Методы молекулярной генетики
Молекулярно-генетические методы. Выделение ДНК, синтез и рестрикция. Электрофорез гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Методика детекции мутаций с обязательным секвенированием, занимаемых ими сегментов. Методы детекции мутаций. Позиционное клонирование.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 06.04.2010 |
| Размер файла | 83,4 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Министерство образования и науки Украины
Харьковский национальный университет им. В.Н. Каразина
Биологический факультет
Курсовая работа по общей генетике
Методы молекулярной генетики
студентки 3 курса
заочной формы обучения
Чепур Г.В.
Харьков 2008 г.
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ
1. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
1.1. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК, ЕЕ СИНТЕЗ И РЕСТРИКЦИЯ. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
1.2. ГИБРИДИЗАЦИИ С МЕЧЕНЫМИ ДНК-ЗОНДАМИ. БЛОТ-ГИБРИДИЗАЦИЯ ПО САУЗЕРНУ, ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU
1.3. ДНК-ЗОНДЫ. МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ. ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ
1.4. ГЕНОМНЫЕ И ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ (КДНК) БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ.
ИХ СКРИНИНГ
1.5. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК. МЕТОД СЭНДЖЕРА (СЕНГЕРА)
1.6. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР)
1.7. ПОЛИМОРФНЫЕ САЙТЫ РЕСТРИКЦИИ.
ПДРФ-АНАЛИЗ
1.8. ХРОМОСОМ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ БИБЛИОТЕКИ ГЕНОВ
ПУЛЬСИРУЮЩИЙ ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
1.9. ПОЗИЦИОННОЕ КЛОНИРОВАНИЕ. ПРОГУЛКА И ПРЫЖКИ ПО ХРОМОСОМЕ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗОЛЯЦИЯ ГЕНОВ
2. ДНК-ДИАГНОСТИКА (DNA-DIAGNOSTICS) - МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
2.1. МЕТОДИКА ДЕТЕКЦИИ МУТАЦИЙ С ОБЯЗАТЕЛЬНЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЕМ, ЗАНИМАЕМЫХ ИМИ СЕГМЕНТОВ ДНК
2.1.1. ВЕДУЩИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ МУТАЦИЙ.
2.1.1. 1. НА (Heteroduplex analisis)
2.1.1.2. DGGE (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis
2.1.1.3. CMC (Chemical Mismatch Cleavage)
2.1.1.4. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
2.2. МОЛЕКУЛЯРНОЕ СКАНИРОВАНИЕ ИЗВЕСТНЫХ МУТАЦИЙ
2.2.1. Рестрикционный анализ
2.2.2. ПЦР-опосредованный сайт - направленный мутагенез
2.2.3. ARMS (Amplification Refractory Mutation System)
2.2.4. OLA (oligonucleotide ligation assay)
2.2.5. ASO - метод аллель-специфических олигонуклеотидов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ. ИЛЛЮСТРАЦИИ К РАБОТЕ.
Введение
Основой всех молекулярно-генетических исследований являются манипуляции с дезоксирибонуклеиновой кислотой (ДНК), уникальной биополимерной молекулой, которая несет в себе информацию обо всех белках, которые будут синтезированы в клетке. Последовательности нуклеотидов в молекулах ДНК определяют последовательности аминокислот в молекулах белков. От первичной структуры белка зависят его структурные особенности, от которых, в свою очередь, зависят функции полипептидов.
Проявление особенностей последовательности нуклеотидов в отдельных фрагментах молекул ДНК позволяет на принципиально новом уровне проводить диагностику патологических состояний и, т.о., внедрять современный подход к лечению и профилактике.
Методики исследования ДНК до недавнего времени были сложными в исполнении, требовали много времени и кропотливой работы. Современные технологии позволяют значительно упростить протоколы исследований, получить результат за короткий промежуток времени и при этом иметь точность и специфичность ответа до 99,9%.
1. Молекулярно-генетические методы
1. 1 Выделение ДНК, ее синтез и рестрикция. Электрофорез
ДНК может быть изолирована из любого типа тканей и клеток, содержащих ядра. Этапы выделения ДНК включают быстрый лизис клеток, удаление с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путем преципитации в этаноле. Из 1 г сырой ткани или из 109 клеток обычно получают 2 мг ДНК.
У человека ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего собирают от 5 до 20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором, препятствующим коагуляции (например, с глюгициром или гепарином). Затем отделяют лейкоциты и разрушают клеточные и ядерные мембраны добавлением буферных растворов, содержащих денатурирующие агенты. Наилучшие результаты при выделении ДНК дает применение протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией разрушенных белков. ДНК осаждают в этаноле и растворяют в буферном растворе. Оценку качества экстрагированной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНК в области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНК соотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) А(280) - оптическая плотность раствора при длине волны 260 и 280 нм, соответственно. В противном случае процедуру очистки необходимо повторять, т.к. для успешного использования и хранения ДНК белки должны быть полностью удалены.
В процессе сложного и многообразного функционирования различные участки хромосом и ДНК претерпевают разнообразные регулируемые и в основе своей обратимые изменения. Эти модификации осуществляются с помощью специальных белков - ферментов. Ниже мы ознакомимся с двумя классами ферментов: ДНК-полимеразами и рестриктазами, особенно важными для понимания основ современной молекулярной диагностики.
Ферменты, осуществляющие синтез ДНК, называются ДНК-полимеразами. И в бактериальных клетках и в клетках эукариот содержатся три различные формы ДНК-полимераз, все они обладают синтезирующей активностью и способны удлинять цепи ДНК в направлении 5'-3', последовательно прибавляя по одному нуклеотиду к 3'-ОН-концу цепи, причем точность синтеза определяется специфичностью спаривания оснований. Т.о., для работы ДНК-полимеразы необходима однонитевая матричная ДНК с двухнитевым участком на 3'-конце молекулы. Кроме того, в среде должны присутствовать четыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, и dTTP) - молекул, состоящих из оснований - А, С, G или Т, сахара - дезоксирибозы (d) и трех (Т) фосфатных остатков (Р). В клетках эукариот репликацию осуществляет ДНК-полимераза б, а в клетках E. coli - ДНК-полимераза ІІІ. ДНК-полимеразы обладают различными активностями, в т.ч. и экзонуклеазной в направлении 3'- 5', что позволяет им исправлять - репарировать - дефекты, допущенные при подборе комплементарных оснований. ДНК-полимераза І E. coli способна инициировать репликацию в месте разрыва ДНК и замещать гомологичный участок в двойной цепи ДНК. Это свойство используется для введения в ДНК меченых нуклеотидов методом ник-трансляции.
Открытие бактериальных ферментов, обладающих эндонуклеазной активностью, - рестрикционных эндонуклеаз, или рестриктаз, значительно продвинуло исследование ДНК и возможности генно-инженерного манипулирования с молекулами ДНК. In vivo эти ферменты участвуют в системе распознавания и защиты «своих» и уничтожения чужеродных ДНК. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разрезают ее на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 типов рестриктаз бактериального происхождения, причем каждый из этих ферментов узнает свою специфическую последовательность. Рестриктазы выделяют путем биохимической очистки из различных видов бактерий и обозначают тремя буквами, соответствующими первым трем буквам латинского названия вида бактерий, и римской цифрой, соответствующей хронологии открытия этого фермента у данного вида. В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают три класса рестриктаз: часто-, средне- и редкощепящие.
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркеров ДНК. Действительно, образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная масса, а значит, и физическое расстояние между сайтами. Следует упомянуть, что обычным методом выявления ДНК в геле, так же как и РНК, является ее специфическое окрашивание, чаще всего бромидом этидия, и просмотр геля в проходящем свете ультрафиолетовой области спектра. При этих условиях места локализации ДНК имеют красную окраску. При использовании для рестрикции нескольких эндонуклеаз с последующим электрофоретическим анализом перекрывающихся аддитивных по длине фрагментов ДНК можно добиться полного упорядочивания сайтов узнавания для каждого из ферментов относительно друг друга и каких-то новых маркеров, присутствующих в исследуемой молекуле ДНК. Процесс этот называется физическим картированием и является обязательным элементом анализа плазмидных, вирусных, бактериальных ДНК и относительно небольших фрагментов ДНК эукариот. На рис. 1 представлен простейший пример такого картирования в том случае, когда в исследуемой молекуле ДНК присутствует два сайта рестрикции - по одному для двух эндонуклеаз. После обработки исходной ДНК отдельно каждой из рестриктаз образуются два фрагмента, соответствующие по длине расстоянию от концов молекулы ДНК до сайтов рестрикции. При совместной обработке обеими эндонуклеазами на электрофореграмме появляется новый фрагмент, размер которого соответствует расстоянию между сайтами рестрикции. Очевидно, что эти данные еще не позволяют однозначно определить положение сайтов рестрикции по отношению к концам молекулы ДНК. Однако достаточно знать расположение хотя бы одного маркера для того, чтобы произвести точное физическое картирование исходной молекулы ДНК независимо от количества локализованных в ней сайтов рестрикции. При обработке тотальной геномной эукариотической ДНК, в частности, ДНК человека, часто- или среднещепящими эндонуклеазами образуется так много фрагментов различной длины (в среднем порядка 1 млн), что их не удается разделить с помощью электрофореза, т.е. не удается визуально идентифицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме. После электрофореза рестрицированной геномной ДНК получается равномерное окрашивание по всей длине геля - т.н. шмер. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путем гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Это достигается при помощи метода по блот-гибридизации Саузерну.
1.2 Гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ
Одним из эффективных методов идентификации определенных молекул ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является ставший уже классическим метод блот-гибридизации по Саузерну, по фамилии автора (Edward Southern), предложившего данный метод в 1975г. Последовательные этапы данного метода представлены на рисунке 2. Суть метода - рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяются по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану). Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивно меченым ДНК- или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация - высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК-зонда (более 109 расп./(мин Ч мкг)) этот метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДНК. Так при использовании зонда размерами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п.о. может быть выявлена в 10 мкг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после экспозиции в течение 12 часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры делают ее весьма дорогостоящей. Тем не менее, в ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения, в том числе и для диагностики генных болезней. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра.
Гибридизация с меченым ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости от конфигурации пятна ДНК на фильтре - округлой или продолговатой, соответственно. На рисунке 2 также изображены последовательные этапы этих методов. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн-блот, тогда как Вестерн-блот, или иммуноблот, - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих методов - дань уважения молекулярных генетиков проф. Э. Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку экспериментальных подходов, используемых для анализа ДНК. В ряде случаев для проведения гибридизации с ДНК-зондами не требуется предварительного выделения и очистки ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и на гистологических или хромосомных препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (fluoresce in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК-зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом (рис. 3).
Гибридизация in situ является одним из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутрихромосомной локализации уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Согласно последним данным, в экспериментах на специально приготовленных и растянутых интерфазных хромосомах человека разрешающая способность метода FISH может достигать 50 тыс. п.о., что составляет всего около величины среднего хромосомного бэнда. Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успехом решаются методом FISH.
Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-зондами проводится на гистологических препаратах и является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.
1.3 ДНК-зонды. Молекулярное клонирование. Векторные системы
ДНК-зондом может служить любая однонитевая ДНК ограниченного размера, используемая для поиска комплементарных последовательностей в молекуле большего размера или среди пула разнообразных молекул ДНК. В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные олигонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых обычно не превышает 30 нуклеотидов. Зондом также могут служить выделенные из генома последовательности ДНК. Однако значительно чаще такие последовательности предварительно клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве. Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулу ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бактериальные клетки хозяина (рис. 4). Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят название рекомбинантных ДНК. В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро- и аденовирусы, а также некоторые другие генетические конструкции. Размеры клонированных ДНК-зондов составляют от сотен до нескольких тысяч нуклеотидов, что определяется главным образом способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК.
Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции. Присоединение фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов - лигаз, после чего гибридная плазмида вновь принимает кольцевую форму. Присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в качестве маркеров трансформированных бактерий для их отбора на соответствующих селективных средах. При размножении трансформированных бактерий происходит увеличение числа копий инсертированного фрагмента ДНК. Т.о., этот чужеродный для бактерий генетический материал может быть получен практически в любых количествах. Выделенная из бактерий плазмидная ДНК или изолированный из плазмиды инсертированный фрагмент могут быть в дальнейшем использованы в качестве ДНК-зондов.
Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов оказалось удобнее использовать фаги - бактериальные вирусы. Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при ее рестрикции образуются два фрагмента, которые сшивают с чужеродной ДНК с образованием химерного фага.
Большое распространение получило клонирование в космидах - конструкциях, объединяющих в себе преимущества плазмид и фагов. Такие векторы могут существовать не только в виде плазмид, но и в виде фаговых частиц in vitro. Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40-45 тыс. п.о. инсертированной ДНК. Все выше перечисленные векторы используют для клонирования в прокариотических системах.
Векторы, пригодные для направленного переноса в эукариотические клетки, конструируют на основе прокариотических или дрожжевых плазмид - единственных плазмид, найденных в клетках эукариот, а также используют различные эукариотические вирусы, чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированные вирусы. При использовании плазмид в качестве клонирующих векторов в них вводят вирусные последовательности, ответственные за начало репликации.
Для клонирования субхромосомных фрагментов ДНК, содержащих целые гены, разработана система дрожжевых минихромосом. Искусственные дрожжевые хромосомы (YAC - yeast artificial chromosomes) конструируют на основе плазмидных векторов, содержащих в своем составе известные центромерные и теломерные последовательности хромосом дрожжей, необходимые для поддержания и репликации векторов в клетках хозяина. Такие системы способны удерживать фрагменты чужеродной ДНК размером в несколько сотен тысяч и даже миллионов пар оснований. Остановимся коротко на методах введения векторов в клетки хозяина. Введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки называется трансформацией. Если перенос генов осуществляется с помощью фага, то говорят о трансдукции. Процесс введения экзогенной ДНК в эукариотические клетки называется трансфекцией. Все эти методы основаны на подборе условий, облегчающих прохождение плазмидной или фаговой ДНК через клеточные и ядерные мембраны. Для повышения проницаемости мембран используют два разных подхода. В первом случае проводят обработку векторной ДНК и клеток хозяина буферными растворами, повышающими проницаемость клеточных и ядерных мембран (метод кальций-фосфатной преципитации, DEAE - декстран-опосредованная трансфекция). Во втором случае используют краткосрочное воздействие на клетки для создания в мембранах микропор, проходимых для макромолекул ДНК (метод электропорации - воздействие высоковольтным электрическим полем, «бомбардировка» частицами золота и т.п.).
1.4 Геномные и тканеспецифические (кДНК) библиотеки генов.
Их скрининг
Рассмотрим более подробно методы выделения и идентификации фрагментов ДНК, необходимых для анализа или использования в качестве ДНК-зондов. Основным источником этих фрагментов являются искусственным образом сконструированные библиотеки генов, в которых осуществляют поиск, или скрининг, нужных последовательностей ДНК разными методами в зависимости от специфических особенностей этих последовательностей. Библиотека генов - это полный набор клонированных перекрывающихся фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции или механического разрезания тотальной ДНК, выделенной из какого-либо специфического источника. В зависимости от происхождения ДНК различают геномные и библиотеки кДНК генов. Для конструирования геномных библиотек используют ДНК, выделенную из тканей, культур клеток, из отдельных хромосом или из фрагментов. При создании библиотек кДНК выделяют тотальную мРНК из тканей или культивируемых клеток, в которых заведомо экспрессируются интересующие исследователя гены. На следующем этапе методом обратной транскрипции (РНК-ДНК) синтезируют кДНК. Затем ее разрезают и упаковывают в выбранный для клонирования вектор. Схема конструирования геномных и кДНК библиотек представлена на рис. 5.
В геномных библиотеках присутствуют не только кодирующие последовательности генов, но также несмысловые внутригенные последовательности - интроны и межгенные участки ДНК, причем удельный вес некодирующих фрагментов ДНК значительно выше. Библиотеки кДНК состоят только из кодирующих - экзонных - областей генов. Наиболее удобный размер инсертируемой ДНК сопоставим со средним размером гена млекопитающих, и составляет 15 - 25 тыс. п.о. Оптимальный по размеру набор перекрывающихся последовательностей геномной ДНК человека получается после ее переваривания частощепящими рестриктазами Sau3a или Mbo1. Информационная емкость каждой библиотеки, т.е. количество клонов с различными инсертированными фрагментами ДНК, определяется размерами исходного генома и необходимостью присутствия каждой его последовательности хотя бы в одном клоне. Поэтому достаточно представительные геномные библиотеки млекопитающих обычно содержат не менее 8 Ч 105 - 106 различных клонов.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК- или любыми иными ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис. 6). Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высеивают на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким образом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в результате инфицирования клеток одним рекомбинантным фагом. Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики на другие чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот-гибридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки фильтров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локализации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК последовательности, комплементарные зонду, или специфические антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных культурах производят именно в тех местах, где произошло потемнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения, отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринированию. Обычно инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать большие количества этой ДНК.
1.5 Секвенирование последовательностей ДНК. Метод Сэнджера (Сенгера)
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного ДНК-фрагмента являются его физическое картирование и определение нуклеотидной последовательности, т.е. секвенирование. Методология секвенирования достаточно проста и заключается в том, чтобы получить серию комплементарных молекул ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике, однако, определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу. Существует три основных метода секвенирования: химическое - метод Максама-Гильберта, дезоксисиквенирование - метод Сэнджера (Сенгера), метод Тодда - последовательное расщепление фосфодиэфирной связи с последующим анализом экстрагированных гетероциклических оснований. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, т.к. он более надежен и прост в исполнении. Принцип данного метода показан на рис. 7. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, т.е. для образования двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминаторов - ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP (ddNTP). При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Т.о., в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех соседних дорожках и радиоавтографии размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, определена и локализация дидезоксинуклеотидов, и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК (см. рис. 7). На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная последовательность всего около 500 п.о. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной программе «Геном человека» еще несколько лет назад оценивалась в 1 $. В качестве модификаций метода Сэнджера используют предварительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных на основе фага М13 для получения протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвенированы без денатурации и праймирования. Очень эффективной оказалась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одновременно в обоих направлениях и прочитывать участки большей протяженности.
Особенно перспективным для массового секвенирования в автоматическом режиме оказалось применение меченых флюорохромами дидезоксинуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы в геле, что хорошо различается в автоматическом режиме. Этот метод нашел особенно широкое применение в реализации программы «Геном человека». Разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость одного звена и резко повысить эффективность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994 г. можно было просеквенировать до 1 млн п.о.
Разрабатывались принципиально новые, более эффективные и экономичные методы секвенирования. Особенно перспективным в1997 г. представлялся метод секвенирования путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так называемой олигонуклеотидной матрицей. Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых прошиты (иммобилизированы) октануклеотиды. Суть данного подхода в том, что прошивается набор всех возможных вариантов перестановок из четырех стандартных нуклеотидов (A,G,C,T) определенной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Т.о., определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. После этого при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих октамеров в изучаемом фрагменте ДНК.
1. 6 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Настоящую революцию в методологии исследования ДНК сделал Кари Мюллис, который в 1983 году предложил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). За это значительное открытие он получил Нобелевскую премию. Принцип метода состоит в получении большого количества копий некоторого фрагмента ДНК благодаря репликации in vitro. При этом исходное количество молекул с наследственной информацией может быть очень малым, достаточно даже одной молекулы, которая имеет большое значение в применении молекулярной диагностики для определения присутствия ДНК инфекционных агентов. Схема ПЦР представлена на рис. 8.
Для проведения ПЦР в реакционной смеси должны присутствовать:
· Олигонуклеотидные праймеры - искусственно синтезированные фрагменты ДНК размером 15 - 30 п.о., которые комплементарны последовательностям нуклеотидов в начале и в конце фрагмента ДНК, который синтезируется;
· Taq - полимераза - термостабильный фермент, который достраивает комплементарную цепочку ДНК;
· Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов - материал для построения второй цепочки ДНК;
· Образец, который исследуется - подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать ДНК, которую ищут (мишень для многоразового копирования). Если в смеси ДНК-мишень отсутствует, специфический продукт амплификации не образуется. При наличии ДНК-мишени и специальном температурном режиме образуется от миллиона до миллиарда копий исследуемого фрагмента, и такое количество ДНК хорошо видно в условиях электрофоретического расщепления.
Материалом для выделения ДНК могут быть образцы крови, соскобы слизистой оболочки, биоптаты тканей, осадок клеток мочи, любые клетки, которые имеют ядра. Количество материала для выделения ДНК достаточно незначительно - на одну манипуляцию выделения ДНК благодаря применению современных реактивов нужно 100 микролитров крови, 25 микрограммов тканей и т.п.
Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последующем значительно облегчает их секвенирование.
1.7 Полиморфные сайты рестрикции. ПДРФ-анализ
Около 90% генома человека состоит из некодирующих последовательностей, подобных сателлитным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным промежуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы и содержат множество т.н. нейтральных мутаций, или полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репродуктивные свойства особей и, т.о., не подверженных прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа родословных можно проследить их наследование в ряду поколений, проанализировать сцепление друг с другом, с известными генами и с анонимными последовательностями ДНК, т. е. использовать в качестве обычных менделеевских признаков в классическом генетическом анализе. Информативность полиморфных локусов определяется уровнем их генетической изменчивости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномного полиморфизма: количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появлению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае изменчивость по числу повторяющихся «кьровых» единиц создает серию аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого вариабельного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованных, как правило, в уникальных последовательностях некодирующих участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генетического кода могут возникать и в кодирующих последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их резистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции. Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на 300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и использован для молекулярной маркировки специфических участков генома исторически раньше по сравнению с вариабельными сателлитными повторами.
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов, т.н. ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну. При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равным расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация, зависит от локализации используемого для анализа ДНК-зонда. В дальнейшем мы рассмотрим только более общую ситуацию, где при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при наличии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую длину. Т.о., при анализе ДНК особей, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фрагменту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (рис. 10).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменяются после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины (рис. 10). У гетерозигот будут присутствовать три фрагмента, один из которых по длине будет соответствовать размеру амплификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Т.о., как и в случае использования для анализа блот-гибридизации по Саузерну, трем возможным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными генами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выделенной из группы неродственных индивидуумов, представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором имеющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популяциях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому даже при самой высокой вариабельности такого сайта число гетерозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50%.
1.8 Хромосом-специфические библиотеки генов.Пульсирующий гельэлектрофорез
Важное значение в картировании генов принадлежит молекулярно-цитогенетическим подходам, являющимся принципиально важным звеном для успешного совмещения карт сцепления и физических карт целых хромосом и их фрагментов.
Точность цитогенетического картирования определяется степенью спирализации хромосом, характером использованной метки и разрешающей способностью микроскопического оборудования. При картировании на стандартных метафазных хромосомах и использовании радиоактивно меченых зондов точность картирования ограничивается одним крупным диском или даже сегментом хромосомы и составляет около 5-10 млн п.о. При использовании биотиновой метки на прометафазных хромосомах точность картирования возрастает в среднем в 5-10 раз (до 1 млн п.о.), а при работе со специально подготовленными и растянутыми интерфазными хромосомами может доходить до 50 тыс. п.о. Тем не менее, даже при такой разрешающей способности цитогенетическое картирование дает лишь ориентировочные результаты и обычно рассматривается как 1-й этап физического картирования.
Значительно более точные результаты достигаются на 2 этапе - этапе физического (рестрикционного) картирования. Среднее расстояние между стандартными сайтами узнавания на рестрикционных картах колеблется в пределах от 10 до 20 тыс. п.о. Из-за расхождений почти на два порядка масштабов цитогенетического и молекулярного картирования прямое сопоставление этих типов физических карт практически невозможно.
Одним из способов преодоления этих трудностей является конструирование хромосом-специфических библиотек генов. Как уже упоминалось, для приготовления таких библиотек используют наборы клеточных линий соматических гибридов с отдельными хромосомами человека либо хромосомы, механически отобранные путем проточной цитометрии. Для некоторых видов молекулярного клонирования удобнее оказались библиотеки генов, построенные из субхромосомных фрагментов. Получение таких фрагментов достигается путем целенаправленного конструирования соматических гибридов, содержащих лишь часть какой-либо хромосомы человека. Субхромосомные клоны могут быть получены и с помощью микроманипуляций, при которых механически, под контролем микроскопа может быть вырезан практически любой видимый фрагмент каждой хромосомы. Разработаны также молекулярные методы выделения из генома и идентификации крупных фрагментов ДНК, приближающихся по размерам к единичным хромосомным дискам. Это стало возможным после обнаружения редкощепящих рестриктаз, разрезающих ДНК на фрагменты длиной от сотен тысяч до миллиона пар нуклеотидов.
Другим важным шагом на пути клонирования и анализа больших субхромосомных фрагментов ДНК явилась разработка методов из разделения путем гель-электрофореза в пульсирующем поле. В соответствии со стандартными методами электрофореза под действием однонаправленного постоянного поля в агарозном или в полиакриламидном гелях удается разделять фрагменты ДНК размером не более 30-50 тыс.п.о. Продвижение больших фрагментов ДНК в геле при пульсирующем изменении направления электрического поля происходит, по-видимому, за счет конформационных изменений, обусловленных скручиванием и раскручиванием молекул ДНК в момент переключения направления поля. При этом более короткие молекулы легче адаптируются к изменению условий и потому движутся в геле быстрее. Существуют различные варианты пульсирующего гель-электрофореза, главным образом связанные с геометрическим расположением направлений полей - ортогональный, гексагональный, инверсионный. При использовании любого из этих вариантов могут быть разделены молекулы ДНК размером от 50 тыс. п.о. до более чем 9 млн п.о. Эффективность разделения фрагментов ДНК зависит не только от их размеров, но и от условий проведения электрофореза (напряжения, температуры буфера, концентрации агарозы, времени одного импульса). В качестве маркеров для определения величины больших молекул ДНК используют целые хромосомы дрожжей известной молекулярной массы. В дальнейшем отбор крупных фрагментов ДНК, несущих специфические последовательности, также может быть осуществлен путем блот-гибридизации с ДНК-зондами.
Разделенные и идентифицированные фрагменты ДНК могут быть элюированы из геля, и использованы для рестрикционного картирования, построения библиотек генов и для молекулярного клонирования с целью идентификации и изоляции генных последовательностей. Для изоляции крупных субхромосомальных сегментов ДНК широко используют метод клонирования в искусственных дрожжевых минихромосомах - YAC - и построения библиотек генов на основе YAC-векторов.
1. 9 Позиционное клонирование. Прогулка и прыжки по хромосоме. Идентификация и изоляция генов
Средние размеры гена составляют около 10-30 тыс. п.о., варьируя в широких пределах. Единицы рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК измеряются миллионами пар нуклеотидов, так же как и размеры фрагментов ДНК, выделяемых с помощью обработки геномной ДНК редкощепящими эндонуклеазами, пульсирующего электрофореза и клонирования в дрожжевых минихромосомах. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК, сопоставимым с размерами гена, осуществляют с помощью молекулярного клонирования, т.е. получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относительно небольшие последовательности, насыщающие или полностью перекрывающие крупный сегмент ДНК, предположительно содержащий идентифицируемый ген (рис. 11). Затем проводят упорядочивание клонов в соответствии с взаимным расположением инсертированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов. Для молекулярного клонирования используют различные походы. Прежде всего, это насыщающее клонирование, т.е. изоляция из хромосом-специфических библиотек нескольких сотен клонов с целью картирования различными методами инсертированных в них фрагментов ДНК и идентификации клонов с последовательностями, локализованными в заданном районе. Значительно чаще используется тактика скринирования фаговых, космидных и YAC-библиотек, сконструированных из субхромосомных сегментов ДНК, предварительно отобранных на основании сцепления с различными ДНК-маркерами. При этом методы выделения субхромосомных сегментов ДНК могут быть самыми различными. Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами, получившими название «прогулки» и «прыжков» по хромосоме.
«Прогулка» по хромосоме, или скользящее зондирование (см. рис. 11), заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома. На первом этапе проводят скрининг библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с геном.
После нахождения положительных клонов последние сами служат зондами для изоляции других клонов, содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК. Т.о., каждый раз отобранный фрагмент используется в качестве скринирующего ДНК-зонда для последующего поиска. В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК, полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название «контигов». С помощью физического картирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в «контигах». При скринировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК, полностью перекрытого отобранными зондами, в среднем добавляется около 20 тыс. п.о. Таким способом, однако, редко удается пройти более 200-300 тыс. п.о. в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей ДНК.
Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследователем Фрэнком Коллинзом, президентом программы «Геном человека», был разработан метод «прыжков» по хромосоме. Этот метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие в геноме друг от друга на сотни тысяч нуклеотидов (длина прыжка), не изолируя при этом все промежуточные последовательности ДНК. Как видно на представленной схеме (рис. 12), прыжки начинаются со стартового зонда, т.е. с последовательности, гибридизующейся со сцепленным с геном ДНК-маркером. Предварительно геномная ДНК переваривается редкощепящей рестриктазой, в результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному прыжку. Затем эти фрагменты переводятся в кольцевую форму за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена. При этом концы рестрикционных фрагментов сближаются. Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднещепящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а, следовательно, и окружающие его концевые участки крупных исходных фрагментов. Отобранные последовательности клонируют в фаговых или космидных векторах, получая библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг клонов, содержащих стартовый зонд. Только в этих клонах комплементарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования.
Остановимся теперь на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющиеся частями генов, от любых других последовательностей (рис. 12). Условно эти критерии могут быть разделены на три группы. В первой группе исследуют структурные особенности генных последовательностей. Вторая группа критериев основана на поиске функциональных участков генов. В третьем случае анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК. Диагностику структурных участков осуществляют путем гибридизации с ДНК-зондами или прямым скринированием библиотек кДНК. Функциональная диагностика генов включает улавливание экзонов (exon trapping), промоторных участков, поли-А-сигнальных последовательностей, а также перенос генов в другие конструкции и идентификацию в них соответствующих транскриптов.
И, наконец, поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставлением ее с присутствующими в базах данных идентифицированными генами других видов живых существ.
Огромное значение для картирования генов человека имеет интегрированный молекулярный анализ экспрессирующихся последовательностей ДНК. Программы подобного анализа включают изоляцию и секвенирование коротких последовательностей ДНК из существующих библиотек кДНК генов, т.н. EST (expressed sequence tag). Локализация этих последовательностей на генетических картах переводит их в форму STS и маркирует присутствие генов в определенных сегментах ДНК. К 1997 году было секвенировано около 200 000 EST. Конечно, количество разных генов, фрагментами которых являются эти последовательности, значительно меньше. Важнейшим элементом этой работы является разработка методов совмещения генетических карт с картами микросателлитных индексных маркеров и EST-последовательностей.
Как уже отмечено ранее, кодирующие области генов, представленные в геноме уникальными последовательностями, достаточно консервативны в процессе эволюции. Существует высокий процент гомологии в структуре ДНК между одинаковыми генами у разных видов млекопитающих. На этом факте основан так называемый зооблот - скрининг клонированных последовательностей, не содержащих повторов, но дающих перекрестную гибридизацию с геномной ДНК, выделенной из разных видов животных: приматов, сельскохозяйственных животных, грызунов, птиц, рептилий. Клоны, содержащие консервативные последовательности, подвергают дальнейшему анализу на присутствие в инсертированных фрагментах ДНК CpG-островков, часто маркирующих 5'-фланкирующие области генов позвоночных, особенно генов «домашнего хозяйства», и исследуют наличие открытых рамок считывания - ORF (open reading frames). Дальнейший поиск генов в более узком интервале может быть осуществлен с помощью компьютерного анализа соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК. Кроме того, все клонированные ДНК из этого интервала могут быть сразу использованы для анализа РНК-транскриптов.
Важным доказательством принадлежности клонированной ДНК к гену является идентификация гомологичных РНК-транскриптов в тканях, где можно предполагать экспрессию этого гена. С этой целью проводят гибридизацию уже отобранных по первым двум критериям клонов ДНК с тотальной мРНК, выделенной из этих тканей, а также скринируют соответствующие библиотеки кДНК. Для генов наследственных заболеваний с неизвестным первичным биохимическим дефектом библиотеки конструируют из пораженных органов и тканей. При обнаружении последовательностей кДНК, гибридизующихся с геномными зондами, их, в свою очередь, используют для зондирования библиотеки и выявления всех клонов с перекрывающимися последовательностями кДНК. К сожалению, для генов с низким уровнем экспрессии гибридизация может не дать положительных результатов. Выделенные клоны, удовлетворяющие перечисленным критериям, с большой вероятностью содержат последовательности ДНК, являющиеся частями гена. Однако всегда существует опасность выбора какого-то другого гена (или псевдогена), локализованного в той же области ДНК. Поэтому требуются дополнительные доказательства идентичности выбранной последовательности ДНК специфическому гену. Такие доказательства могут быть получены, например, при определении нуклеотидной последовательности кДНК и сопоставлении ее с аминокислотной последовательностью кодируемого этим геном белка. Веским доказательством в пользу правильности проведенной идентификации гена может быть обнаружение мутантных вариантов аллелей в изолированных последовательностях ДНК у больных, страдающих соответствующим наследственным заболеванием. Так, например, при идентификации гена муковисцидоза у 70% больных в клонируемой кДНК-последовательности была обнаружена однотипная мутация - делеция трех нуклеотидов - delF508. Наконец, решающим подтверждением правильности идентификации нужного гена является успешно осуществленная с его помощью генокоррекция первичного биохимического дефекта, выполненная на соответствующих культурах мутантных клеток, или получение стойкого терапевтического эффекта у трансгенных животных - биологических моделей данного наследственного заболевания.
Подобные документы
Исследование молекулярно-цитологических основ мутационной изменчивости. Изучение разнообразия соматических и генеративных мутаций. Выявление причин возникновения мутаций. Значение мутаций в природе и жизни человека. Биологические и физические мутагены.
презентация [19,1 M], добавлен 24.04.2016Эволюция представлений о гене. Основные методы идентификации генов растений. Позиционное клонирование (выделение) генов, маркированных мутациями. Выделение генов, маркированных делециями методом геномного вычитания и с помощью метода Delet-a-gen.
контрольная работа [937,4 K], добавлен 25.03.2016История возникновения генетики и ее основные функции. Исследование наследования и скрещивания. Изменчивость и проблема генных мутаций. Современные возможности науки: трансгенные организмы, клонирование, лечение и предупреждение наследственных болезней.
реферат [55,6 K], добавлен 20.11.2012Описания изменений в ДНК клетки, возникающих под действием ультрафиолета и рентгеновских лучей. Характеристика особенностей генных и хромосомных мутаций. Причины и передача цитоплазматических мутаций. Исследование мутаций в соматических клетках растений.
презентация [62,2 K], добавлен 17.09.2015Фенотипические последствия гибридизации животных. Молекулярные методы определения видов. Молекулярно-генетические исследования видов рода Aquila. Разработка специфических праймеров для полимеразной цепной реакции. Особенности секвенирования по Сэнгеру.
дипломная работа [3,7 M], добавлен 25.06.2017Способность организмов передавать свои признаки и особенности развития потомству на молекулярно-генетическом уровне. Изменчивость наследственного материала. Процесс возникновения мутаций. Результаты, причины и значение генетических мутаций у человека.
презентация [21,5 M], добавлен 03.10.2014Оценка возможности использования генетических маркеров опухолевой ткани при раке легких. Определение частоты возникновения мутаций в гене EGFR. Влияние вдыхаемого табачного дыма на возникновения мутаций. Зависимость выбора тактики лечения от мутаций.
дипломная работа [186,7 K], добавлен 17.10.2013Жизненный цикл ретровирусов. Инфекция клеток ретровирусами. Спонтанные и индуцированные мутации. Основные процессы, приводящие к возникновению мутаций. Классификация мутаций по различным критериям. Последствия мутаций для организма, перенос генов.
реферат [26,5 K], добавлен 21.05.2015Обусловленность наследственной изменчивости типов мутаций и их комбинаций в последующих скрещиваниях. Генные, геномные, хромосомные мутации. Снижение жизнеспособности особей как последствие мутаций. Причины возникновения мутаций, безуспешность их лечения.
презентация [5,5 M], добавлен 11.02.2010Изучение понятия мутации. Отличительные черты генотипической, комбинативной, мутационной изменчивости. Причины мутаций и их искусственное вызывание. Признаки вредных и полезных мутационных процессов. Значение хромосомных и геномных мутаций в эволюции.
реферат [37,5 K], добавлен 12.11.2010
