Производственное культивирование микроорганизмов

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Поверхностное культивирование микроорганизмов на агаризованных средах

1.1 Применение поверхностного культивирования на агаризованных средх в аналитических целях

1.2 Культивирование микроорганизмов на агаризованных средах в промышленном масштабе

1.3 Контроль посевного материала

1.4 Стерильность процесса

2. Поверхностное культивирование микроорганизмов на твердых среда

2.1 Стерилизация твердых питательных сред

2.2 Оптимальные условия поверхностного культивирования на твердых средах

2.3 Технологическая схема поверхностного культивирования на твердых средах

3. Культивирование плесневых грибов на жидких средах

3.1 Влияние внешних условий культивирования

3.2 Подбор питательных сред

3.3 Минеральное питание и рН среды

4. Список литературы

ВВЕДЕНИЕ

Продукты микробного синтеза широко используется в химической и пищевой промышленности, медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве. Развивается производство органических и аминокислот, ферментов, антибиотиков, витаминов и белка.

До 30-х годов нашего столетия господствующим являлся поверхностный метод культивирования микроорганизмов на твердых или жидких средах. Несмотря на развитие в последнее время глубинной ферментации, поверхностный метод культивирования продуцентов для получения практически ценных продуктов в ряде случаев сохраняет свое значение в лабораторной и промышлен-ной практике.

При поверхностном методе культуру микроорганизма-продуцента выращивают на поверхности тонкого слоя жидкой или твердой среда. Жидкие питательные среда используют в основном при производстве органических кислот (лимонной, итаконовой), твердые - при производстве комплексов на основе крахмального и целлюлозу содержащего сырья. В качестве продуцентов в этих процессах применяются плесневые грибы.

Благодаря простоте промышленного осуществления поверхностный метод позволяет расширить область его применения, а при работе с твердыми средами - сравнительно высокое содержание субстрата и целевого продукта, что сникает энергозатраты на обезвоживание.

1. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА АГАРИЗОЗАННЫХ СРЕДАХ

Впервые агаризованные среды были использованы Робертом Кохом для изолирования отдельных клеток с целью получения чистых культур микроорганизмов. В качестве уплотняющих среду веществ кроме агара применяют и другие агенты, в частности желатину, силикагель и др. Однако агар обладает рядом полезных свойств, например, образует в воде гель, который плавится при 100°С, а затвердевает при 45°С. Добавление к агару при этой температуре термолабильных веществ и живых микроорганизмов не вызывает их разрушения. Растворы агара не нуждаются в фильтрации

Следует отметить, что агар, полученный из различных видов морских водорослей, не является инвертным материалом, а представляет собой сложный эфирный комплекс полисахарида и серной кислоты. Он содержит также микроэлементы, некоторые физиологически активные вещества и факторы роста, например,тиамин.

Метод поверхностного культивирования на различных агаризованных средах широко применяется в лабораторной практике и в некоторых промышленных процессах, в частности для сохранения коллекционных культур, для изучения физиологических и биохимических свойств микроорганизмов, для аналитических целей. В промышленном масштабе этот метод нашел применение при получении спорового материала для производства органических кислот с помощью плесневых грибов рода Aspergillus.

В литературе имеется много данных о самых разнообразных способах сохранения коллекционных культур. Тем не менее, многие микроорганизмы в крупнейших коллекциях мира сохраняются на агаризованных средах, специфических для данного организма. Так, например, для сохранения плесневых грибов используют бедные сахарами крахмальные среды. Большинство грибов-продуцентов ферментов сохраняются на эгаризованном пивном сусле. Для сохранения термофильных актиномицетов предпочтительнее пептонно-кукурузный агар. Хорошую сохранность некоторых актиномицетов обеспечивает голодная среда, т.е. агаризованная среда, содержащая только воду.

Постоянная доступность культур для работы и возможность непосредственного контроля за чистотой и состоянием во время хранения: являются положительными сторонами, определяющими хранение дрожжевых и бактериальных организмов на эгаризованных средах.

При поверхностном культивировании на агаризованных средах обычно изучают реакцию микроорганизмов на воздействие факторов окружающей среды. Сюда относятся наблюдения за характером роста и культурными особенностями колоний микроорганизмов, изучение влияния света, температуры, аэрации, кислотности среды, поскольку именно внешние воздействия являются средством управления ростом и метаболизмом микроорганизмов. Немаловажное значение имеет также изучение пищевых потребностей микроорганизмов.

На агаризованных средах удобно определять и исследовать физиологические и биохимические свойства плесневых грибов, например, образование окрашенных веществ, органических кислот, антибиотиков и др., дифференциацию плесневых грибов в зависимости от состава питательной среды. Этим методом пользуются также для определения количества спор и особенностей спороношения.

С помощью метода дисперсии на эгаризованных средах были обнаружены морфологические варианты колоний определенных бактерий и дрожжей. Следует отметить, что методом изучения отдельных колоний на эгаризованных средах пользуются при выделении новых вариантов микроорганизмов, обладающих способностью к синтезу определенных специфических веществ.

1.1 Применение поверхностного культивирования на агаризованных средах в аналитических целях

Благодаря быстроте, малой затрате труда и материалов микро биологические методы анализа имеют существенные преимущества по сравнению с химическими. В то же время им присуща строгая специфичность. Подавляющее большинство микробиологических методов количественного определения витаминов, аминокислот антибиотиков основано на ростовой реакции тест-организма при поверхностном культивировании на агаризованных средах. Например, при определении активности антибиотиков широко применяют так называемый "чашечный метод", который основан на способности антибиотиков диффундировать в плотную питательную среду и на сравнении угнетения роста тест-организма определенными концентрациям: испытуемого препарата с угнетением роста известными концентрациями стандартного препарата антибиотиков.

Чашечный метод определения витамина В12 аналогичен описанному выше методу, с тем отличием, что при определении витамина применяется среда, в которой этот витамин отсутствует, и замеряются зоны стимулирования роста, а не подавления его. Этим же методом можно пользоваться при определении некоторых аминокислот.

1.2 Культивирование микроорганизмов на агзризовэнных средах в промышленном масштабе

Метод в основном применяется для получения спорового материала плесневых грибов - продуцентов органических кислот. Как пример приводится описание производства посевного материала сухих спор плесневого гриба Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты. Процесс получения посевного материала состо-ит из следующих стадий:

-поддержание культуры в активном состоянии;

-отбор высокоактивных к биосинтезу лимонной кислоты вари-антов культуры (штампов);

-размножение культуры для производства.

Поддержание штамма в активном состоянии:

Для поддержания культуры штамма в активном состоянии и сохранения его морфологических и биохимических свойств дается коллекция культур в виде спорового "консерва" (одна часть спор на одну или две части активного угля). После тщательной проверки (микробиологического и биохимического контроля) культура из коллекции передается на размножение для получения спорового посевного материала.

Для создания резервного фонда периодически 1 раз в год выделяют исходную культуру из одной колонии. Одновременно изолируют 20-30 культур, которые проверяют на морфологическую однородность и активность кислотообразования. Лучшие из культур в виде спор, отделенных от мицелия, подвергают повторным испытаниям на кислотообразование. Параллельно те же культуры испытывают в двух-трех последовательных пересевах на сусло-агаре через каждые 8-10 суток.

Культуру, которая сохранила в течение пересевов свои морфологические и физиологические признаки и высокую устойчивую активность к биосинтезу лимонной кислоты, используют для производственного размножения взамен устаревшей культуры.

Производственное размножение штамма:

Посевной материал для производства лимонной кислоты получают путем пересева исходной культуры штамма в одну-две стадии с последовательным увеличением площади спороносного мицелия на модифицированной сусловой питательной среде.

Первая стадия размножения. Споры исходной культуры высевают питательную среду, состоящую из пивного сусла (7% по сахарометру КЛП), 1-2% NaCl,0,I% мочевины, 0,0001% CuSO4 и 2-3% агара. Среду наливают слоем 1,2-1,5 см в алюминиевые кюветы (10-20 кювет) с площадью дна 10-12 дм. Высев спор осуществляют с помощью пульверизатора.

Кюветы с посевом выдерживают в течение 8,5 суток в термокамере при 30-32°С. Влажность воздуха в термокамере в начале цикла составляет 80 90%, в конце - 60-70% (контролируется с помо-щью психрометра). Далее, до 9,5-10 суток кюветы выдергиваются при 20-25°С, после чего кюветы с культурой просматривают в стерильном боксе и визуально отбраковывают по морфологическим признакам.

Споры собирают с помощью кисточки или вакуумного устройства и смешивают со стерильным активным углом в отношении 1:1-1:2. После тщательного микробиологического и био-химического контроля переходят ко второй стадии размножения.

Вторая стадия размножения.

Используют ту же питательную среду, что и на первой стадии, увеличивается только количество кювет. Споры первой стадии высеивают с помощью приспособленного для этой цели пылесоса, рассчитывая на каждую кювету 20-30 мг. Режим культивирования аналогичен первой стадии.

Споры второй стадии с поверхности мицелия собирают с помощью вакуумного устройства, работающего по принципу пылесоса. Устройство состоит из специального сборника - металлической колбы, которая закрыта пробкой с двумя отверстиями. К первому резиновым шлангом прикреплена легкая металлическая насадка. Через второе отверстие проведена металлическая трубочка, которая одним концом присоединена к вакуумной линии, а другой конец, расположенный в колбе, присоединен к металлическому каркасу (латунный фильтр). Под действием вакуума споры через щель в насадке поступают в колбу.

Съем спор с 1 дм2 составляет в среднем 1,20-1,45 г. Количество спор в I г составляет 20-25 миллиардов.

Собранные споры содержат 40-50% влаги, поэтому после сбора их высыпают в пустые алюминиевые кюветы (площадь дна 10-12 дм2) по 200-300 г в каждую и сушат в термокамере при 28-30°С до потери 20-25% общей начальной массы.

После сушки споры с помощью вакуума собирают в металлическую колбу и смешивают с активным углем в отношении 1:1 в штативе-мешалке в течение 60 часов.

Активный уголь перед употреблением стерилизуют в сухом каре при 200-250°С и используют после проверки на стерильность.

1.3 Контроль посевного материала

Споровый посевной материал перед использованием в производстве подвергают микробиологическому и биохимическому контролю. Проверяют микробиологическую чистоту, морфологическую однородность, всхожесть спор, количество в 1 г посевного материала, а также активность к биосинтезу лимонной кислоты.

Для контрольной проверки от каждой партии спор отбирают в. несколько приемов среднюю пробу в количестве 1% общей массы. По результатам контроля средней пробы судят о качестве всей партии.

Партией считается количество спор, выращенных одновременно и оформленных одним документом.

Микробиологический контроль:

Служит для установления микробиологической чистоты и морфо-логической однородности посевного материала и осуществляется методом разливок споровой взвеси на чашках Петри с сусло-агаром (СА), мясо пептонным агаром (МПА) или рыбо-пептонным агаром (РИА).

Для анализа берут навеску спор в 35 мг и высевают на 80-90 чашках Петри с СА и 10-20 часках с 1Щ или РПА. Испытуемый споровый материал разводят так, чтобы густота роста была не ме-нее 40-60 колоний на чашку.

Чашки с СА выдерживают в термостате при 32°С в течение 5-6 суток, с МПА при 37°С 1-2 суток.На 4 и 6-е сутки после посева чашки просматривают, определяя однородность (отсутствие форм изменчивости штамма) и чистоту культуры (отсутствие бактерий, дрожжей и цветных плесеней). При обнаружении неактивных форм изменчивости штамма более чем на 0,2% или посторонней микрофлоры посевной материал бракуется.

Биохимический контроль:

Чтобы получить правильное представление о биохимической активности посевного материала, необходимо заготовить хорошо сбраживаемую мелассу и тщательно определить режим подготовки ее для синтеза лимонной кислоты.

Определение проводят параллельно не менее чем на трех химических стаканах емкостью 5 00-800 мл и площадью дна 0,4-0,7 дм2. Сбраживают 15%-ный (по рефрактометру РПЛ-3) мелассный раствор. При высоте слоя сбраживаемого раствора 12 си продолжительность брожения 3 суток, а при высот 9 см - 7 суток.

Химикаты применяют в виде растворов следующих концентраций:

-кислота серная, I н.раствор или гидрокарбонат натрия,10-ный раствор;

-калий железистосинеродистый ,10%-ный раствор;

-калий фосфорнокислый однозамещенный, 1-ный раствор;

-цинк сернокислый, 1-ный раствор; рН раствора 6,8-7,2 (по рН-метру ПЛ-01).

Стаканы с мелассным раствором засевают споровым материалом с помощью пульверизатора и помещают в термокамеру при 31-32°С на 7 или 8 суток (в зависимости от высоты мелассного раствора).Затем сброженный раствор сливают и титруют раствором едкого натрия. По результатам титрования подсчитывают средний съем кислоты.

Посевной материал считается пригодным для производства,если съем лимонной кислоты X м2 площади брожения в сутки составляет:

при толщине слоя мелассного растворе 12 см и продолжительности брожения 8 суток.При толщине слоя мелассного растворе 9 см и продолжительности брожения 7 суток.

Определение всхожести спор

На предметном стекле при помощи специальных колец готовят влажную камеру. Споры проращивают в висящей капле суслового или мелассного растворе, приготовленного так же, как и для биохимического контроля, но дополнительно профильтрованного и простерилизованного в течение 30 мин под давлением в 1 атм. Споровую суспензию готовят в таком разбавлении , чтобы в капле было 10-15 опор. Время проращивания 9 часов при 32°С.

Общее количество просмотренных опор в каждой партии 400-600. Подсчетом устанавливают количество проросших и непроросших спор. Всхожесть - это отношение проросших спор к общему количеству просмотренных, выраженное в процентах, Всхожесть должка быть не выше 90%.

Определение количества опор в 1 г посевного материала:

На аналитических весах отвешивают 70 мг испытуемого посевного материала о Навеску помещают в пробирку с 5 мл вод: и перемешивают в течение 20 мин (о бусами). Для лучшего перемешивания и удаления комков можно использовать сульфанол. Затем содержимое пробирки перенося* в колбу с 40 мл воды, пробирку споласкивают 5 мл воды и выливают ее в колбу, перемешивая содержимое в течение 5-10 мин. В полученном разведении делают подсчет количества спор в камере Горяева.

Количество спор в I г посевного материала должно быть не менее 10,0 миллиардов.

1.4 Стерильность процесса

Строго обязательным условием приготовления посевного материала является предохранение его от загрязнения посторонней микрофлорой поэтому всю работу необходимо осуществлять в стерильных условиях.

Воздух рабочих помещений должен быть практически стерильным, без пыли и микроорганизмов, особенно без плесеней, загрязняющих разливки Стерилизацию воздуха проводят с помощью ртутно-кварцевых или бактерицидных (ОБПе-450) ламп и пульверизацией растворов антисептиков, с последующим мытьем полов.

Стены, полы и все оборудование помещений обрабатывают 2%-ным раствором фенола, 5%-выы раствором перекиси водорода или другими дезинфицирующими средствами»

Чистоту воздуха перед работой проверяют высевом на чашках Петри с сусло-агаром и мясо-пептонным агаром в течение 10 мин.

Особое внимание следует обращать на приготовление и стерилизацию питательных сред.

Для культивирования, размножения и контроля посевного материала используют следующие среды.

Пивное сусло, крепкое ,из ячменного солода, 15-18% по сахару, разливают в стерильные колбы и стерилизуют в течение 20 мин под давлением в 1 атм. Для приготовления питательных сред сусло фильтруют через вагу и разбавляют водопроводной водой до 7% по сахару с добавлением 1-2% NaCl, 0,1% мочевины, 0,0001% Си304 и 1,5-3,0% агара.

Мясо-пептонный агар приготавливают из сухого препарата и стерилизуют под давлением в 1 атм в течение 30 мин. Также стерилизуют и остальные жидкие и твердые питательные среди.

Для проверки качества стерилизации среда выдерживают в термокамере не менее двух суток.

2. ПОВЕРХНОСТНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ НА ТВЕРДЫХ СРЕДАХ

В нашей стране и за рубежом в промышленном производстве ферментов поверхностный метод применяется довольно широко. В качестве продуцентов наиболее часто используются плесневые грибы рода Aspergillus. Для успешного биосинтеза ферментов наряду с активными продуцентами необходимы правильно подобранные состав питательной среды и определенные условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление ферментов.

Состав питательных сред имеет большое значение для биосинтеза ферментов. Среда должна содержать все необходимые для роста и развития культуры и образования фермента питательные элементы в наиболее подходящей форме и концентрации и в таком соотношении, чтобы благоприятные для биосинтеза условия были обеспечена на протяжении всего процесса культивирования. Кроме того, среда должна обеспечивать быстрый рост биомассы, а также длительное пребывание культуры в физиологически активном состоянии. Очень важно, чтобы среда содержала соединения, обеспечивающие и значительно повышающие синтез фермента, ибо индуцированный характер промышленно важных гидролитических ферментов не вызывает сомнений.

Основой поверхностного метода производства ферментов являются твердые субстраты, получаемые при промышленной переработке продуктов сельского хозяйства и отходы пищевых предприятий. Из числа этих субстратов наиболее широко применяются пшеничные отруби свекловичный жом, различные жмыхи, картофельная мезга. Часто в твердую питательную среду кроме -основного компоненте (обычно пшеничные отруби) вводят какой-либо естественный материал, содержащий индикатор соответствующего фермента, или улучшают структуру данной среды. Так, изучение влияния свекловичного жоме на биосинтез неполитических ферментов при культивировании Asp. awamori 16 на пшеничных отрубях показало, что при соотношении в среде пшеничных отрубей и свекловичного жоме 3;7 биосинтез достигает максимума.

Следует отметить, что с изменением соотношения основных компонентов среды изменяется структуре ферментного комплексе Asp. awanori 16 в сторону увеличения биосинтеза пектолитических ферментов и кислотоустойчивой протеазы, причем биосинтез эмилолитических ферментов подавляется.

На рост и развитие гриба и биосинтез ферментов большое влияние оказывает структура среды, ее рыхлость, так как степень аэрации твердых сред обусловливается размером поверхности среды, находящейся в контакте с воздухом. Рост и развитие гриба может происходить только на поверхности твердых частиц среды. При недостаточной рыхлости среды ухудшается ее аэрирование,что неблагоприятно сказывается как на рост гриба, так и на синтез ферментов.

В нашей стране при промышленном производстве ферментов методом поверхностного культивирования основой всех сред служат пшеничные отруби. 8а рубежом часто применяют среды, содержащие как пшеничные отруби, так и картофельную мезгу, солодовые ростки, плодово-ягодные выжимки.

2.1 Стерилизация твердых питательных сред

При производстве ферментов особое внимание уделяется стерилизации твердых сред, так как в их состав входят компоненты, плохо поддающиеся стерилизации (крахмал, масла, жиры), а также содержится множество микроорганизмов.

Известно несколько методов стерилизации твердых сред, среди которых в нестоящее время получила распространение тепловая стерилизация острым паром при температуре 104-140°С в стерилизаторах.Длительность стерилизации предопределяется физико химическими свойствами среды, обосемененностью микроорганизмами, объемом стерилизуемой массы и тем-пературой острого пара. Для улучшения эффекта стерилизации пользуются соляной, серной и молочной кислотами, вводя их в среду до необходимого рН, или 0,1-0,3% формалина к массе отрубей.

2.2 Оптимальные условия поверхностного культивирования микроорганизмов на твердых средах

Влажность воздуха:

Необходимым условием для роста продуцента и биосинтеза ферментов при поверхностном культивировании на твердых средах является влажность среды. При недостаточной степени влажности твердой среды усвоение грибом питательных веществ и рост его замедляется. Излишняя влажность уплотняет среду, ухудшает условия аэрирования культуры, рост замедляется и, следовательно, биохимическая активность ее снижается.

Практика ферментной промышленности показывает, что влажность твердой среды (отруби) в производственных условиях должна поддерживаться на уровне 58-60%, причем относительная влажность окружающего воздуха должна быть 98-100%. Если влажность твердой среды выше этого предела, особенно при выращивании культуры на открытых кюветах, создаются условия для возникновения бактериальной инфекции. Следует также отметить, что при пониженной влажности среды грибы проявляют тенденцию к спорообразованию в ущерб синтезу ферментов. Поэтому при выращивании спороносящей культуры для посевного материала влажность среды поддерживается в пределах 40-45%.

Влажность твердой среды и воздуха выбираются о учетом осмотических свойств продуцента.

Аэрация:

Рост микроорганизмов на поверхности твердых сред сопровождается потреблением молекулярного кислорода воздуха. Интенсивность аэрации зависит от стадии роста гриба, т.е. от физиологического состояния микроорганизма.

Установлено, что количество кислорода, необходимое для роста продуцента, может не совпадать с тем его количеством, которое требуется для других процессов метаболита. Например, при поверхностном культивирования плесневых грибов - продуцентов фермента - различают несколько стадий росте, ж потребность в кислороде на каждой из них отличается.

Поддержание оптимального воздушно-температурного режима в растильных камерах достигается регуляцией количества и температуры подаваемого воздуха в зависимости от стадии процесса культивирования.

На первой стадии, продолжительность которой при культивировании плесневых грибов обычно составляет 10-20 часов, происходит набухание конидий и образование первых ростков, при этом выделяется незначительное количество тепла. Поэтому не этой стадии воздух необходимо подавать более нагретым (на 2-3°С), чем на последующих стадиях, чтобы не допустить переохлаждения среды, на которой вырастает мицелий. Воздухообмен составляет 4-5 объемов воздуха на 1 объем камеры в час при относительной влажности 96-100%.

Вторую стадию характеризует интенсивное образование мицелия, которое сопровождается потреблением питательных веществ из среды, выделением тепла, углекислоты и воды. Основная причина повышения температуры (до 37-47°С) в слабой теплопроводности отрубей. Для обеспечения растущей культуры кислородом, отвода тепла и углекислого газа интенсивность аэрации увеличивают до 36-40 объемов воздуха на 1 объем камер в час. Температура подаваемого воздуха должна быть на 2-3°С ниже, чем вначале процесса. Относительная влажность поддерживается не уровне 100%, чтобы избежать подсыхания верхних слоев среды, и, следовательно, падения ферментативной активности.

На третьей стадии рост гриба завершается и наступает период интенсивного синтеза фермента. Тепловыделение культурой снижается, объем и температура подаваемого на аэрацию воздуха также снижается по сравнению о предыдущей стадией. Воздухообмен снижается в 3-5 paз, температура на 3-4°С. После окончания процесса культивирования среду 2-3 часа подсушивают сухим воздухом б целью облегчения дальнейшей обработки.

Необходимо отменить, что вопросы аэрации при поверхностном культивирования микроорганизмов решайся эмпирически» В настоящее время не существует единой теории но проблеме аэрации. Для установления фактической потребности микроорганизмов в кислороде очевидво, наиболее пригодным может оказаться балансовый метод составе газа до и после растильной камеры.

Температура:

Температура должна не только благоприятствовать росту продуцента, но и биосинтезу ферментов. Различные грибы способны расти и продуцировать ферменты лишь в определенных температурных пределах. Культивирование гриба при температуре ниже оптимальной может привести к снижению роста, выше оптимальной к инактивации фермента.

Обычно при поверхностном культивировании на твердых средах температура для каждой стадии процесса индивидуальна. Так, при культивировании гриба Asp.oryzae продуцента амилолитических ферментов - на первой стадии процесса, т.е. до появления первых ростков, температура поддерживается в пределах 30-32°С. На второй стадии вследствие интенсивного роста температура в среде может достичь 35-37°С, однако это не сказывается отрицательно не синтезе фермента.

При росте Tr. roseum продуцента гемицеллюлозных ферментов в первые сутки температура в камере устанавливается на уровне 23°С, затем повышается до 27-28°С во второй стадии про-цесса.

Продолжительность цикла:

Продолжительность культивирования зависит от свойств продуцента и среды, а также условий ведения процесса и устанавливается на основе- изучения динамики накопления ферментов и физиологического состояния продуцента.

В зависимости от условий культивирования большинство плесневых грибов образуют не один, а комплекс ферментов, причем существует определенная последовательность образования этого комплекса. Так, продолжительность выращивания Asp.awaaori обеспечивающая активный биосинтез неполитических ферментов, составляет 48-52 часа. При этом установлено, что биосинтез пектинастеразы заканчивается раньше, чем полигалактуроназы и достигает максимума к 42-44 часам культивирования. Оптимальная продолжительность выращивания продуцента эмилолитического комплекса культуры Asp.awamori составляет 30-32 часа.

Обычно увеличение продолжительности процесса приводит к снижению ферментативной активности культуры и способствуем спорообразованию, что отрицательно сказывается на условиях работы.

2.3 Технологические схемы поверхностного культивирования на твердых средах

Существует несколько вариантов оформления технологического процесса получения ферментов методом поверхностного культивирования натвердых средах.

Кюветный способ - наиболее старый. Для осуществления процесса культивирования в данном случае используют кюветы, которые располагаются на стеллажах в растильных камерах. Культивирование происходит на увлажненной питательной среде, которая тонким слоем (2,0-3,0см) расположена на кюветах. Этот, способ требует больших производственных площадей и применения ручного труда.

В последнее время в производстве ферментов используется способ культивирования, при котором рост культуры происходит не на горизонтальных кюветах, а в вертикальных слоях среды. Процесс осуществляется в растильной камере, которая представляет собой ящик размером 1600x1300x1620 мм, изготовленный из алюминиевого сплава. Внутри камеры расположены 23 вертикальных канала размером 125 00x1600x55 мм с перфорированными стенками, диаметр отверстий которых 3 мм, шаг 40 мм. Каналы предназначены для среды. Между каналами имеются щели шириной 12мм для циркуляции воздуха. Этот способ применяется для получения амилолитических ферментов, в частности в вашей стране амилоризина ПХ.

3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ НА ЖИДКИХ СРЕДАХ

Поверхностный способ культивирования на жидких питательных средах в промышленных условиях широко применяется для получения органических кислот, в частности лимонной и итаконовой, В процессе культивирования плесневый гриб-кислотообразователь развивается на поверхности питательного раствора.

Существенным недостатком поверхностного способа культивирования является необходимость больших производственных площадей. Кроме того, специфичность технологического оборудования затрудняет механизацию трудоемких работ и автоматизацию технологического процесса. Однако при сравнении технологии и экономики поверхностного и глубинного способов получения лимонной кислоты с индустриальной точки зрения предпочтительнее поверхностный способ, поскольку при его применении значительно ниже расход энергии и себестоимость продукта.

При бессменном методе наибольшая эффективность использования бродильных площадей достигается при высоте слоя бродильного раствора 12 см.Увеличение высоты слоя хотя и дает заметное повышение выхода о площади мицелия, однако при этом наблюдается снижение выхода углевода.

В результате изучения динамики кислотообразования доказано, что гриб сохраняет высокую активность продуцирования до самого конца цикла, поэтому можно продлить цикл ферментации, доливая или меняя питательный раствор.

Особенность односменного метода заключается в том, что после слива основного раствора пленку необходимо промыть стерильной водой и только после этого подливать новый питательный раствор. Наилучшие результаты достигаются при высоте слоя долив в наполовину меньше, чем высота слоя первоначального раствора.

Продлить цикл ферментации удобнее всего методом долина. Вновь приготовленный питательный раствор в количестве 30-35% начального объема следует доливать, когда содержание остаточного сахара составляет 3 4%. Длительность цикла ферментации увеличивается на 30%, что снижает объем работ по обработке камер, а следовательно, улучшается использование бродильной площади. Метод долива не дает резкого изменения состава среды под мицелием, а также концентрации сахара и кислоты» Активность кислотообразования в момент долива нового раствора не снижается, как это происходит при односменном способе.

Процессы роста гриба кислотообразования осуществляются в плоских кюветах, расположенных на стеллажах в бродильной камере. В зависимости от площади камеры в ней может быть размещено от 2 до 4 стеллажей. На каждом стеллаже располагается 8-10 кювет. С целью избежания различного рода затруднений рецептурного характера, а также для стандартизации аппаратуры и условий труда желательно, чтобы размеры камер и кювет были по возможности однотипными.

3.1 Влияние внешних условий культивирования

Характер обмена веществ любого плесневого гриба в большой мере зависит от внешних условий. Иногда изменения в обмене веществ бывают настолько значительными, что создается впечатление, будто происходят качественно различные процессы. Так, нередко наблюдается, что какой-либо штамм гриба не образует предусмотренного количества определенного продукта в известных условиях культивирования, а в измененных выделяет искомое вещество в ранее предусмотренных количествах.

При получении органических кислот поверхностным способом одним из важнейших факторов является воздушный режим в бродильных камерах, т.е. аэрация, температура и влажность. Воздух, поступающий в камеру, необходим для обеспечения культуры гриба кислородом, поддержания температурного режима, распыления конидий, удаления тепла и углекислого газа, выделяющихся в фазе роста и кислотообразования. Подаваемый воздух должен быть обработан в специальной установке для стерилизации, а сам процесс аэрации должен проходить с учетом физиологических особенностей каждого этапе вегетативного роста и обмена веществ гриба и процесса синтеза кислот.

В момент засева конидий температура ферментационного раствора должна быть 38-42°С. После засева ее постепенно понижают и процесс роста и развития мицелия (в течение 24-36 ч) идет яри 34-36°С, э период кислотообразования - при 28-34°С в растворе. Более низкие температуры в момент засева тормозят прорастание конидий и образование грибного мицелия» При более высоких температурах, наоборот, происходит обильное нарастание биомассы мицелия, слабо производящий кислоту» Кроме того, при повышенных температурах, особенно во время активного кислотообразования, наблюдается снижение выхода кислоты и нерациональное использование сахара.

Для поддержания заданных оптимальных температурных условий обычно исходят из температуры питательно-бродильного раствора, так как температура окружающего грибную пленку воздухе менее устойчива по сравнению с температурой раствора. Вода, как известно, входит в состав плазмы и клеточного сока и обеспечивает ход биохимических превращений в живой клетке. Влага необходима для прорастания спор. Дальнейший рост мицелия жизнедеятельность кислотообразующего гриба успешно протекает лишь при наличии обильного водообмена в клетке. Клетки мицелия в процессе нормальной жизнедеятельности пропускают через себя огромное количество воды. Испаряющаяся влага должна непрерывно восполнятся за счет воды, поступающей в клетку из питательного субстрата.

Мицелий плесневых грибов рода Aspergillus, плавающий на поверхности питательного раствора, развивает огромную сосущую силу и поэтому растет даже в условиях значительной сухости. Таким образом влажность окружающего воздуха является фактором, определяющим степень испарения влаги с поверхности грибной пленки. В настоящее время относительная влажность технологического воздуха, поступавшего в бродильные камеры, не лимитируется. Относительная влажность выходящего из камеры воздуха во время активного кислотообразования при соблюдении описанного выше режима воздухообмена составляет 70-85%. В этих условиях испарение в продолжении полного цикла ферментации составляет 40-60% ох начального объема раствора.

В процессе ферментации выделяется значительное количество тепла. При лимоннокислой брожении максимальное тепловыделение (120-130 ккал/м2.ч) происходит на 5-е сутки, когда и достигается самая высокая активность кислотообразования. В период выращивания мицелия выделяется 0,4-0,6 кквл тепла в перечете на 1 г сахарозы, а в период кислотообразования 1-1,5 ккал максимум интенсивности роста биомассы мице-лия достигается на 4-е сутки и составляет около 12 г/м2. или 0,1 г/л среды в час. Несвоевременное удаление тепла вызывает повышение температуры в ферментативном растворе. Часто в таких случаях температура повышается до 40°С и выше, что нарушает нормальный процесс кислотообразования и имеет следствием непродуктивное расходование сахара. В таких условиях ведения процесса наблюдается чрезмерный прирост биомассы гриба. Для удаления тепла из бродильных камер и снижения температуры в раствора в стадии активного брожения необходимо снизить температуру поступающего в камеры воздухе до25-28 С, что уменьшает прирост биомассы гриба в период активного брожения, а сахар полнее используется на кислотообразование.

При разработке рационального технологического режима и эффективного использования сахара в ходе биосинтеза необходимо учитывать такие тесно взаимосвязанные факторы физиологического характера, как высота слоя раствора среды и продолжительность ферментации. Важно при определенной высоте сдоя добиться настолько активного процесса ферментации, чтобы полученный сброженный раствор содержал максимум желаемого метаболите и минимальное содержание несброженного сахара.

3.2 Подбор питательных сред

Состав питательных сред при биосинтезе органических кислот оказывает непосредственное влияние на рост и развитие мицелия плесневого гриба, а также на процесс кислотообразования. Основная составная час» питательной среды - источник углеводов. При выборе сырья - источника сахара - необходимо руководствоваться следующим:

-при нормальном росте грибного мицелия получать максимальный выход кислоты;

-использовать экономически более выгодное сырье;

-получать качественные, т.е. легко перерабатываемые ферментативные растворы.

Биосинтез органических кислот поверхностным способом можно осуществлять на различных источниках углеводов, например, на мелассе (свекловичная, тростниковая), сахаре-сырце, глюкозе технической, гидролизатах древесины, патоке кукурузного и картофельного крахмала. Наиболее высокие выходы получены при использовании свекловичной мелассы, так например, при лимоннокислом брожении выход продукта составил 90-100%.

3.3 Минеральное питание и рН среды

Для нормального роста и высокой физиологической активности продуцент лимонной кислоты нуждается в углероде, кислороде и водороде, которые входят в состав углеводов, а также в наличии в питательном субстрате источников азота, фосфора, серы, калия, магния, кальция и микроэлементов. Оптимальные дозировки этих элементов зависят от физиологических особенностей применяемого штамма плесневого гриба и источника углерода.

Влияние микроэлементов на процесс биосинтеза изучено мало, за исключением железа и цинка.

Одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на биосинтез органических кислот, является реакция среды, которая может ускорять или тормозить действие тех или иных ферментов. При применении различных источников углеводов оптимальные значения рН среды для роста и развития, а также биосинтеза кислот у грибов Aspergillus niger и Aspergillus terreus находятся в интервале 2,1-7,5.

При использовании сахарозы для роста гриба и кислотообразования характерна низкая оптимальная величина рН. Так например, итаконовая кислота образуется лишь в сравнительно узких границах рН, причем эта величина имеет решающее значение: при рН ниже 1,9 образование мицелия сильно подавляется, что приводит к снижению выхода продукта; при повышении рН до 2,7-2,9 рост мицелия усиливается и достигает максимума, однако максимальное образование итаконовой кислоты происходит при рН 2,1-2,4.

Для установления оптимального рН питательной среды с кристаллической сахарозой предпочтение следует отдать азотной кислоте, поскольку она одновременно служит и источником азота для плесневого гриба.

Развитие гриба и процесс кислотообразования при применении в качестве сырья мелассы, обработанной ферроцианидом калия, в сильной степени зависит от начальной величины рН раствора» В большинстве случаев считается, что оптимальной для поверхностного культивирования является нейтральная или слабощелочная реакция мелассного раствора в интервале 7,0-7,5.

Сравнительно узкий интервал рН, благоприятный для роста грибе в мелассном растворе, объясняется наличием в этом растворе веществ, становящихся ядовитыми при подкислении. Это могут быть летучие кислоты и сульфиты, а при подщелачивании - азотсодержащие основания.

Сбраживание 15%-ного по сахару мелассы раствора с рН 7,0 поверхностным способом, несмотря на высокую буферность это, не оказывает неблагоприятного влияния на синтез кислот, так как под сформировавшейся пленкой мицелия в тонком слое раствора образуется кислая зона с низким включением рН, обеспечивающим в клетках синтез преимущественно желаемого продукта.

Для подкисления щелочных меласс до оптимальной величины рН в производстве лимонной кислоты обычно пользуются технической серной кислотой.

Установление оптимального рН среды необходимо сосчетать с оптимальной дозировкой ферроцианида калия. Поскольку тяжелые металлы, в частности железо, являются вредными в процессе сбраживания мелассы, то наибольшее распространение получила обработка ее ферроцианидом калия.

Характер процесса ферментации меняется с переходом от необ-работанного мелассного раствора к обработанному близким в оптимальному количеством ферроцианида калия. При увеличении доз ферроцианида выход кислоты сначала увеличивается, а после достижения максимума, соответствующего оптимальной дозе, надает, так как избыток ферроцианида свыше 10 мг мешает развитию гриба. Оптимальной дозе ферроцианида соответствует минимальное или близкое к минимальному содержание в ферментативном растворе свободного иона железа - 0,1-0,2 мг, а также минимальное содержание золы и железа в мицелии. Оптимальные дозировки ферроцианида калия колеблются в пределах 0,4-1,2 г на 1 л раствора.На осаждение железа из мелассных бродильных растворов расходуется 47-80% ферроцианида калия, причем честь его идет на осаждение других веществ, содержащихся в мелассе других катионов и незначительного количества бетаина.

Оптимальное кислотообразование во всех случаях происходит при избытке ферроцианида калия. Таким образом, ферроцианид калия не только удаляет вредные примесси воздействует на процесс кислотообразования.Дозировка ферроцианида калия выше оптимальной вызывает угнетение роста мицелия, падение активности кислотообразования и повышения содержания побочных кислот. Последнее может происходить как в результате чрезмерного обеднения питательной среды микроэлементами, так и в результате токсического действия на гриб высоких концентраций ферроцианида калия.

Обработка мелассы ферроцианидом калия влияет на рост гриба, активность кислотообразования и соотношение синтезируемых кислот. Специфичность ферроцианидной обработки заключается в том, что она оказывает влияние прежде всего на состав среды. При оптимальных дозировках ферроцианида калия в растворе всегда остаются микроэлементы в концентрациях, необходимых для обеспечения нормального роста, которые находятся в динамическом равновесии с компонентами мелассы.

Мицелий плесневых грибов, благодаря наличию активного фермента инвертазы, сам быстро инвертирует всю сахарозу в питательном растворе. Молодой мицелий выделяет в ферментативный раствор инвертазу, так что содержащаяся в нем сахароза оказывается вскоре полностью расщепленной и мицелий поглощает сахар в виде глюкозы я фруктозы.

Интенсивное расщепление сахарозы при поверхностном культивировании на 2-4-е сутки происходит потону, что в этому времени мицелий выделяет в среду большое количество инвертазы. На 4-е сутки концентрация ферменте в среде достигает максимуме и остается постоянной до окончания процесса ферментации.

В процессe ферментации, начиная о 3-х суток, происходит постепенное, довольно равномерное нарастание кислотности, которое продолжается до конца цикла.

Микробиологический характер поверхностного способа культивирования требует создания условий для предотвращения возможности инфицирования процесса посторонней микрофлорой. При ферментации углеводных растворов присутствие посторонней микрофлоры в каких-то количествах неизбежно. В этих условиях важно обеспечить минимальное развитие посторонних микроорганизмов.

Инфицирование производственных сред на многих заводах все еще является основной причиной нарушения нормального ведения технологического процесса. Источником заражения в производстве органических кислот может быть: сырье вода, используемая для приготовления питательных растворов и промывки оборудования; воздух, расходуемый для аэрации бродильных камер;оборудование и коммуникации, соприкасающиеся с ферментативными растворами и водой, поступающей на производство, а также обслуживающий персонал.

Производственные культуры рода Aspergillus могут подвергаться инвазии со стороны паразитарной плесени Penicillium purpurogenum и Penicillium ruguloaum.

Опасность инфекции плесенью Penicillium увеличивается при повышенной влажности воздуха. Воздухообмен в бродильных камерах в объеме 12-15 м3/м2-ч при подаче воздуха над кюветами оказывает одновременно решающее влияние и на загрязненность Penicillium. Бактериальные инфекции могут быть скрытыми или явными. Скрытые инфекции бактериального происхождения проявляются в запаздывании прорастания конидий производственной культуры, торможении стадий роста мицелия и в мелких изменениях его морфологии. Явные бактериальные инфекции обычно приводят к частичной или полной порче субстрата. В зависимости от характера инфекции образуются многочисленные побочные вещества - спирт, альдегиды, кетоны и кислоты.

Основными антагонистами гриба Aspergillus являются Bact. coli и Bact.fluoresces.Размножаясь в растворах, Bact. coli резко угнетет кислотообразование, а иногда и полностью подавляет жизнедеятельность гриба. Как известно, Bact. coli не термостойкая бактерия, легко погибающая при пастеризации. При кипячении растворов в течение часа Bact. coli погибает полностью. Термостойкие бактерии, остающиеся в растворах, могут размножаться в течение первых суток, но при образовании мицелия Aspergillus и при увеличении кислотности раствора быстро погибают.

Антагонистами гриб из группы Bact. coli готовые растворы инфицируются в основном из воды, используемой в производстве. Самыми благоприятными местами для размножения бактерий являются коммуникации, фланцы и другие места, где могут застаиваться разбавленные питательные растворы, а также водопроводные трубы, расположенные в обогреваемых помещениях. Обработка коммуникаций, отводов и кювет острым паром, 3-4%-ным раствором формалина и медного купороса не всегда приводит к полному обеспложиванию.Радикальной мерой борьбы с инфекцией является добавление в питательные растворы веществ химического и биологического происхождения.

Для устранения бактериального заражения приготовленных растворов можно применять следующие антибиотики: пенициллин, стрептомицин, биомицин, левомицетин, террамицин. Пенициллин и стрептомицин в таких больших дозах, как 20-40 тыс.ед./л среды, не действуют на размножение Bact. coli и не улучшают процесса кислотообразования. При добавлении в зараженные растворы биомицина в количестве 4 тыс.ед./л вред- ое действие антагониста Bact. coli устраняется почти полностью. Террамицин в дозе 4 тыс.ед./л и выше и левомицетина в дозе 2 тыс.ед./л и выше угнетают размножение Bact. coli полно-стью.

Все упомянутые антибиотики в дозах до 40 тыс.ед./л почти не влияют не активность кислотообразования грибов рода Aspergillus.

Добавление в питательные растворы некоторых химических веществ угнетает антагонистическое влияние бактерий на грибы. Однако, например,перекись водорода в дозе 0,09% вызывает снижение кислотообразования на 30%. Муравьиная кислота в концентрации 0,05% полностью угнетает рост Bact. ccrti. Дозы муравьиной кислоты, не снижающие кислотообразование гриба,зависят от качества мелассы, применяемой для ферментации.

Более эффективными и экономичными препаратами, чем антибиотики, являются химические соединения нитрофуранового ряда: фурацилин, фурадонин, фурагуанидин, фуразидин, фуразолидон, которые проявляют высокую антибактериальную активность. Оптимальные дозы, подавляющие размножение Bact. coli и не оказывающие влияния на жизнедеятельность гриба, следующие: фурацилин - 10-15 мг/л; фурадонин - 15-20; фурагуанидин 10-20; фуразидин -1-3, фуразолидон - 5-10 мг/л.

Наиболее распространенной и действенной операцией для стери-лизации приготовленных сред, оборудования и коммуникаций является тепловая и пароформалиновая обработка. При стерилизации одежды, лабораторного оборудования и коммуникаций хорошие результаты дает обработка паром.

В последнее время для стерилизации воздуха используется ультрафиолетовое облучение его ртутно-кварцевыми лампами. Микробиологические боксы и другие лабораторные помещения стерилизуются газоразрядными лампами. По-видимому, по мере совершенствования источников ультрафиолетового излучения этот вид стерилизации будет применяться все шире. Наиболее высокий эффект стерилизация с использованием комбинированного воздействия различных факторов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. - М.: Пищевая пром-сть, 1975. - 392

2. Журавский Г.И., Новоселова Л.В., Елисеев М.И. и др. Производство пищевых кислот. - М., 1953.

3. Калунянц К.А., Ездаков Н.В. Производство и применение ферментных препаратов в сельском хозяйстве,- М., 1972. - 143 о.

4. Калунянц К.А., Лосякова Л.С., Гребешова Р.Н. Производство пектолитических ферментных препаратов и их применение в производстве соков и виноделии. 1975.

5. Карклинь Р.Я., Гайле В.К. Способ приготовления посевного материала Aspergillus terreus - продуцента итаконовой кислоты. - В кн.: Микробиологические процессы и производства.

6. Карклинь Р.Я., Пробок А.К., Гайле В.К. Получение культур гриба Aspergillus terreus - продуцента итаконовой кислоты.-Изв. АН ЛатвСССР, 1966, ЖЗ (224), с.80-85.

7. Карклинь Р.Я,, Пробок А.К. Биосинтез органических кислот. Рига: Зинатне, 1972.

8. Карклинь Р.Я. Культивирование микроорганизмов- Рига 1983.

9. Котова В.В., Гошев В.Е. Производство и применение ферментных препаратов за рубежом. - М., 1973. - 86 с.

10.Кузнецов В.Д. Микроорганизмы продуценты антибиотиков. - В кв.: Производство антибиотиков.- М., 1970. - 361 с.

11.Лосякова Л.С., Рудевко Т.П. и др. Изучение уоловий биосинтезе пектолитических ферментов плесневых грибов Aspergillus foetidue. - Тр. ВНИИсинтезбелок, 1972, вып. I, 0.88-93.

12. Лука В.Т., Карклинь Р.Я., Пробок А.К., Зитола Г.А. Биосин-5.J8 итаконовой кислоты из двойного соединения глюкозы с хлористым натрием. В кн.: Культивирование микроорганизмов. - Рига: Зинатне, 1969, с.157-164,

13. Межиня Г.Р. Чашечный метод определения L-лизина. - Изв. АН ЛатвСССР, 1967, № I, с.80-83.

14. Мушникова Л.Н., Лосякова Л.С, Яровнеко В.Л. Образование пектолитических ферментов плесневым грибом Aspergillus awamori-16 при культивировании на твердых питательных средах. - Микробиологический синтез, 1968.

15. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.- М.: Мир, 1978. 331

16. Работнова И.Л. Проблема культивироввния микроорганизмов. Микробиология, 1977, т. 46, вып. 5, с. 796-810.

17. Рубен Е.Л., Ферменты микроорганизмов и их практическое ис-пользование. - M.S МГУ, 1976.

18. Тимаков В.Д. Некоторые методологические вопросы проблемы изменчивости и последовательности микроорганизмов. - Вестник АМН, 1959.

19. Фатееве М.В. Методы хранения коллекционных культур дрожжей. - В кв.: Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. - М.: Наука, 1967.