Методы исследования клеток
Традиционные методы клеточной биофизики. Методы электронной микроскопии и флуоресцентных зондов для регистрации изменений многих клеточных процессов. Восстановленная флуоресценция после фотоотбеливания. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | реферат |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 21.09.2009 |
| Размер файла | 388,2 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
3
Реферат
по биологии
на тему:
"Методы исследования клеток"
2009
Содержание
- 1. Метод электронной микроскопии
- 2. Метод флуоресцентных зондов
- 3. Метод восстановленной флуоресценции после фотоотбеливания
- 4. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
- 5. Метод спектроскопии комбинационного рассеяния
- 6. Микроспектроскопия комбинационного рассеяния
- 7. Метод динамической фазовой микроскопии
1. Метод электронной микроскопии
Одним из традиционных методов клеточной биофизики наряду со световой (оптической) микроскопией является метод электронной микроскопии, который позволяет наблюдать объекты размером меньше 10 нм. При использовании данного метода клетки и ткани фиксируют в 2,5% -м растворе глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном или Na-какодилатном буфере (рН 7,2-7,4). Затем для удаления глутарового альдегида препараты промывают буферным раствором и окрашивают 1% -м раствором Os04. Далее препараты обрабатывают спиртовыми растворами возрастающей концентрации (от 30 до 100°). Для повышения контрастности окрашенных препаратов к 70-градусному спирту добавляют 2% -й раствор уранил-ацетата. Обезвоживание осуществляют путем выдерживания препаратов в абсолютном ацетоне при периодической смене раствора. Для заливки образцов готовят смесь ацетон - смола в соотношении 3:
1. В состав смолы входит ряд специальных ингредиентов. После заливки срезы помещают в термостат и инкубируют при температуре 37 "С в течение 12 ч. После удаления ацетона препарат заливают смолой и последовательно инкубируют при температуре от 37 до 57°С. Далее препараты нарезают на микротоме (срезы толщиной 60-90 нм), просматривают и фотографируют в электронном микроскопе ЭЛМ-100А.
2. Метод флуоресцентных зондов
Для регистрации изменений многих клеточных процессов и характеристики вязкости, мембранного потенциала, внутриклеточного или связанного содержания ионов используют метод флуоресцентных зондов (например, такие зонды, как fura-2, хлортетрациклин, 9-аминоакридин и флуоресцеиндиацетат).
В основе метода флуоресцентного определения мембраносвязанного кальция лежит способность антибиотика ХТЦ, локализованного в мембране, образовывать комплекс с ионом кальция, что приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции зонда. Его свечение регистрируют с одного и того же участка клетки в течение всего времени эксперимента с помощью люминесцентного микроскопа. Возбуждение флуоресценции ХТЦ вызывают с помощью галогенной лампы накаливания, выделяя полосу за счет комбинации фильтров. Регистрацию свечения проводят с помощью фотометрической насадки, выделяя полосу с помощью интерференционных светофильтров при длине волны максимального пропускания светового пучка 490 и 550 нм.
При регистрации внутриклеточного рН в качестве зонда используют ФДА в конечной концентрации 10-5 моль. После 20 мин инкубации (время, необходимое для накопления в объекте достаточного для флуориметрии количества флуоресценции) клетки тщательно отмывают от экстраклеточного ФДА. Для обеспечения постоянного рН экстраклеточной среды при инкубации клеток добавляют 50 ммоль HEPES, доводя рН раствора до 6,2 - 8,5. Спектры флуоресценции препаратов регистрируют с помощью инвертированного микроспектрофлуориметра: возбуждение флуоресценции препаратов осуществляют обычно с помощью галогенной лампы накаливания и комбинации стеклянных светофильтров. Размер фотометрируемого участка клетки составляет, как правило, 60 ч 60 мкм (при объективе ч 10). Значение внутриклеточного рН определяют по величине отношения интенсивностей флуоресценции окрашенного препарата при длинах волн 516 и 570 нм, сопоставляя его со значениями соответствующей калибровочной кривой, представляющей собой зависимость величины этого отношения от значений рН буферных растворов флуоресцеина.
Для регистрации внутриклеточного Са2+ после загрузки и перед началом опыта клетки промывают исходным раствором и выдерживают 30-40 мин для деэтерифицировапия и достижения равновесного распределения между связанной и свободной формами молекул зонда (fura-2) внутри клетки. Для определения содержания кальция в клетке применяют микроспектрофлуориметрический метод. Клетки помещают в перфузируемую ячейку на предметном столике инвертировагаюго микроскопа, совмещенного со спектрофлуориметром, оснащенным ксеноновой лампой, разделителем лучей, двумя монохроматорами и двойным зеркальным чопперным механизмом, позволяющим чередовать возбуждение молекул fura-2 лучами двух длин воли - 340 и 380 нм (с частотой 100 Гц). Ширина полосы возбуждения не должна превышать 3,5 нм. Концентрацию Са2+ рассчитывают по отношению интенсивностей флуоресценции (505 нм) в ответ на возбуждение, вызванное лучами с длинами волн 340 и 380 нм.
3. Метод восстановленной флуоресценции после фотоотбеливания
Упрощенная схема установки для исследования восстановленной флуоресценции после фотоотбеливания: 1 - лазер; 2,3 - аттенюаторы (ослабители луча); 4 - диафрагма; 5 - осветитель; 6 - конденсатор микроскопа; 7 - исследуемая клетка; 8 - объектив микроскопа; 9 - дихроичное зеркало, отражающее падающий свет и пропускающее свет возбужденной флуоресценции; 10 - отсекающий светофильтр; 11 - "зонд" - узкая диафрагма, выделяющая флуоресценцию с исследуемого участка; 12 - ФЭУ; 13 - блок регистрации и управления установкой
Метод восстановленной флуоресценции после фотоотбеливания используется в биофизике клетки для измерения коэффициента латеральной диффузии белков и липидов в плазматических мембранах. Если пометить интересующие нас белки или фосфолипиды флуоресцентной меткой, например производным флуоресцеина, и ввести их в клетку, то при регистрации с помощью флуоресцентного микроскопа наблюдается флуоресценция, величину которой можно оценить фотоэлектронным умножителем и проанализировать на персональном компьютере.
Возбуждающий флуоресценцию луч лазера фокусируется на участке плазматической мембраны (порядка нескольких квадратных микрон). Далее этот луч должен быть ослаблен аттенюаторами настолько, чтобы вызвать лишь флуоресценцию метки, но не фотоокисление компонентов мембраны.
Восстановление интенсивности флуоресценции после фотоотбеливания. Метод расчета данных по трем точкам: 7 (Я < 0) - интенсивность флуоресценции до фотоотбеливания; 7 (0) - интенсивность флуоресценции непосредственно после фотоотбеливания. Стрелкой отмечен момент фотоотбеливания
В начале эксперимента интенсивность возбуждающего луча на несколько десятков миллисекунд увеличивают настолько, чтобы вызвать фотоокисление флуоресцентной метки (фотоотбеливание). Вслед за этим его интенсивность возвращают к исходному уровню и регистрируют интенсивность флуоресценции участка клетки после фотоокисления метки. Так как продукт фотоокисления не флуоресцирует, то восстановление исходного уровня флуоресценции наступает вследствие латеральной диффузии меченых молекул белка или липида из соседних областей клетки. Таким образом, регистрация скорости восстановления исходного уровня флуоресценции участка мембраны клетки после фотоотбеливания позволяет определить коэффициенты диффузии мембранных белков и липидов.
4. Метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп: 1 - сканируемый в 3 направлениях предметный столик; 2 - объектив микроскопа (инвертированного); 3 - дихроичное зеркало; 4 - отсекающий фильтр; 5 - диафрагма детектора; 6 - спектрограф (для выделения нужной полосы флуоресценции); 7 - ФЭУ; 8 - блок регистрации и управления установкой; 9 - лазер; 10 - диафрагма осветителя
Теория метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии была разработана в 1977-1978 гг. Основное условие конфокальности (совпадения фокусов) заключается в том, чтобы проекция диафрагмы детектора на объекте точно совпадала с фокусом освещающего объект света.
Существенным моментом регистрации является как можно меньший диаметр диафрагмы детектора, что достижимо при использовании достаточно мощных источников освещения - лазеров. Сочетание этих особенностей позволяет значительно увеличить разрешение (до 100 - 200 нм) и контрастность образца по сравнению с обычной световой микроскопией. Флуоресценция, возникающая в той части образца, на которую сфокусирован объектив, достигает детектора и затем регистрируется. В обычной световой люминесцентной микроскопии детектируется флуоресценция всей освещенной части образца, хотя те участки, которые находятся вне фокуса, видны неконтрастно. КЛСМ позволяет послойно просматривать живые клетки (подобие томографии) и количественно оценивать их флуоресцентное изображение. Предметный столик с объектом передвигается в плоскости ч - у, а также по оси ж. Каждое полученное изображение фиксируется компьютером, и даже воссоздается изображение каждого отдельного вертикального оптического среза, что невозможно при обычной оптической световой микроскопии. Количественные характеристики объекта методом КЛСМ получают, определяя интенсивность флуоресценции с помощью ФЭУ. Если исследователя интересует распределение макромолекул данного типа между ядром и цитоплазмой, то "окно" изображения можно поместить в оптический срез ядра, определить интенсивность флуоресценции из него (Fn), а затем поместить такое же "окно" в участок цитоплазмы на том же оптическом срезе и определить интенсивность флуоресценции из этого "окна" (Fc). Тогда отношение А = Fn/Fc будет характеризовать распределение интересующих нас флуоресцентно меченных молекул между ядром и цитоплазмой в данном оптическом срезе.
5. Метод спектроскопии комбинационного рассеяния
В настоящее время в биологии широко применяется спектроскопия комбинационного рассеяния. Комбинационное рассеяние света - хорошо известное физическое явление, успешно используемое в исследовании структуры молекулы, ее динамического поведения, внутримолекулярных колебаний и межмолекулярных взаимодействий.
В биологии клетки спектроскопия КР используется при исследовании полимерных биологических макромолекул - полипептидов, поли-нуклеотидов и полисахаридов. При анализе структуры белков с помощью КР оцениваются полосы спектра, характерные для амида А (колебания N-З-связей), амида 1, амида 2 и амида 3. При анализе структуры нуклеиновых кислот исследуются полосы спектра КР, характерные для воды, Сахаров, нуклеотидов (колебания С=0-, C=N - и С=С-свя-зей), симметричные и асимметричные колебания Р02-связей, колебания РО-связей фосфата и СО-связей Сахаров, а также скелетные, деформационные колебания всех связей полинуклеотидов. При анализе структурных изменений полисахаридов с помощью КР-спектроскопии оцениваются колебания ОН - и СН-связей Сахаров, целлюлозы и хитина.
В биофизике клетки КР-спектроскопия широко используется для исследования конформационных изменений белков и фосфолипидов в природных и модельных мембранах. Например, исследование колебаний С - С и С - З-связей позволило выявить зависимости конформационных изменений углеводородных цепочек жирных кислот от упорядоченности мембранных фосфолилидов клеточной мембраны.
Спектр комбинационного рассеяния белков (а) и липидов (б)
Использование лазерного излучения с длиной волны поглощения порфирина позволяет регистрировать спектры резонансного комбинационного рассеяния протопорфиринов в эритроцитах. В этих спектрах доминируют линии, лежащие в области 1 ООО - 1 650 см-1, которые обусловлены плоскостными колебаниями связей С-С и С - N и деформационными колебаниями С-Н. Некоторые из них подвержены влиянию химических превращений, происходящих с атомом железа, и могут быть использованы для изучения структуры макроцикла.
При исследовании состояния гемоглобина эритроцитов с помощью КР-спектроскопии образец крови обычно помещают в специальный держатель, что позволяет фокусировать луч возбуждающего света на объекте. Источником возбуждающего света при регистрации спектров КР служит газовый лазер, непрерывный генерирующий излучение в области следующих длин волн: 441,6; 476,5; 488,0; 496,5; 501,7; 514,5 нм. С помощью светофильтров мощность излучения поддерживают на уровне 20 - 100 мВт, что не приводит к существенным изменениям нативного состояния объекта. Рассеянное на образце излучение собирают системой линз на входную щель монохроматора. Сканирование спектра КР осуществляют двойным монохроматором, спектральная область прибора составляет 400 - 850 нм, относительное отверстие - 1: 5,3, обратная дисперсия - 0,45 нм/мм, полуширина аппаратной функции - не более 1 см-1 (при длине волны 550 нм), скорость сканирования - 0,18 нм/с, точность измерения - около 4 см-1. Регистрацию сигналов РКР осуществляют ФЭУ, работающим в режиме счета фотонов. Накопление спектров проводят на многоканальном анализаторе импульсов или персональном компьютере.
Спектр комбинационного рассеяния порфирина гемоглобина
Блок-схема спектрометра комбинационного рассеяния
6. Микроспектроскопия комбинационного рассеяния
Спектры КР от отдельных участков клетки получают на КР-мик-роспектрометре с тройным монохроматором и фотоэлектронной регистрацией сигнала. Запись и обработку спектров проводят с помощью компьютера. В качестве источника возбуждения используют аргоновый лазер. С целью устранения плазменных линий, расположенных вблизи от возбуждающей линии, перед кюветным отделением помещают предмонохроматор или интерференционный фильтр. Для получения спектров с пространственным разрешением применяют РКР-спект-рометр, состыкованный с оптическим микроскопом. При работе с клетками устанавливают водоиммерсионный объектив 100х с числовой аппертурой 0,95. Этот объектив фокусирует лазерный луч в плоскости ч - у до 1 мкм2. Установка диафрагмы диаметром 200 мкм дает пространственное разрешение по оси ж, составляющее около 4 мкм. Пространственное разрешение - около 4 мкм3.
7. Метод динамической фазовой микроскопии
В настоящее время для исследования быстрых изменений формы клетки или отдельных ее частей используют лазерный фазовый микроскоп, представляющий собой модифицированный интерференционный микроскоп с модуляцией фазы референтной волны, с гелий-неоновым лазером (л = 633 нм) для когерентного освещения объекта и диссектором в качестве координатно-чувствительного фотоприемника. Важно, что измерение клеток проводят в отраженном свете. При регистрации используют объектив х20/0,45, размер поля зрения - 128 ч 128 пике (20 ч 20 мкм); время измерения в одной точке скан-линии Г, - 1 мс, время ввода трек-диаграммы - 14,7 с. Микроскоп позволяет получать изображения в виде оцифрованного двумерного распределения фазы h (x, у), которая измерялась в единицах длины (оптической разности хода лучей) в реальном времени. Метод динамической фазовой микроскопии основан на периодических измерениях фазы вдоль произвольно установленного сегмента (скан-линии) в-изображении объекта. Полученная при периодическом сканировании матрица чисел (трек-диаграмма) содержит информацию об изменениях локальной фазовой высоты в точках скан-линии за время измерений. Накопленные в памяти компьютера данные подвергаются обработке и содержат количественную информацию о флуктуациях локальной разности хода (фазовой высоты) h (ч, у), пропорциональной проекции локального показателя преломления п (х, у, ж). Как правило, линию сканирования выбирают поперек клетки и производят периодические измерения высоты фазового профиля h (x), где ч - координата скан-линии.
Блок-схема динамического фазового микроскопа
Подобные документы
Определение назначения и описание механизма гистохимических методов идентификации химических веществ в гистологических срезах. Описание электронной, люминесцентной и ультрафиолетовой микроскопии. Радиоавтография и культура клеток и тканей вне организма.
реферат [28,2 K], добавлен 09.09.2014Методы световой микроскопии, темного поля, фазового контраста, наблюдения в инфракрасных и ультрафиолетовых лучах, в свете люминесценции. Поляризационная, электронная микроскопия. Лоренцова электронная микроскопия. Сущность зонального центрофугирования.
презентация [1,0 M], добавлен 10.10.2008Основной предмет изучения гистологии. Главные этапы гистологического анализа, объекты его исследования. Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия, сущность метода.
курсовая работа [32,3 K], добавлен 12.01.2015Характеристика этапов развития и возможностей флуоресцентной микроскопии. Методы выявления физиологического состояния клеток микроводорослей. Количественная регистрация интенсивности флуоресценции. Определение содержания витаминов в растительных клетках.
курсовая работа [58,1 K], добавлен 16.05.2010Методы изучения морфологии микроорганизмов. Правила работы в микробиологической лаборатории. Микроскопия в светлом поле. Установка света по Келеру. Изображения фиксированных препаратов, полученные в результате исследования метода изучения морфологии.
лабораторная работа [925,0 K], добавлен 14.05.2009Особенности строения и роста растительных клеток. Методы изучения растительной клетки. Электронная микроскопия, возможности светового микроскопа. Метод замораживания-скалывания. Дифференциальное центрифугирование, фракционирование. Метод культуры клеток.
реферат [30,9 K], добавлен 04.06.2010Методы изучения морфологии микроорганизмов при микроскопии препаратов, приготовленных из чистых культур путем окрашивания. Способы витальной окраски микроорганизмов для избежания артефактов, появляющихся в результате токсического действия красителя.
презентация [3,4 M], добавлен 23.02.2016Положения клеточной теории. Особенности электронной микроскопии. Детальная характеристика строения и функции клеток, их связи и отношения в органах и тканях у многоклеточных организмов. Гипотеза тяготения Роберта Гука. Сущность строения клетки эукариот.
презентация [1,6 M], добавлен 22.04.2015Рассмотрение возможностей световой флуоресцентной и интерференционной микроскопии. Использование ядерного магнитного резонанса и внутриклеточных электродов для определения химических условий в клетках. Технологии расщепления ДНК рестицирующими нуклеазами.
курсовая работа [54,8 K], добавлен 21.09.2010Функции биологических мембран и их компонентов. Спектроскопические методы измерения скорости вращения липидов и белков внутри мембраны и скорости латеральной диффузии этих компонентов в плоскости мембраны. Использование спиновых или флуоресцентных зондов.
реферат [1,6 M], добавлен 01.08.2009
