Получение моноклональных антител

11

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию РФ

ГОУ ВПО «Самарский Государственный Медицинский Университет Росздрава»

Кафедра фармацевтической технологии

Реферат по биотехнологии

Получение моноклональных антител

Исполнитель:

студентка 6 курса 64 группы

Попова Елена Васильевна

Руководитель:

зав. кафедрой фармацевтической технологии,

доктор фармацевтических наук,

профессор Первушкин С.В.

Самара 2009

Содержание

• Введение 3
• 1. Понятие и функциональная структура антител 4
• 2. Получение моноклональных антител 6
• 3. Применение моноклональных антител в медицине 11
• Заключение 15
• Литература 16
• Введение
• Иммунобиотехнология - это раздел современной биотехнологии, представленной как научными достижениями, так и динамично развивающимся технологическим производством диагностических, профилактических и лекарственных средств с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной системы.
• Человек обладает иммунной системой для защиты от воздействия внешних неблагоприятных факторов, биологически активных агентов. В качестве таких агентов выступают клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды, объединенные под общим названием антигенов.
• Понятие «антиген» является общим, так как обозначает определенную химическую структуру, против которой могут быть получены антитела. Антигены внешней среды поступают в организм человека с воздухом, водой, пищей, через слизистые и кожные покровы [8].
• Иммунный ответ - сложный процесс межклеточного взаимодействия лимфоидных клеток разных типов с участием специфических гормонов, в результате чего так называемые В-клетки активно синтезируют специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.
• 1. Понятие и функциональная структура антител
• Антитела, однородные по структуре и специфичности, производимые в неограниченных количествах, называются моноклональными антителами. Моноклональные антитела вырабатываются иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы.
• Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которые антитело будет специфически связывать. Они могут быть даже использованы для детекции (обнаружения) этого вещества или его очистки.
• Еще в начале 20-го века Пауль Эрлих постулировал, что если бы мог быть выработан компонент, способный селективно связывать организм, вызывающий заболевание, то вместе с этим компонентом к патогенному организму мог бы быть доставлен токсин.
• В 1970-е годы уже были известны опухолевые В-лимфоциты (клетки миеломы), которые синтезировали один и тот же тип антител (парапротеин). Эти клеточные культуры использовались для изучения строения молекулы антитела, но не было методики, позволявшей продуцировать идентичное антитело к данному антигену.
• Слияние клеток лежит в основе получения гибридных клеток, продуцирующих антитела. Антитела - белки сыворотки крови, которые синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Иммунная система вырабатывает специфические антитела на огромное множество антигенов. В основе такой способности лежит наличие большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. В совокупности называемые иммуноглобулинами (lg), антитела составляют один из главных компонентов крови - по весу около 20% суммарного белка плазмы.
• Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности, получивших название антигенных детерминант. В случае белковой молекулы в качестве антигенной детерминантой являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков [3].
• Простейшие молекулы антител имеют форму буквы Y с двумя идентичными антиген-связывающими участками - по одному на конце каждой из двух «ветвей». Связывание антигенных детерминант приводит к потере определенных функций молекулы или клетки, на чем и основан защитный механизм действия антител. Поскольку участков два, они могут сшивать антигены.
• Если молекула антигена имеет три или большее число антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок.
• Молекула антитела образована четырьмя полипептидными цепями.
• Две из них - идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две - тяжелые (Н-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидными) связями. Антиген- связывающий участок образуется за счет одной Н и одной L- цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на Н-цепи. Н-цепь образует также «хвостовой» участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами.
• 2. Получение моноклональных антител
• Получение антител для нужд человека начинается с иммунизации животных. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g -глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесей белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.
• Стандартные препараты получить довольно сложно, так как их состав зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации, других малоконтролируемых факторов. В то же время, для современного биохимического анализа очень важна способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда [1].
• Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, в клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.
• Животное иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В - лимфоциты. Эти клетки могут жить только в организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.
• Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.
• Другой метод получения антител основан на инъекции полученной гибридомы в брюшную полость мышки. Там гибридома реплицируется и вызывает образование асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток.
• Процедура получения моноклональных антител включает в себя несколько этапов и занимает 3-4 месяца.
• Иммунизация животных. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс, так как подходящие миеломные клетки этих животных широко распространены и, кроме того, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме крыс и мышей. Для иммунизации применяют, как правило, очищенные антигены.
• Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.
• Конкретная схема иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков - слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Также для развития сильного иммунного ответа используют неоднократное введение антигена
• По ходу иммунизации необходимо определит титр антител к антигену (титр антител - величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт набирают животных с высоким титром антител.
• Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему иммунизации.
• Вводят 1-100мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцах внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2*109 убитых клеток B. Pertussis. Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворе. Эту процедуру можно повторять до появления высокого титра антиген. Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 суток животные забиваются, и готовится суспензия клеток для гибридизации.
• В последнее время развиваются методы полной иммунизации вне организма с целью получения гибридомы.
• Слияние. Существует два основных варианта добавления ПЭГ, используемые в настоящее время. Первый метод заключается в следующем. В течение 1 минуты добавляют 1мл 50% раствора ПЭГ при 370єС с постоянным перемешиванием. Затем раствор постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде культивирования.
• Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре. Клетки центрифугируют 2 минуты, затем их оставляют при комнатной температуре еще на 5-7 минут. Затем из разводят в большом объеме среды с сывороткой, обмывают и культивируют [2].
• Клонирование гибридомных клеток. Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. К основным методам клонирования клеток относится клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью цитофлориметра.
• Рассмотрим метод лимитирующих разведений. Если клетки посеяны в 96-луночные планшеты очень редко, то для лунок, в которой наблюдается рост клеток, подчиняется распределению Пуассона: Где (=1f (0) = 0.37. для того, чтобы получить разумную вероятность только одного клона в лунке, в более 37% лунок не должно наблюдаться роста клеток. Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%, клетки необходимо засевать при плотности 10,3 и 0,5 клеток на лунку. В тех планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок, содержатся изолированные клоны.
• При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором доля положительных клонов будет возрастать.
• Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же виды клеток, что и для начального роста гибридом.
• Массовая обработка моноклональных антител. После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя антитела, можно приступить в их массовому наращиванию с целью получения больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем 3-5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше 0,5млн/мл. клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и в роллерной, а также различного рода культиваторах.
• Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются культивировать оставшиеся живые клетки [7].
• Для получения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в организм животных и получают из них асцитную жидкость. Предварительно животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан - 0,5мл за 10-14 суток до введения клеток.
• Очистка антител. Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую фракцию можно получить высаливанием белка сульфатом аммония с последующим диализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то предварительно определяют их класс и подкласс, так как способы очистки различаются для антител разных классов. Это модно сделать с помощью метода иммунодиффузии по Ухтерлони. Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом методе, однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная структура клеточной поверхности.
• Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и ионообменной хроматографии на сефарозес пришитым ковалентным белком А.
• 3. Применение моноклональных антител в медицине
• Развитие технологии рекомбинантных ДНК, разработка способов получения моноклональных антител, установление структуры и функции иммуноглобулинов привело к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Привлекательность применения в качестве терапевтических средств специфических антител объясняется тем, что их можно использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения онкологических заболеваний.
• Терапевтическое применение антител началось 1891 году, сразу же после того, как Беринг и Китазато показали, что сыворотка крови морских свинок, выживших после введения дифтерийного или столбнячного токсинов, приобретала способность защищать других животных от действия этих же токсинов [4].
• Высокая терапевтическая эффективность антител при лечении дифтерии и некоторых других заболеваний быстро завоевала признание врачей. К сожалению, их применение сопровождалось побочными реакциями. Препараты антител, полученные иммунизацией животных, вызывали у пациентов сывороточную болезнь, которая в последующем исключала или значительно ограничивала возможность их применения.
• Предупредить такие осложнения можно, применяя антитела из сыворотки человека, и в настоящее время разработан целый ряд препаратов на основе антител из донорской крови.
• Для полной реализации терапевтического потенциала антител необходимо было обеспечить получение антител высокой специфичности против различных антигенов, в том числе антигенов тканей человека, значительно снизить вероятность побочных реакций на их применение и разработать технологии получения этих антител in vitro в достаточно больших количествах.
• Принципиальное значение для этого имела разработка получения моноклональных антител, так как препараты моноклональных антител содержат совершенно одинаковые, идентичные по своей структуре и свойствам молекулы, специфичность которых может быть полностью охарактеризована.
• Серьезным препятствием для широкого применения антител являлась их чужеродность для организма-реципиента. После введения антител в организме больного вырабатываются антитела против введенных антител, что снижает эффективность препарата и развиваются аллергические реакции.
• Необходимо было снизить чужеродность вводимых антител, гуманизировать их, сделать максимально похожими на антитела человека. Позднее были разработаны технологии получения таких антител. В результате чего полученные антитела стали широко применяться в медицине.
• Лидером терапевтического использования моноклональных антител является онкология. Разработан целый ряд моноклональных антител против различных опухолеассоциированных антигенов; показано, что многие из них обладают высокой терапевтической активностью и широко применяются в клинике.
• Применение моноклональных антител в настоящее время является широко используемой формой иммунотерапии рака. Она относится к пассивной иммунотерапии, так как использует синтезированные вне организма антитела и часто не требуют активного участия иммунной системы больного, реактивность которой часто снижена [10].
• Одним из наиболее изученных противоопухолевых препаратов антител является Трастузумаб (Герцептин) - рекомбинантные моноклональные антитела, которые связываются с рецептором HER2/neu на поверхности клеток многих солидных опухолей. Герцептин высокоэффективен при запущенном раке молочной железы. Интенсивно изучается совместное применение Герцептина и химиотерапии при метастазах рака молочной железы.
• Для повышения избирательности действия на опухоли антитела конъюгируют с токсинами или радиоактивными веществами, что обеспечивает доставку действующего вещества непосредственно к опухолевым клеткам. Моноклональные антитела, связанные с токсинами, часто называются иммунотоксинами. Для их получения к антителам чаще всего присоединяют бактериальные (дифтерийный или псевдомональный) или растительные токсины (рицин А или сапорин). Применяют иммунотоксины для лечения некоторых опухолей, особенно лимфом. Это два радиоактивно меченых моноклональных антитела - Ибритумомаб (Зевалин) и Тозитумомад (Бексксар). Конъюгированные антитела оказывают более выраженный терапевтический эффект, но и осложнения при их применении наблюдаются чаще, что зависит от характера связанного с ним соединения.
• Значительные перспективы имеет применение антител для терапии аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний, а также для предупреждения отторжения трансплантата. Раскрытие молекулярных основ иммунного распознавания, формирования активного иммунного ответа и толерантности, установление центральной роли в этих процессах Т-лимфоцитов позволяет направленно использовать целый ряд препаратов антител при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит, псориаз, рассеянный склероз, сахарный диабет и другие.
• Высокой эффективностью при лечении ревматоидного артрита обладал Алемтузумаб (Кэмпас). У большинства больных после применения препарата наблюдается стабилизация процесса или переход в длительную ремиссию. Однако при проведении повторных курсов препарата в некоторых случаях наблюдалось образование антиидиотипических антител [5].
• Целый ряд препаратов моноклональных антител (Эфализумаб, Алефацепт и др.) предложены для лечения псориаза, характеризующегося развитием хронического воспаления кожных покровов и суставов.
• К активным противоаллергическим препаратом относится Омализумаб - мнонклональные антитела, избирательно связывающиеся с lgE и предотвращающие его взаимодействие с высокоэффективными рецепторами Fcе-Ri. Эффективность Омализумаба при лечении тяжелых форм бронхиальной астмы была подтверждена клиническими исследованиями, в которых приняли участие 1070 больных.
• Заключение
• На основании ранее изложенного можно сделать вывод, что моноклональные антитела представляют собой новую группу лекарственных препаратов, обладающих высокой эффективностью при лечении рака, аутоиммунных и воспалительных процессов, а также ряда других заболеваний. Уже сейчас они позволяют помочь больным с такой паталогией, которую раньше не удавалось контролировать.
• Разработка новых препаратов многочисленными биотехнологическими компаниями позволяет ожидать появления в ближайшем будущем еще более разнообразных и эффективных лекарственных средств данной группы.
• Гуманизированные моноклональные антитела составляют значительную и быстро растущую часть общего рынка фармацевтических препаратов.
• Обзор данных по продажам и финансировании. Производства биотехнологических препаратов за последние три года свидетельствует о настоящем сдвиге парадигмы от классических фармацевтических препаратов к моноклональным антителам и сходных с ними биотехнологическим производным [6].
• Производством моноклональных антител в настоящее время занимаются около 200 биотехнологических компаний, реализующих сотни новых проектов.
• Ежегодный рост продаж препаратов моноклональных антител составляет более 20%. Это позволяет надеяться, что наиболее востребованные препараты моноклональных антител получат еще более широкое применение для лечения нуждающихся в них больных.
• Литература
• 1. Биотехнология лекарственных средств: учеб. пособие / под ред. В.А. Быкова, М.В. Данилина.-М.: Медбиоэкономика, 1991, стр.105-108.
• 2. Биотехнология: Принципы и применение / под редакцией И. Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джойса; пер. с англ.- М.: Мир, 1998, стр.45-82.
• 3. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗов /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987, стр. 15-25.
• 4. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология / Б. Глик, Дж. Пастернак.- М., Мир, 2002. - 589с.
• 5. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. Издательская фирма «Наука», СПБ, 1995, стр. 61-73.
• 6. Иммобилизованные клетки и ферменты / под ред. Дж. Вудворта; пер. с англ. - М.: Мир, 1998. - 321с.
• 7. Микробная биотехнология: Методическое пособие к лабораторным работам для студентов факультета промышленной технологии лекарств / Составители: Е.П.Яковлева и другие; С.-Петербург. Гос. Хим-фармац. акад. - СПб.: Издательство СПХФА, 2000, стр. 32-39.

8. Михайлов И.Б. Клиническая фармакология / И.Б. Михайлов. - СПб., 1998. - 473с.

9. Северин С.Е. Биохимия и медицина - новые подходы и достижения / С. Е. Северин. - М: Русский врач, 1998. - 94с.

10. Технология лекарственных форм: в 2-х т. / Под ред. Т.С. Кондратьевой, Л.А. Ивановой. - М.: Медицина, 1991. - Т.1. - 496с.; Т.2. - 544с.