Анализ микрофлоры почвы

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Литературный обзор

1 Микрофлора почвы

1.1 Факторы, влияющие на качественный и количественный состав микроорганизмов почвы

1.2 Физиологические группы микроорганизмов

1.3 Процессы самоочищения в почве

2 Санитарная характеристика почв

3 Отбор проб и предварительная обработка почвенных образцов для анализа

3.1 Отбор образцов почвы

4 Определение в почве бактерий

Результаты и обсуждение

ВВЕДЕНИЕ

Почва -- это смесь частиц органических и неорганических веществ, воды и воздуха.

Неорганические частицы почвы -- это минеральные вещества, окруженные пленкой коллоидных веществ органической или неорганической природы.

Органические частицы почвы -- остатки растительных и животных организмов, т.е. гумус. Почва обильно заселена микроорганизмами, так как в ней есть все необходимое для жизни: органические вещества, влага, защита от солнечных лучей.

В почве встречаются все формы микроорганизмов, которые есть на Земле: бактерии, вирусы, актиномицеты, дрожжи, грибы, простейшие, растения.

Общее микробное число в 1 г почве может достигать 1-- 5 млрд. В 1 га почвы содержится 1 тонна живого веса бактерий, однако в разных слоях количество микроорганизмов неодинаково. В самом верхнем слое почвы микроорганизмов очень мало (слой « 0,5 см). На глубине 1--2--5 см до 30-- 40 см число микроорганизмов больше всего. В этом слое ОМЧ в среднем 10--50 млн в 1 г. В относительно чистых почвах этот показатель равен 1,5--2 млн в 1 г. Глубже 30-- 40 см число микроорганизмов снижается и в более глубоких слоях их опять мало.

1 МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ

1.1 Факторы, влияющие на качественный и количественный состав микроорганизмов почвы

На численность и вещевой состав микроорганизмов влияют следующие факторы:

1. Тип почвы (тундровая, подзолистая, черноземная, сероземная).

Наиболее богаты микроорганизмами черноземные почвы, в которых до 10% органических веществ от сухого веса почвы.

В 1 г черноземной почвы более 3,5 млн микробных клеток. На микробный пейзаж в таких почвах влияет обильная растительность с богатой корневой системой. Корни выделяют в почву белковые и азотистые вещества, минеральные соли, органические кислоты, витамины. В результате этого вокруг корней создаются ризосферы, т. е. скопления микроорганизмов.

Микроорганизмы, в свою очередь, влияют на биохимические процессы в почве, на плодородие. Истощенные, гористые и песчаные почвы бедны микроорганизмами. В таких почвах органических веществ 1% от сухого веса почвы.

2. Влажность почвы.

Во влажных почвах микроорганизмы размножаются лучше, чем в сухих, но в почвах торфяных болот, несмотря на большое количество влаги и органических веществ (до 50%), микроорганизмов мало, так как эти почвы имеют кислую реакцию и в них проявляется антагонистическое влияние мхов.

3. Аэрация.

Почвы, богатые влагой, плохо аэрируются. В этих условиях преобладают анаэробы, а песчаные почвы аэрируются лучше, поэтому в них больше аэробов.

4. Температура почвы.

В теплые периоды года микроорганизмов во много раз больше, чем зимой. Зимой развитие микроорганизмов прекращается, и они погибают. Наблюдаются суточные колебания количества микроорганизмов в почве. Наиболее благоприятная температура 20--30°С, а при температуре 10°С и ниже развитие замедляется.

5. Адсорбционная способность почв.

Наибольшая адсорбирующая способность почв наблюдается у горноземных (гумусовых), она зависит от содержания в почве илистых частиц, количества средней и мелкой пыли, рН почвы. Эти почвы богаты кальцием. Характер почв влияет и на глубину проникновения микроорганизмов.

В более влажных северных почвах жизнь микроорганизмов как бы «прижата» к поверхности, а в легких, щелочных южных почвах -- жизнь микроорганизмов «углубляется». Они могут быть обнаружены на глубине 10 м и более.

1.2 Физиологические группы микроорганизмов

В составе микрофлоры почвы принято выделять так называемые физиологические группы микроорганизмов, которые участвуют в различных процессах и на разных этапах постепенного разложения органических веществ.

Бактерии-аммонификаторы, являющиеся гнилостными микроорганизмами, вызывают гниение остатков растений, трупов животных, разложение мочевины. В процессе гниения участвуют аэробные бактерии-B. Subtilis, B. Mesentericus, бактерии рода Proteus, грибы рода Aspergillus, Mucor и др.

Нитрифицирующие бактерии, которые обладают автотрофными свойствами и исключительной специфичностью. При их деятельности азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты.

Азотфиксирующие бактерии, которые обладают исключительной способностью усваивать из воздуха атмосферный азот и в процессе жизнедеятельности образуют из молекулярного азота белки и другие органические соединения азота, которые используются растениями.

Бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды брожений, наблюдаемые при разложении микробами органических соединений углерода (молочно-кислое, спиртовое, масляно0кислое, уксусное, пропионовое).

Бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов- серобактерии, железобактерии, разнообразные виды которых осуществляют окисление и восстановление этих соединений в природе.

С выделениями человека и животных, с различными хозяйственно-бытовыми и промышленными отходами в почву поступает большое количество разнообразных микроорганизмов. Преобладающе флорой являются анаэробы до 96% всех видов: бифидобактерии, лактобактерии, пептококки, бактероиды; в меньшем количестве встречаются эшерихии, энтерококки, протей, клостридии и другие микроорганизмы.

Попадая в почву, представители нормальной микрофлоры тела человека и животных, а также и патогенные микроорганизмы, как правило, длительно не выживают и рано или поздно погибают. Одноко многие представители нормальной флоры человека вступают в биоценоз почвы, участвуют в ее биохимических процессах, а отдельные виды бактерий остаются постоянными обитателями почвы. На сроки выживания патогенных бактерий в почве оказывают влияние многие факторы: состав и тип почвы, температура, влажность, воздействие атмосферных осадков.

К первой группе патогенных микроорганизмов. Постоянно обитающих в почве, относится небольшое количество микроорганизмов. Среди особое внимание заслуживают клостридии ботулизма, которые попадают в почву с испражнениями человека и животных, образуя споры, остаются в ней неопределенно долго.

Вторая группа включает спорообразующие патогенные микроорганизмы (бациллы сибирской язвы, клостридии столбняка, газовой гангрены), которые попадают в почву с фекалиями человека и животных, а также с трупами погибших животных. Почва для них является вторичным резервуаром, поскольку при благоприятных условиях клостридии могут размножаться и сохраняться в виде спор длительное время.

В третью группу включены патогенные микроорганизмы, попадающие в почву с выделениями человека и животных и сохраняющиеся в течение нескольких недель и месяцев. Все эти микроорганизмы- сальмонеллы, шигеллы, вибрионы, бруцеллы, лептоспиры и др. не образуют спор и поэтому быстро гибнут в результате воздействия различных физических и биологических факторов. Особенное влияние на выживание патогенных микроорганизмов оказывают антагонистические свойства представителей микрофлоры почвы. Именно на этом свойстве микрофлоры основаны работы, направленные на повышение антибиотических свойств почвы. Простое озеленение травами территорий населенных мест, способствующее размножению бактерий-актиномицетов, улучшает антибактериальные свойства и повышает активность самоочищения почвы.

Таким образом, естественные процессы, протекающие в почве под влиянием ее микрофлоры, обусловливают самоочищение почвы от попавших в нее микроорганизмов, обезвреживание и уничтожение нечистот. При правильном управлении этими процессами опасность передачи инфекционных болезней через почву может быть сведена к минимуму.

Основная масса патогенной микрофлоры в почве постепенно отмирает, однако длительность переживания патогенной микрофлоры зависит от следующих факторов:

* свойств микроба;

* типа почв;

* температуры и влажности почв;

* микробов биоцинеозов;

* бактериофагов;

* антагонистов-сапрофитов;

* микроорганизмов, продуцирующих антибиотики; от токсикоза почв.

В почвах периодически появляются токсические вещества, их природа не совсем изучена, но предполагается, что это метаболиты некоторых микроорганизмов. Токсические вещества почвы губительно действуют на микроорганизмы почвы, в том числе и на полезную микрофлору.

Дизентерийная палочка при 18°С выживает в различных типах почв от 3 до 65 дней, S. typhi и paratyphi -- 19--101 день.

Споровая микрофлора сохраняется дольше, даже годами и, напротив, холерные вибрионы, палочки чумы, бруцеллеза, вирусы полиомиелита -- от нескольких часов до нескольких месяцев.

1.3 Процессы самоочищения в почве

При попадании в почву органических веществ сразу же повышается общее микробное число (ОМЧ), а также общее число сапрофитов (ОЧС). Обычно в грязных почвах ОМЧ ОЧС, а в чистых ОМЧ = ОЧС или ОЧС ОМЧ. Сначала размножаются гетеротрофы, обладающие очень высокой ферментативной активностью и представленные семейством кишечных, псевдомонад, аэромонад, аэромобактерий и др. В этот период в почве много фекальных бактерий (бактерий группы кишечной палочки -- БГКП, энтерококки, Cl. perfringens), много протеолитов, разлагающих белки, пептоны, желатина, много аммонификаторов, т. е. микробов, расщепляющих белки до NH3.

В процессе самоочищения почвы все время меняется состав микрофлоры. По мере повышения кислотности в почве появляются ацидофильные микроорганизмы: молочнокислые бактерии, дрожжи, грибы, плесени, актиномицеты.

По мере накопления аммиака в почве начинают размножаться нитрификаторы, т. е. микроорганизмы, окисляющие МН3 до нитритов и нитратов. Эти микроорганизмы завершают цикл превращений органических веществ в неорганические.

За окисление NH3 до HNO2 ответственны нитрозобактерии (Nitrozomonas, Nitrosaspira), а за окисление HNO2 в HNO3 -- нитробактерии.

Одновременно с процессами нитрификации идут процессы денитрификации, т.е. восстановление нитратов в нитриты, а далее в газообразный азот. На этом этапе ОМЧ почвы становится низким. Видовой состав и численность микрофлоры стабилизируется. Активные вегетативные формы спорообразующих бактерий и грибов уступают покоящимся спорам бацилл, актиномицетам, грибам.

В чистых почвах всегда доминируют покоящиеся споры. Спорообразование всегда говорит о законченных процессах минерализации почвы.

Сочетание ОМЧ и нитрификаторов используют для распознавания и отличия чистых почв от почв, бывших загрязненными, но находящихся на стадии минерализации. Для них характерно низкое ОМЧ, но высокое число нитрификаторов.

То же самое можно сказать и при сопоставлении общего числа сапрофитов и процентов споровых аэробов. Если процент споровых форм к ОЧС высок (40--60%), то это характерно для чистых почв, если же низок (25%), то почва загрязнена. Если к вышеперечисленным показателям добавить еще определение БГКП, Cl. perfringens, термофилы, то для самого свежего загрязнения характерна большая обсемененность почвы БГКП, Cl. perfringens, термофилами и отсутствие нитрификаторов.

Чуть позже, когда начинаются процессы самоочищения, наряду с кишечными бактериями начинает нарастать количество нитрификаторов.

В процессе самоочищения почвы происходят изменения в показателях: наиболее быстро отмирает кишечная палочка. Обнаружено, что в сильно загрязненной почве титр БГКП увеличивается за 4,5 месяца с 10"5'-6 до ЮЛ или 1 г, титры Cl. perfringens и нитрификаторов были еще низкими. Такое соотношение показателей говорит об очищении почвы только от кишечных палочек и патогенных бактерий семейства кишечных и об интенсивных процессах самоочищения.

Через 9--11 месяцев в супесчаных почвах ОМЧ уменьшается от нескольких миллионов до нескольких тысяч микробных клеток в 1 г. Титры нитрификсаторов резко увеличивались. Высокие титры всех показателей говорят о законченных процессах самоочищения.

2 САНИТАРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВ

Почва -- одна из главных составляющих природной среды, которая благодаря своим свойствам (плодородие, самоочищающая способность и др.) обеспечивает человеку питание, работу, здоровую среду обитания. Нарушение этих процессов, вызванное загрязнением, может оказать неблагоприятное влияние на здоровье людей и животных. Наблюдается распространение инфекционных и инвазионных заболеваний, ухудшение качества продуктов питания, воды, водоисточников, атмосферного воздуха. Это понимание почвы, как одного из главных компонентов окружающей среды, от которого зависят условия жизни и здоровья населения, требует большого внимания к ее санитарной охране.

Санитарное состояние почвы -- совокупность физико-химических и биологических свойств почвы, определяющих качество и степень ее безопасности в эпидемическом и гигиеническом отношениях.

Опасность загрязнения почв определяется уровнем ее возможного отрицательного влияния на контактирующие среды (вода, воздух), пищевые продукты и прямо или опосредованно на человека, а также на биологическую активность почвы и процессы самоочищения.

Санитарная характеристика почв населенньгх мест основывается на лабораторных санитарно-химических, санитар-но-бактериологических, санитарно-гельминтологических, са-нитарно-энтомологических показателях.

По эпидемическим показаниям можно проводить индикацию и выделение из почвы патогенных микроорганизмов, в распространении которых почва играет важную роль.

Результаты обследования почв учитывают при определении и прогнозе степени их опасности для здоровья и условий проживания населения в населенных пунктах, разработке мероприятий по их рекультивации, профилактике инфекционной и неинфекционной заболеваемости, схем районной планировки, технических решений по реабилитации и охране водосборных территорий, при решении очередности санационных мероприятий в рамках комплексных природоохранных программ и оценке эффективности реабилитационных и санитарно-экологических мероприятий и текущего санитарного контроля за объектами, косвенно воздействующими на окружающую среду населенного пункта.

Оценка санитарного состояния почвы по микробиологическим показателям

Оценка санитарного состояния почвы проводится по результатам анализов почв на объектах повышенного риска (детские сады, игровые площадки, зоны санитарной охраны и т. п.) и в санитарно-защитных зонах по санитарно-бактериологическим показателям:

1) косвенным, которые характеризуют интенсивность биологической нагрузки на почву. Это -- санитарно-показательные организмы группы кишечной палочки (БРКП, коли-индекс) и фекальные стрептококки (индекс энтерококков). В крупных городах с высокой плотностью населения биологическая нагрузка на почву очень велика, и как следствие, высоки индексы санитарно-показательных организмов.

2) прямым санитарно-бактериологическим показателям эпидемической опасности почвы -- обнаружение возбудителей кишечных инфекций (возбудители кишечных инфекций, патогенные энтеробактерии, энтеровирусы);

3) почву оценивают как чистую без ограничений по санитарно-бактериологическим показателям при отсутствии патогенных бактерий и индексе санитарно-показательных микроорганизмов до 10 клеток на 1 г почвы.

О возможности загрязнения почвы сальмонеллами свидетельствует индекс санитарно-показательных организмов (БГКП и энтерококков) 10 и более клеток в 1 г почвы.

Наличие кишечной палочки в титрах 0,9 и ниже свидетельствует о несомненном фекальном загрязнении почвы, притом свежем. Одновременно могут быть зарегистрированы низкие титры Cl. perfringens, нитрификаторов. Однако следует иметь в виду, что в первое время после имевшего места органического загрязнения, нитрификаторов может быть мало -- необходимо время, чтобы они успели размножиться.

В процессе самоочищения на разных этапах возникают различные количественные соотношения этих показателей. Наиболее быстро отмирает кишечная палочка, поэтому при сравнительно высоких ее титрах титры Cl. perfringens и нитрифицирующих бактерий низкие. Это показывает, что в почве интенсивно протекают процессы самоочищения как от патогенных микроорганизмов, так и от органического загрязнения.

Высокий титр (1,0 и выше) кишечной палочки при низких титрах остальных 3 показателей характеризует почву как свободную от возбудителей кишечных инфекций, но в которой еще не закончились процессы распада и минерализации органических веществ.

Высокие титры всех показателей свидетельствуют о законченных процессах самоочищения и характеризуют почву как чистую, свободную от патогенных энтеробактерии и органических загрязнений.

3 ОТБОР ПРОБ И ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ОБРАБОТКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

Санитарное обследование, выбор точек отбора проб

Основными объектами, территории которых подлежат контролю органов санитарного надзора с применением санитарно-микробиологических методов исследования, требующими проведения ряда мероприятий по предотвращению загрязнения почвы, являются: детские и лечебно-профилактические учреждения; сельские и неканализованные районы городских населенных пунктов; территории первого пояса зоны санитарной охраны источников хозяйственно-питьевого водоснабжения; зоны свалок; отвальные площадки; сельскохозяйственные поля, орошаемые водой из открытых водоемов, стоками животноводческих ферм; земледельческие поля орошения городскими и промышленными сточными водами.

Обязательным предварительным этапом при санитарно-бактериологическом исследовании является санитарное обследование и составление паспорта обследуемого участка с сопроводительным талоном.

Паспорт обследуемого участка:

1. Номер участка.

2. Адрес участка и его привязка к источнику загрязнения.

3. Дата обследования.

4. Размер участка.

5. Название почв.

6. Рельеф.

7. Уровень залегания грунтовых вод.

8. Растительный покров территории.

9. Характеристика источника загрязнения (характер производства, используемое сырье, мощность производства, объем газопылевых выбросов, жидких и твердых отходов, удаление от жилых зданий, игровых площадок, мест водозабора и т. д.).

10. Характер использования участка (детская площадка, предприятие и т. д.).

11. Сведения об использовании участка в предыдущие годы (мелиорация, применение средств химизации и др.). Исполнитель, должность. Личная подпись. Расшифровка подписи

На основании результатов санитарного обследования территории и ее описания составляется схематический план земельного участка с нанесением источников загрязнения. Это позволяет правильно обосновать выбор точек отбора проб почвы.

На изучаемой территории при наличии одного источника загрязнения выделяют два участка 25 м2 каждый: один вблизи источника загрязнения (опытный), другой -- вдали (контрольный). Контрольный выбирают с таким расчетом, чтобы он был заведомо незагрязненным и имел одинаковый почвенный состав с опытным.

3.1 Отбор образцов почвы

Пробы почвы отбираются на каждом из участков в его пяти точках по диагонали или по «конверту» (четыре точки по углам и одна в центре).

Если исследователя интересуют последствия непосредственного внесения химического вещества в почву, то пробы отбираются поверхностно (0--1 см) стерильным инструментом (нож, шпатель) в количестве 0,3--0,5 кг в одной точке.

Если изучается воздействие химического вещества на микрофлору почвенного горизонта, то для отбора проб почвы пользуются следующей методикой. Каждая точка, в которой проводится отбор проб почвы, представляет собой центр выбранного для исследования 1 м2 территории. Здесь выкапывается шурф размером 0,3 х 0,3 м и глубиной 0,2 м. Поверхность одной из стенок шурфа очищают стерильным ножом. Затем из этой стенки вырезают почвенный образец, размер которого обусловлен заданной навеской. Так, если необходимо отобрать 200 г почвы, размер образца 20 см х 3 см х 3 см; 500 г -- 20 см х 5 см х 30 см.

Для приготовления среднего образца объемом 0,5 кг почву всех образцов одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределяют на месте ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву делят на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбрасывают, а оставшуюся вновь перемешивают, опять распределяют тонким слоем и делят диагоналями и так до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг.

Перед посевом почву диспергируют, т.е. почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просевании сито сверху покрывают стерильной бумагой.

Для учета почвенных микроорганизмов и энтеровирусов достаточно навески от 1 до 10 г, для санитарно-показательных микроорганизмов от 1 до 30 г, для патогенных энтеро-бактерий (50--50,5 г). Первое разведение навески почвы (1 : 10) делают в стерильной посуде, добавляя стерильную водопроводную воду в соотношении 1 : 10 к весу почвы (например: 1 г воды, 10 г почвы -- в 100 мл воды и т. п.).

Далее проводят предварительную обработку почвы, целью которой является извлечение клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов.

Основными приемами предварительной обработки почвы являются:

1) 10-минутное вертикальное встряхивание почвенной суспензии первого разведения в пробирках с резиновыми пробками -- при навеске почвы 1 г;

2) 3-минутная обработка почвенной суспензии на механической мешалке.

Почвенную суспензию, содержащую в 1 мл 0,1 г почвы, через 30 секунд после предварительной обработки (за это время оседают грубые минеральные частицы) используют для приготовления последовательно убывающих концентраций почвы. Для этого из первого разведения, находящегося во флаконе, с содержанием почвы 0,1 гмл стерильной пипеткой отбирают 1 мл и переносят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды. При этом получают второе разведение, содержащее 0,01 гмл почвы. Повторяя эту операцию, доводят разведение почвы до 0,0001--0,00001 гмл.

Приготовленные разведения используются для посева на различные питательные среды с целью определения микробиологических показателей.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы

К методам определения микробиологических показателей, характеризующих фекальное загрязнение почвы, относятся следующие:

1. Определение количества бактерий группы кишечных палочек, энтерококков, энтеровирусов.

2. Определение кишечных палочек в почве титрационным методом.

3. Определение кишечных палочек в почве методом мембранных фильтров.

4. Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве.

5. Определение в почве общего количества бактерий,

6. Определение Clostridium perfringens в почве.

7. Определение термофильных бактерий.

8. Определение в почве нитрифицирующих бактерий.

4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ПОЧВЕ БАКТЕРИЙ

Из первого разведения почвенной суспензии (1 : 10) берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред (Кес-слера или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида ТТХ). Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 гит. д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред.

Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон-- по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ с трифенилформазаном, выпадающим в виде осадка и придающим среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится.

Посевы на среде Кесслера выращивают 48 часов при 43 °С или 37°С. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился.

При наличии в сосудах со средой Кесслера газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный ответ.

При наличии на поверхности среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью, их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2--3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4--5 и 18 часов инкубации при 37°С. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Результаты анализа выражают коли-титром.

Определение в почве общего количества бактерий

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, присущих на мясопептонном агаре при 37°С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5% мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы для посева должно быть использовано не менее двух различных разведений. Берут 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки. Из каждого разведения посев производят минимум на 2 параллельные чашки. После в каждую чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15--20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

После инкубации подсчитывают выросшие колонии.

Определение в почве общего количества бактерий

Для характеристики в почве общего микробного загрязнения фекального происхождения используют определение численности микроорганизмов, преимущественно бактерий, растущих на мясопептонном агаре при 37 °С. При этом производят посев почвенных разведений в 1,5 % мясопептонный агар. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведений. После тщательного перемешивания берут по 1 мл суспензии и переносят на дно двух стерильных чашек Петри. В каждую чашку вливают питательный агар в количестве 15--20 мл расплавленного и остуженного до 45°С. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После инкубации при температуре 37 °С 24 часа подсчитывают выросшие колонии.

Определение клостридиум перфрингенс в почве

Из всех приготовленных почвенных разведений (до 1 : 1000 000) по 1 мл переносится в два параллельных ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают при температуре 80°С в течение 15 минут или при 90°С -- 10 минут. Затем во все пробирки наливают по 9--10 мл среды Вильсон--Блер. Инкубация посевов производится при 37° С в течение 24 часов.

Cl. perfringens образуют колонии черного цвета, в мазках -- грамположительные палочки.

Определение в почве нитрифицирующих бактерий

Нитрифицирующие бактерии завершают цикл превращения в почве азотсодержащих соединений, окисляя аммиак до нитритов и нитратов. Поэтому численность этих микроорганизмов довольно четко указывает на степень органического загрязнения, скорости и окончания распада органики в почве.

Определение нитрификаторов можно производить посевом разведений почвенной суспензии на плотных или жидких средах. Чаще всего для этих целей применяется среда Виноградского. Для этого производят посев почвенных разведений во флаконы со средой, разлитой тонким слоем. В опыт рекомендуется включать два незараженных флакона со средой, служащей контролем на чистоту среды. Посевы инкубируют при 28°С в течение 14--15 суток.

При развитии нитрифицирующих бактерий в среде постепенно образуются азотистая и азотная кислоты. Образование окисных соединений азота рекомендуется проверять на 5--7-й день после посева и вторично на 14--15-й день. Титр нитрифицирующих бактерий чаще всего устанавливают с помощью качественной пробы с дифенилаланином; в присутствии азотистой и азотной кислот этот реактив дает синее окрашивание. Для этого пипеткой несколько капель среды из каждого флакона, не взмучивая осадок, переносятся на стеклянную пластинку. Затем добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Появление синего окрашивания указывает на присутствие в среде нитратов, как результат размножения нитрифицирующих бактерий. Среда контрольных флаконов не должна давать изменения окраски.

Почву всех образцов одного участка высыпали на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивали стерильным шпателем, убрали камни и прочие твердые предметы. Затем почву распределили на месте ровным тонким слоем в форме квадрата.

Диагоналями почву разделили на 4 треугольника. Почву из двух противоположных треугольников отбросили, а оставшуюся вновь перемешали. Перед посевом почву диспергировали, т.е. почву с соблюдением условий стерильности просеивают через сито диаметром 3 мм. При просеивании сито сверху покрывают стерильной бумагой.

Сделали навеску 1г почвы и разбавили в дистиллированной воде соотношением 1 : 4. Тщательно перемешали на механической мешалке более 30 мин. Для определения кишечных палочек в почве взяли 1 мл суспензии и перенесли на дно стерильной чашки. После чашку вливают предварительно расплавленный и остуженный до 45 °С питательный агар в количестве 15--20 мл. Чашки Петри с расплавленным агаром хорошо перемешивают с имеющейся там почвенной суспензией. Затем чашки помещают на строго горизонтальную поверхность до затвердевания среды.

После застывания агара чашки с посевом в перевернутом виде помещают в термостат при 37°С на 24 часа.

Для микроскопирования приготовили 3 мазка. Мазки зафиксировали на предметных стеклах и окрасили, используя раствор бриллиантового зеленого. Готовый мазок микроскопировали.

Рис. 1 - Мазок №1 Рис. 2 - Мазок №2

Рис.3 - Мазок №3

Во всех мазках обнаружены кишечные палочки.

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. http://www.medbookaide.ru/books/fold9001/book2046/content.php Прозоркина H.В., Рубашкина П.А. - Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии.

2. http://www.pchelkam.ru/page/mikroflora-biosferi/mikroflora-pochvi-i-rasteniy.html

3. http://microby.ru/bakterii/ Теория микробиологии