной культуре вне организма полу-чить клеточные линии -- клоны, потомки одной-единственной клетки. При смене условий выращивания они изменяют направление дифференцировки. Такие стволовые клетки были названы мезенхимными (МСК). МСК можно использовать в клеточной культуре для получения остеобластов, адипоцитов, хондроцитов и миоцитов. МСК нельзя назвать плюрипотентными, поскольку их способность к дифференцировке и делению ограничена. Чем старше организм, из которого выделены МСК, тем более лимитирована их способность к делению.

В настоящее время стволовые клетки взрослых пациентов научились выделять не только из кроветворной ткани, но и из жировой, мезенхимы различных органов, волосяных фолликулов эпидермиса кожи. Эти стволовые клетки также называются МСК. Потентность для дифференцировки МСК достаточно высокая. Установлено, что при трансплантации костного мозга донора клетки его обнаруживаются в самых разных органах реципиента. Донорские стволовые клетки заселяют не только костный мозг, но и миокард, печень и т.д. Организм реципиента становится биологической химерой.

Пересадка сердца от женщины с набором половых хромосом XX к мужчине с половыми хромосомами ХУ приводит к тому, что донорская ткань миокарда обновляется за счет собственных резервов. Идет химеризация пересаженного миокарда (XX) мезен-химными стволовыми клетками (ХУ). Таким образом, мезенхимные стволовые клетки, вероятно, присутствуют в разнообразных органах. Правда, в циркулирующей крови людей пока их обнаружить не удалось. Считается, что в зародыше млекопитающих на стадии органогенеза до 50% клеток представлены клонами ЭСК. В печени эмбриона на 1 млн гематогенных клеток присутствует 1 стволовая кроветворная клетка. Кроветворная ткань взрослого человека содержит 1 региональную стволовую клетку на 10 млн клеток.

В настоящее время активно изучается вопрос о региональных стволовых клетках человека и животных. У мышей стволовые клетки найдены в головном мозге, сердце, селезенке и печени взрослых животных. Эти клетки имеют разные потенциальные способности к дифференцировке и разное время устойчивого самообновления.

Ткани взрослого человека становятся важным источником стволовых клеток для клиники. Считается, что стволовые клетки с широкой потенцией в единичном количестве сохраняются в костном, головном и спинном мозге, криптах тонкого кишечника, волосяных фолликулах кожи, строме жировой ткани, специальном стволовом пространстве глаза, органах чувств. В 2001 г. клоны стволовых мультипотентных клеток были выделены из кожи взрослого человека. Эти клетки культивировали в течение некоторого времени вне организма, стимулируя их размножение. Затем условия выращивания изменили. В зависимости от внешних сигналов из этих клеток удалось получить три направления дифференцировки: образование нейронов, глии и олигодендроцитов.

Работы с мезенхимными стволовыми клетками опровергли устоявшуюся гипотезу о том, что мезенхима окончательно определяет направление дифференцировки стволовых клеток.

Стволовые клетки взрослых не обладают свойством иммуносовместимости с тканями другого организма. Поэтому для пересадки в медицинских целях желательно использовать собственные стволовые клетки. Другой перспективный путь -- создание семейного банка таких клеток. Примером может служить пересадка стволовых кроветворных клеток, выполненная в США еще в 1989 г. Родители имели дочь, страдавшую одной из форм неизученной анемии. Они запланировали рождение второго ребенка, чтобы использовать пуповинную кровь новорожденного для выделения гематогенных стволовых клеток. В семье родилась здоровая девочка. Ее гематогенные стволовые клетки использовали для лечения старшей сестры. Пересадка прошла успешно. Сейчас старшая сестра -- женщина в возрасте около 30 лет, замужем, здорова, имеет здорового ребенка.

2.4 Прозенхимные плюрипотентные клетки (ППК)

Один из дополнительных источников ЭСК -- половой зачаток эмбриона. На 4-- 5 неделе развития человеческого эмбриона начинают закладываться зачатки половой системы. В эти структуры из желточного мешка мигрируют клетки, которые становятся предшественниками половых клеток: оогониев и сперматогониев. Часть клеток удается перевести в перевиваемую клеточную культуру. Клетки размножаются в клеточной культуре над особой подлож-кой из коллагена при добавлении в среду комбинации ростовых факторов. ППК способны к длительному, но не бесконечному размножению. Над подложкой образуются агрегаты клеток, как и в случае культивирования ЭСК. Агрегаты имеют сферическую форму. Сохранить способность клеток к делению можно, пересевая в новые флаконы с подложкой, при этом клеточные агрегаты измельчают с помощью мягкого пипетирования.

Дифференцировка клеток начинается на поверхности сфер. Под микроскопом это выглядит как образование на поверхности сферических структур своеобразного шлейфа клеток иной формы. На мембране клеток, мигрирующих с поверхности клона, содержатся белки, с помощью которых клетки одного типа узнают друг друга и образуют зачатки тканей. Кроме того, начавшие дифференцировку клетки имеют рецепторы хемотаксиса, обеспечивающие направление движения клеток.

В агрегатах ППК идет образование клеток мезодермы, эктодермы и эндодермы. Каждый из перечисленных клеточных типов формируется на одной сферуле. Уже отработаны методы получения больших объемов однородных клеток любого зародышевого листка. Следующий этап работы связан с переводом этих клеток в линии соматических клеток, способных дифференцироваться из соответствующих зародышевых листков.

Процессом начала дифференцировки ученые научились управлять. Вступившие в дифференцировку клетки выделяют из клеточной культуры, метят их молекулярным методом и помещают в морулу или в бластоцисту вне организма. Происходит перепрограммирование продвинутых клеток до бластомеров. При этом на поверхности клеток образуются рецепторы, соответствующие для бластомеров. В настоящее время описаны 4 белка, обеспечивающие перепрограммирование. Они называются белками ингибиторами дифференцировки. На уровне развивающегося эмбриона они обнаружены в полости бластоцисты, показано, что их секретируют клетки трофобласта.

Вопрос об иммунотолерантности ППК до конца не решен. Считается, что такая особенность ЭСК, как отсутствие иммуноспецифичности, возможно, характерна и для ППК. Пересаженные ППК могут быть частично иммунотолерантны к антигенам клеток реципиента.

Впервые метод работы с ППК, полученными из полового зачатка зародышей мышей, был опубликован в 1994 г. Последние исследования показали, что значительная часть ППК сохраняется в зародыше вплоть до рождения. Использование таких клеток из абортивного материала очень перспективно. Установлено, например, что ППК можно с успехом применять для лечения мужского бесплодия. Донорские ППК хорошо встраиваются в эпителий семенных канальцев и участвуют в процессе сперматогенеза.

Из ППК удалось получить нейрональные, гематогенные, мышечные, мезенхимные стволовые клетки. Уровень и направление дифференцировки можно определить в эксперименте по наличию соответствующих рецепторов на поверхности клеток и развитию специфического цитоскелета, имеющего особенности для каждого типа клеток.

3. Заключение

Вопросы биоэтики, связанные с использованием ЭСК: один из основных методов получения ЭСК основан на использоваиии зрелых яйцеклеток и эмбрионов человека на ранней стадии развития. И это воспринимается обществом не однозначно. Так, христианская биоэтика наделяет даже одноклеточный зародыш человека статусом новой жизни. Церковь рассматривает работы с эмбрионами человека на ранней стадии развития как посягательство на жизнь человека.

Для разрешения этих противоречий принимаются законодательные документы как международными организациями (ВОЗ, ЮНЕСКО, ООН), так и отдельными государствами. Эти документы регламентируют деятельность ученых, работающих с ЭСК, согласно им определяются приоритеты и оцениваются медицинские выгоды, создаются универсальные основы биоэтики. Во многих странах наложен мораторий на репродуктивное клонирование человека, на эксперименты с ранними зародышами человека, на получение ЭСК, однако разрешается работать с линиями ЭСК, поступающими в продажу, использовать их в терапевтических целях. В России наложен пятилетний мораторий на работы по репродуктивному клонированию человека, но разрешено работать с ЭСК для медицинских целей. В странах Юго-Восточной Азии моратория на работы с ранними эмбрионами человека нет. Наоборот, в Индии и Китае такие работы ведутся очень активно.

В настоящее время в мире сделано более десятка успешных пересадок ЭСК людям. Согласно прогнозу на 2020-2030 гг., до 30% пациентов будут получать лечение в виде пересадок ЭСК. Учитывая такую перспективу, на данном этапе разрабатывается техническая документация по стандартизации технологической цепочки получения ЭСК, их маркировке по системе международных критериев. Стандартам должны соответствовать качество помещений, оборудования, посуды, характеристика исходного материала. Стандартизация требует демонстрации безопасности использования ЭСК на животных, а также их терапевтического эффекта.

Биотехнологические компании занимаются репродуктивным клонированием домашних животных на коммерческой основе. В разных странах, помимо овечки Долли, клонировано большинство домашних животных. Тем не менее проблемы клонирования до конца не решены. Для получения одного животного однотипный технологический процесс повторяется многократно (десятки, сотни раз). Несмотря на это, часто клонированная особь имеет аномалии в развитии как на эмбриональном, так и на постэмбриональном уровне.

История науки показывает, что ограничивающими законами спорных ситуаций не устранить. С течением времени противоречия между наукой и обществом обычно решаются, и часто неожиданным путем.

4. Список использованной литературы:

1. Жимулев И. Ф. Общая и молекулярная генетика. -- Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003.

2. Репин В.С, Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. -- М.: РеМеТэкс, 2002.

3. Ченцов Ю. С. Введение в клеточную биологию. -- М.: ИКЦ Академкнига, 2004.