Методы отбора и подготовки живых организмов

10

Методы отбора и подготовки живых организмов

Первичный отбор.

Производится из всех форм живого вещества планеты. Микроорганизмы отбирают, например, из почвы, пресной и морской воды, воздуха, содержимого желудка и его слизистой оболочки, из горячих источников. Растения собирают на разных континентах планеты.

Внутри организмов находятся ткани, органы, клетки, органеллы, содержащие важные ферменты. Эволюция организмов приводит к тому, что вещества, ранее считавшиеся “пищевым тупиком", перерабатываются новыми видами живого.

Таблица 3. Некоторые примеры отбора биообъектов

Первичный отбор осуществляют или для новых объектов биотехнологии или при возобновлении биотехнологии получения известного БО.

В дальнейшем БО получают лабораторными или промышленными способами.

Культивирование.

Культивирование - это процесс искусственного размножения отобранных организмов (обычно микроорганизмов) для получения их необходимого количества или заданной концентрации. Для размножения в общем случае необходимы: химические вещества, стерилизация посуды, питательная среда, которую потребляют организмы, и техническое вспомогательное оборудование [24].

Стерилизация. Проводится для уничтожения посторонних микроорганизмов и их спор на стенках лабораторной посуды, а также при подготовке питательных сред.

Перед стерилизацией стеклянную посуду тщательно моют, затем высушивают, пробирки и колбы закрывают специально приготовленными ватными пробками, а чашки и пипетки завертывают в бумагу, чтобы после стерилизации они как можно дольше оставались стерильными.

Для достижения стерильности посторонние микроорганизмы, находящиеся в посуде, убивают либо нагреванием, либо прокаливанием в печи Пастера, либо кипячением в стерилизаторах с помощью химических стерилизующих средств. При кипячении к воде добавляют 1% соды, действие которой ускоряет разрушение микробов.

Для стерилизации паром под давлением используется автоклав. Температура автоклава 120 ? С губительна не только для клеток, но и для спор бактерий (п.2.2.6).

УФ-излучением обычно стерилизуют воздух помещения. При этом следует учесть, что недостаточное по мощности излучение может не убивать микроорганизмы, а вызывать мутации и способствовать размножению.

Для уменьшения расхода энергии и упрощения подготовки БО в последнее время применяется одноразовая посуда из пластика.

Питательные среды. Делятся на два типа: универсальные, на которых можно выращивать множество различных микроорганизмов, и дифференциально-диагностические, на которых растут только определенные виды организмов. Универсальные питательные среды должны обладать следующими свойствами:

содержать полный набор аминокислот (п.1.1.2) и макроэлементы (п.1.1.1);

иметь оптимальные кислотность и соленость.

При этом их свойства не должны меняться при оптимальной температуре выращивания организмов.

а) Бактериальные среды. К таким универсальным питательным средам относятся мясо-пептонный бульон (МПБ), агар (МПА) и ГРМ-бульон.

МПБ готовится по следующей рецептуре. Мясо очищают от жира, костей и сухожилий, разрезают на мелкие куски или пропускают через мясорубку. Фарш заливают водой (водопроводной, но лучше дистиллированной в соотношении 1: 2 и оставляют в прохладном месте на 12-24 ч. Затем смесь нагревают до кипения, мясо отжимают через плотную ткань, а жидкость фильтруют через вату и доливают до первоначального объема. В результате получается мясная вода, содержащая экстрактивные вещества из мяса, растворимые белковые вещества и соли. В нее добавляют 1% пептона, 0,5% поваренной соли и едкий натр (NaOH). Так как мясная вода имеет кислую реакцию, щелочь нужна для появления слабощелочной реакции. Все вещества доводят до растворения и кипятят 30 мин. МПБ должен быть соломенно-желтого цвета, прозрачным.

МПА создается путем добавки в МПБ желатинового вещества агар-агар. МПА удобен тем, что он не проливается, его легко дозировать для посева.

ГРМ-бульон является видом сухой стандартной среды промышленного производства, приготовление которой производят по определённой схеме путём разведения. Для ГРМ-бульона берут высушенный белок (п.2.4 3) полученный из МПБ. Способ приготовления: 20 г порошка размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 1-2 мин, процеживают через бумажный фильтр, разливают в пробирки.

Подготовленные бульоны перед использованием стерилизуют кипячением. В последнее время разработаны более упрощенные методики приготовления сред, но основные принципы остаются теми же.

б) Среды для простейших. Среды для инфузорий представляют собой различные виды отваров трав (наиболее распространен сенной отвар) или слабоминерализованную воду. Недаром “инфузории” с лат. означают “наливные", т.е. появляющиеся в зацветающей воде. Кормом для инфузорий могут быть бактерии, выращенные на пекарских дрожжах. Некоторые из простейших (инфузория-туфелька) хорошо растут при комнатной температуре (18...25 ? С). Поэтому получение таких инфузорий возможно в условиях неспециализированных лабораторий без сложных аппаратов для стерилизации, что облегчает разработку БСС с использованием инфузорий.

в) Среды для микроводорослей. Это минерализованная вода с необходимыми макро - и микроэлементами [63].

Посев организмов на среду. Посевы организмов на МПБ, МПА производят асептично (так, чтобы в питательную среду не попали из воздуха посторонние микроорганизмы).

Посевы производятся петлей из пассивного металла, например платины, непосредственно около зажжённой спиртовой горелки, в пламени которой обжигом стерилизуют петлю, концы пипетки, края пробирки как перед посевом, так и после него. Каплю жидкого бактериального материала петлей вводят в бульон и слегка размешивают в пробирке. После посева петлю обязательно прокаливают в пламени горелки.

Оборудование для культивирования

Промышленные культиваторы. Это аппараты, выполняющие следующие функции:

поддержание наиболее важных параметров среды;

подачу корма;

предотвращение зарастания культуры другими организмами;

обеспечение возможности стерилизации.

В состав культиваторов обычно входят: термостат, барботеры, перистальтические насосы, мешалки, система контроля за процессом.

Термостат представляет собой камеру, в которой поддерживается заданная температура. Барботер - это воздушный насос с краном для подачи воздуха в питательную среду с организмами. Он создает множество пузырьков, которые насыщают среду воздухом и одновременно перемешивают ее. Перистальтический насос основан на принципе перемещения жидкостей путем волнообразного сжатия стенок трубки. Подобное устройство обеспечивает стерильную подачу корма, растворов для регулирования кислотности, забор пробы выращенных организмов. Мешалка - устройство, перемешивающее среду с организмами, что необходимо для равномерного распределения питательных веществ и интенсификации процессов роста.

Система контроля включает измерительные преобразователи (датчики) кислотности, температуры, мутности среды, отражающей размножение организмов.

В целом культиватор представляет собой автоматизированное устройство, управляемое по программе с учетом показаний датчиков. Объемы культиваторов могут быть различны - от сотен литров до полулитра.

Культиватор для бактерий иногда называют ферментером.

Выращивание микроводорослей осуществляется под лампами дневного света или в автоматизитрованных устройствах - люминостатах.

Лабораторное оборудование. В небольших количествах бактерии часто культивируют на чашках Петри с плоским стеклянным дном и с крышкой, предотвращающей попадание посторонних бактерий из воздуха. Инфузории можно культивировать в лабораторных условиях в чашках Петри, а также в пробирках или колбах.

Идентификация организмов

Убедиться, что получен нужный вид микроорганизма, весьма непросто. Выращенная популяция (группа особей) микроорганизмов напоминает мутную взвесь в объеме питательной среды или плесень на ее поверхности.

Существует целая группа методов идентификации видов:

по форме колонии (учитываются цвет, форма, складчатость и др.);

по потреблению добавляемых субстратов (анализируют, потребляет ли организм типичные для него виды углеводов, белков);

по прорастанию на других средах (колонию пересевают на дифференциально-диагностические среды, на которых растут только известные виды);

по устойчивости к известным антибиотикам;

по окраске колонии стандартным методом, например по Граму (после окраски синим красителем и добавления затем этилового спирта грам-положительные бактерии сохраняют окраску, грам-отрицательные не сохраняют, что обусловлено разным составом их оболочек);

по форме микроорганизмов под микроскопом: кокки - круглые или гроздевидные организмы, палочки-бациллы, бациллы со спорами (п.2.2.6), вибрионы - изогнутые палочки, спирохеты или спириллы - спиралеобразные;

по характеру светорассеяния или поглощения излучения колониями (японскими учеными в начале 90-х гг. XX в. выявлена специфичность инфракрасных спектров многих бактерий);

по другим физическим свойствам.

Коллекции организмов

Выявленные диагностические признаки позволяют сделать вывод о культивировании необходимого штамма. Так называется чистая культура микроорганизмов одного вида, у которого изучены морфологические и физические особенности. Штаммам присваивается идентификационный номер, они поддерживаются в коллекциях.

Коллекциями называются системы долговременного поддержания лабораторно выращенных организмов. Коллекции поддерживают в крупных НИИ микробиологического профиля, на микробиологических производствах и на биологических факультетах университетов.

Обычно из них берут и хорошо изученные организмы в целях разработки БСС. При описании экспериментов с БСС всегда должен быть указан источник, откуда взяты организмы.

Модификация организмов

Живые белковые объекты весьма трудно хранить или фиксировать на поверхностях. Поэтому многие организмы, полученные в чистом виде, затем подвергают модификации (п.2.2.6) для перевода в новую более удобную жизнеспособную форму. Для этих целей разработана группа биотехнологических процессов.

Иммобилизация (обездвиживание). Это важнейший биотехнологический процесс, позволяющий защитить организмы от вымывания при воздействии жидкостей. Для иммобилизации микроорганизмов требуется или осадить их на поверхность, или встроить организмы внутрь каких-то малорастворимых веществ. Процедура должна быть технологичной, обеспечивать высокую адгезию (сцепление) и сохранять жизнеспособность организмов, доступ к ним субстратов и кислорода [22, 53].

Осаждение живых организмов чаще всего производят методом центрифугирования. В центрифугу под углом 30-40? закладываются закрытые пробирки, в которые заливается питательная среда с организмами, а на дно кладется пористый фильтр. Пробирки начинают вращаться с большой скоростью. В результате действия на вещество центробежных сил более плотные слои опускаются вниз, а менее плотные всплывают вверх. Мутная от бактерий или окрашенная в зеленый цвет от водорослей среда после центрифугирования становится прозрачной, а на фильтре образуется пленка из организмов.

В качестве физических веществ-носителей биообъектов часто используются желе, или иначе, гели (лат. “застывающие вещества”) биологического происхождения (агар, желатин, коллаген) или синтетические полимеры.

Микроорганизмы, включенные в гели, имеют меньшую чувствительность, чем осажденные на фильтровальных материалах, но для создания аналитических систем с высокой стабильностью и воспроизводимостью результатов предпочтение следует отдать методу включения в гели.

Лиофилизация. Это обезвоживание при низких температурах (от -40 до -60? С) и давлении, стимулирующих процессы испарения.

Лиофилизованные бактерии превращаются в порошкообразное вещество, которое затем можно хранить в обычном морозильнике. При добавлении порошка в питательный раствор жизнеспособность бактерий восстанавливается. Следует отметить, что не все виды живого могут быть подвергнуты лиофилизации. Необходимо подбирать режим изменения температуры и давления, чтобы внутри организмов не образовалось кристалликов льда, повреждающих живое.

В России применяются установки для лиофилизации типа “Иней".

Криоконсервация [15]. Ряд форм организмов, например сперматозоиды крупного рогатого скота, сохраняет свою жизнеспособность при помещении в жидкий азот и последующем размораживании.

Спорообразование. Бактерии рода Bacillus, Clostridium образуют эндоспоры, находящиеся внутри клетки (п.1.2.3). Это толстостенные долгоживущие образования, устойчивые к нагреванию и коротковолновому облучению. Споры бактерий можно держать в холодильнике или внутри порошков, например крахмала для B. subtilus. При внесении спор в питательную среду они прорастают и возобновляют процесс роста-размножения.

Инцистирование. Некоторые инфузории (например C. shteini) при неблагоприятных условиях укрываются в оболочках - цистах [8]. Для стимуляции инцистирования инфузории после выращивания подвергают охлаждению, а затем образовавшиеся цисты собирают и прикрепляют на носитель (например картон), на котором их можно хранить годами при комнатной температуре. При внесении цист в питательную среду из них появляются инфузории.

Понятие о генной инженерии

Принцип генной инженерии. Генетическая инженерия предназначена для получения вида организма с заданными свойствами, кодируемыми участками ДНК. Эти методы позволяют, например, “встроить" в бактерию ген, обусловливающий ее свечение, создать ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов. Достижения генной инженерии связаны с изучением механизмов синтеза белка и передачи наследственной информации у бактерий E. coli.

Общие представления о передаче наследственной информации были приведены в п.1.2.3 Основной механизм генетической инженерии осуществляется с помощью ферментов, катализирующих трансформацию ДНК. Он включает [12] следующие этапы:

1) в цитоплазме синтезируется матричная РНК (носитель информации о строении белков);

2) с помощью фермента (обратной транскриптазы) из мРНК в ядре клетки образуется чужеродная ДНК, которая несет информацию о синтезе нового белка. К концам этой ДНК могут прикрепляться нуклеотиды;

3) ДНК вируса или фрагмент ДНК (плазмида) (п.1.2.3) “разрезается” ферментом рестриктазой и к ее концам прикрепляется чужеродная ДНК, которая закрепляется другим ферментом ДНК-лигазой;

4) вирус с чужеродной ДНК, попадая из среды в клетки бактерий, вызывает копирование своей ДНК с новым геном уже самими клетками бактерий.

Плазмида с чужеродной ДНК попадает из среды в цитоплазму бактерии и становится носителем новой генетической информации. За счет обмена участками с ДНК бактерий клетка получает новый ген, который встраивается в ее ДНК. Организм с новыми свойствами можно выращивать в ферментерах.

Существует предел получения массы белков обычными бактериями, которые гибнут после достижения определенного числа поколений. Этого предела числа поколений от одной клетки нет у раковых клеток. Скрещивая с ними организмы с новыми ДНК, можно получить неограниченную массу новых белков.

Синтез белка используют для получения нужных ферментов или для передачи клеткам бактерии гена выработки этих ферментов.