Функциональная организация генома дрозофилы: генетические элементы в протяженном районе эухроматина

Реферат

по биологии

на тему:

"Функциональная организация генома дрозофилы: генетические элементы в протяженном районе эухроматина"

2009

Введение

Структура генома Drosophila melanogaster была определена в 2000 г. Для предсказания генов в геномном сиквенсе дрозофилы были использованы компьютерные программы, а также данные по гомологии с сиквенироваными кДНК дрозофилы и известными доменами белков. Было выявлено 13600 генов дрозофилы. Примерно 3000 генов - имеют гомологиии с генами, найденными также у нематоды С. elegans и дрожжей S. cerevisiae. Значительное число предсказанных генов оказалось совершенно новыми, с неизвестными функциями. Возможно, кодируемые такими генами белки участвуют в каких-то специфических для дрозофилы процессах. Однако, учитывая ошибки при компьютерном предсказании генов в геномной ДНК дрозофилы, необходимо выполнить большой объем экспериментальной работы по проверке существования in vivo предсказанных генов дрозофилы. Кроме того, остаются не охарактеризованными разнообразные регуляторные и структурные элементы генома, обеспечивающие надежную работу генов и генома как целого.

Наш подход заключается в выявлении закономерностей и особенностей функционирования генома на основе подробного исследования структурно-функциональной организации небольшой, но репрезентативной части генома. Для такого исследования был выбран район 2DF Х-хромосомы длиной 200 т.п.н. Данный район - один из наиболее подробно изученных генетическими методами участков генома, а большинство генов района были детально охарактеризованы структурно и функционально молекулярными методами. Район содержит несколько десятков генов и около десяти структурных элементов хромосомы - хромомеров. Как часть Х-хромосомы район подвергается дозовой компенсации - двукратному увеличению активности генов Х-хромосомы у самцов, несущих одну Х-хромосому, по сравнению с самками, имеющими две Х-хромосомы. Для изучаемого района получены хромосомные перестройки, в которых гены района перенесены к прицентромерному гетерохроматину, что позволяет изучать взаимодействия между эу- и гетерохроматином в геноме дрозофилы.

Компактная организация транскрипции

Сколько всего транскриптов присутствует в исследуемом протяженном районе генома? Есть ли какие-либо взаимодействия при транскрипции соседних генов? Для ответов на эти и другие вопросы, связанные с организацией синтеза РНК в данном районе, предварительно были клонированы в космидах фрагменты ДНК района 2DF и построена рестриктная карта района. В дальнейшем были охарактеризованы 10 генов данного района. Еще 12 генов района были исследованы в разное время в других лабораториях, подробную информацию о генах района можно найти в базе данных FlyBase. Полный геномный сиквенс данного района, полученный Европейским консорциумом из 10 лабораторий и компанией Целера Геномикс, позволил предсказать еще ряд генов в данном районе. Однако предсказаны были только участки, кодирующие белки, сведения о полных транскриптах отсутствовали. Кроме того, эти предсказания нуждались в экспериментальном подтверждении, так как сравнение двух аннотаций геномного сиквенса показало, что для 40% предсказанных кодирующих последовательностей ДНК наблюдаются определенные различия, причем в 9% случаев предсказания не соответствовали друг другу.

Использование геномного сиквенса помогло нам построить подробную транскриптную карту для изучаемого района. Для поиска новых РНК, соответствующих как предсказанным генам, так и, возможно, синтезируемых в протяженных участках между известными ранее генами района, было сконструировано несколько десятков уникальных праймеров. Новые кДНК обнаруживали с помощью полимеразной цепной реакции с использованием суммарной кДНК дрозофилы, полученной с олиго-дТ-затравки, и синтезированных геном-специфических праймеров. Продукты амплификации, представляющие собой новые кДНК из района 2EF, были клонированы и сиквенированы. В результате в районе были картированы в общей сложности 40 транскриптов или генов. Были уточнены не только структуры транскриптов, но и само существование некоторых предсказанных генов. Так, транскрипты предсказанного in silico на участке ДНК 180-182 т.п.н. гена EG.25E8.6 не были обнаружены, однако точно в месте расположения данного предполагаемого гена несколькими независимыми экспериментальными методами нами был обнаружен совершенно другой, новый ген дрозофилы, названный Vml. Транскрипция гена У ml идет в сторону, противоположную предсказанной, и он кодирует новый белок, имеющий сходство с белками вителлиновой мембраны ооцита дрозофилы.

Примеры компактной организации экспрессии соседних генов в районе 2DF Х-хромосомы дрозофилы. Стрелки показывают относительное расположение и направление транскрипции отдельных генов

В среднем на один ген в исследуемом нами районе приходится 5 т.п.н.. Размеры транскрибируемых областей варьируют от 0,3 до 20 т.п.н.. Как правило, гены расположены вплотную, с минимальными межгенными расстояниями. Транскрипты могут располагаться тандемно, с перекрыванием 3-концов или с перекрыванием 5-концов. Более того, в районе есть два гена, EG.103B4.2 и 11715, полностью расположенные в нитронах других генов. Обнаружение перекрывающихся районов транскрипции поднимает вопрос о функциональной взаиморегуляции обнаруженных генов.

Картирование транскриптов для протяженного района генома дрозофилы, содержащего 40 генов, осуществлено впервые. Интересно, что плотность транскриптов в исследованном ранее более коротком фрагменте ДНК Х-хромосомы, содержащем 12 генов, такая же. С другой стороны, при исследовании структуры протяженного района комплекса генов Bithorax, регулирующих становление плана тела насекомого, было показано, что значительную часть комплекса составляют межгенные участки ДНК, выполняющие до конца не выясненные функции. Однако в геноме дрозофилы известно всего несколько районов, организованных подобно комплексу генов Bithorax, и, скорее всего, большинство генов эухроматической части генома дрозофилы находится в районах с компактной организацией транскрипции, похожих на район 2DF Х-хромосомы.

Хромомер - локально компактизованный участок хромосомы. В гигантских политенных хромосомах дрозофилы индивидуальные хромомеры образуют видимые в световой микроскоп поперечные хромосомные полосы или диски. Существует ли взаимосвязь между расположением генов и структурных элементов хромосомы - хромомеров? Согласно цитологической карте политенных хромосом дрозофилы, район 2DF содержит десять дисков, и, следовательно, в одном диске содержится в среднем четыре гена. С помощью гибридизации клонированных фрагментов ДНК in situ с политенными хромосомами нам удалось грубо картировать расположение ряда хромомеров на физической карте района. Сопоставление границ генов и хромомеров указывает на отсутствие корреляции в их расположении. Вероятно, видимая хромомерная организация нужна в основном для компактной упаковки генома в хромосомы, а не для регуляции генной активности. Однако вопрос о точном картировании хромомеров на последовательности ДНК района остается открытым. Одним из подходов к выявлению отдельных доменов хроматина может быть анализ распределения особых структур в ДНК, которые могли бы определять возможные границы хромомеров.

Дупликации генов и эволюция генома

В геномах многоклеточных эукариот присутствует значительное количество дуплицированных генов. Дупликации генов с их последующей дивергенцией исключительно важны для эволюции и функционирования геномов, например, в качестве материала для появления генов с новой функцией. В районе 2Е Х-хромосомы дрозофилы выявлен новый ген msta, активно экспрессирующийся в головах взрослых мух. Он содержит два экзона и кодирует полипептид с доменом, присутствующим в ряде белков - модуляторов структуры хроматина и активности генов. Рядом с данным геном обнаружен ген msts, представляющий собой дивергировавшую и не имеющую второго экзона копию гена msta. В настоящее время ген msts, вероятно, является псевдогеном, однако нельзя исключить и того, что ген msts -- это локус с новой, пока неясной функцией, возникший в ходе эволюции копии гена msta. Средний уровень дивергенции между генами msta и msts около 50%. Учитывая скорость замен нуклеотидов, можно предположить, что локальная дупликация генов произошла около 20 млн лет назад, т.е. во время образования подрода D. melanogaster. Какое-то время после образования дупликации работали оба гена, так как дивергенция в кодирующей области меньше, чем дивергенция в интроне. Учитывая скорости замен нуклеотидов в кодирующих и некодирующих областях, можно предположить, что ген msts перестал функционировать еще до расхождения видов D. simulans и D. melanogaster, произошедшего около 2,5 млн лет назад.

Другой случай дупликации генов района - впервые описанный у дрозофилы кластер из четырех генов цитохромов Р450. Цитохромы Р450 участвуют в процессах инактивации различных токсичных молекул. Интересно, что белок, кодируемый одним из генов кластера, судя по его структуре, имеет отличную от остальных субстратную специфичность и принадлежит к особому подсемейству цитохромов Р450. По-видимому, в данном случае произошли дублирование и последующее усовершенствование функции гена. Два других дуплицированных гена в данном районе, гены poly-homeotic, ph-d и ph-p, активны, и каждый способен компенсировать работу другого. Таким образом, на исследуемом участке ДНК имеются три локальных дупликации, в которых копии генов расположены рядом, и восемь генов из имеющихся в этом районе 40 генов, т.е. 20% всех генов района, являются локально дуплицированными генами. При исследовании другого протяженного участка генома дрозофилы, района гена Adh, также было обнаружено, что не менее 17% всех генов являются дуплицированными генами. Можно заключить, что локальные дупликации генов у дрозофилы - довольно частое событие.

Наряду с дупликациями целых генов в геноме дрозофилы присутствуют и дупликации отдельных частей генов, кодирующих определенные белковые домены. Можно предположить, что дупликации частей гена, представленные в других генах, могут повышать надежность выполнения функции, определяемой данным геном. Интересным примером такого типа является обнаруженный нами уникальный ген винкулина дрозофилы. В случае эугетерохроматической перестройки ген винкулина разрывается, однако особи, несущие такую хромосому, вполне жизнеспособны. Следовательно, этот ген не является жизненно важным для дрозофилы, несмотря на то, что он кодирует эволюционно консервативный белок цитоскелета. Возможно, функции винкулина компенсируются другими белками, имеющими отдельные белковые домены винкулина, в частности, белком сс-катенином.

Повторы ДНК Х-хромосомы и дозовая компенсация

Выравнивание количества мРНК и количества образующегося белка, кодируемого генами Х-хромосомы у самцов, имеющих одну Х-хромосому, и самок с двумя Х-хромосомами регулируется с помощью механизма дозовой компенсации. У дрозофилы этот механизм поддерживается различными генетическими элементами, структура которых неизвестна и которые расположены как в промоторной и кодирующей областях, так и вне генов. Интересно, что молекулярные механизмы дозовой компенсации у человека и дрозофилы во многом сходны - это распространение эффекта вдоль хромосомы на большие расстояния с участием специальных некодирующих РНК.

Повторы GT в области начала транскрипции гена вннкулина

Стрелка на геномной ДНК обозначает начало и направление транскрипции, треугольники - места расположения повторов GT

Микросателлитными ДНК или микросателлитами называют присутствующие в эухроматине короткие тандемно повторяющиеся последовательности ДНК. Их роль в функционировании генома пока неясна. Ранее было показано, что Х-хромосома дрозофилы в целом обогащена повторами GT, однако характер их расположения относительно индивидуальных генов не был исследован. Мы обнаружили блоки тандемно повторенных динуклеотидов GT сразу перед предполагаемым стартом транскрипции и в первом интроне гена винкулина. На участке длиной 850 п.н. в районе старта транскрипции присутствуют пять повторов GT длиной не меньше 8 нуклеотидов. Такая концентрация повторов GT в начале гена не является случайной. Повторы GT отсутствуют в основной части гена винкулина. Интересно, что все три других кластера повторов GT, выявляемые в данном районе, также расположены в областях стартов транскрипции. Известно, что ДНК, содержащая повторы GT, способна образовывать Ж-форму. Известно также, что с динуклеотидом GT способен связываться архитектурный белок HMG-D, который может изгибать ДНК в сайтах связывания и вызывать плавление ДНК в близлежащих районах. В присутствии этого белка хромосомы менее компактны. Такое изменение структуры ДНК в 5'-конце гена могло бы облегчать инициацию транскрипции гена. Возможно, повторы GT вовлечены в процесс дозовой компенсации, приводящий к дополнительной декомпактизации Х-хромосомы у самцов дрозофилы.

Другими кандидатами на роль генетических элементов, участвующих в явлении дозовой компенсации генов района 2DF, могут быть обнаруженные между генами msta и msts тандемные повторы ДНК, представляющие собой дивергировавшие, гомологичные на 58%, копии повторов сателлитной ДНК дрозофилы с плотностью 1,688 г/см³, присутствующей только в Х-хромосоме. СатДНК 1,688 локализуется в прицентромерном гетерохроматине Х-хромосомы, образуя протяженные массивы тандемных повторов. СатДНК 1,688 представляет собой главным образом повторы с длиной мономерной единицы 359 пар нуклеотидов. Наши данные свидетельствуют, что основным видом нарушений в тандемной структуре сатДНК 1.688 могут быть инсерции ретротранспозона Doc. Показано, что инсерции происходят в один и тот же сайт последовательности ДНК мономера сатДНК 1,688. Обнаружен белок, способный связывать первые 117 нуклеотидов мономерной единицы сатДНК 1.688, оставляя свободным участок от 118 до 359 нуклеотидов, точно посередине которого находится место инсерции Doc - 237-238 нуклеотиды. Это обстоятельство может говорить о том, что Doc выбирает для встраивания в мономере сатДНК 1,688 свободную от белка область.

Число копий повторов сатДНК 1,688 в районе 2Е различно в разных линиях дрозофилы. С помощью гибридизации in situ мы показали, что данные повторы есть в районах ЗА, 6Е и 7А Х-хромосомы. Анализ геномного сик-венса подтвердил, что кластеры из нескольких дивергировавших копий тандемных повторов сатДНК 1,688 действительно присутствуют в этих районах. Ранее были описаны еще несколько семейств последовательностей ДНК, гомологичных сатДНК 1,688 и располагающихся в других местах эухроматина Х-хромосомы. Они присутствуют в эухроматине Х-хромосомы в виде кластеров из 2-4 копий, гомологичных между собой на 85-98%. Все эти последовательности на 60-80% гомологичны последовательности мономера сатДНК 1.688. По всему эухроматину Х-хромосомы рассредоточено около 300 копий повторов сатДНК 1,688, что составляет несколько процентов от количества сатДНК 1,688 в геноме. Можно предположить, что рассеянные по эухроматину Х-хромосомы повторы сатДНК 1,688 представляют собой цисдействующие элементы процесса дозовой компенсации, с которыми связаны дальнодействующие регуляторные функции, распространяющиеся на протяженный домен Х-хромосомы. Известно, что сателлитная ДНК 1,688 содержит сайт связывания ДНК-топоизомеразы II. Расположенные в эухроматине Х-хромосомы повторы сатДНК 1,688 могли бы связывать комплексы ДНК-топоизомеразы II с другими ДНК-расплетающими белками и участвовать в изменении компактизации хроматина в определенном районе.

Инактивация генов при приближении к гетерохроматину

У многоклеточных эукариот существуют специальные механизмы регуляции активности больших групп генов: на определенных стадиях развития в дифференцированных клетках могут быть полностью выключенными большие группы генов, периодическое выключение большинства генов происходит и в клеточном цикле - на стадии митоза, могут быть постоянно выключены гены одной из хромосом генома. Интересной моделью для изучения процессов инактивации генов в протяженных районах хромосом является мозаичный эффект положения. Так называется явление инактивации генов, перенесенных к гетерохроматину, в части соматических клеток. Важным свойством МЭП является распространение инактивации генов от границы с гетерохроматином на значительные расстояния. Молекулярные механизмы, лежащие в основе распространения инактивации вдоль хромосомы, в настоящее время неясны. Сильный МЭП для генов района 2DF был обнаружен в случае перицентрической инверсии Х-хромосомы Inpn2a. Мозаичная инактивация генов в этой перестройке распространяется далеко за пределы исследуемого нами района. В хромосоме Inpn2a фрагмент ДНК, содержащий гены от csw до Vine, перенесен к гетерохроматину Х-хромосомы, а соединение эу- и гетерохроматина произошло по гену винкулина и повторам сателлитной ДНК n. Были проведены количественные измерения уровней активности для расположенных на разных расстояниях от границы с гетерохроматином в инверсии генов Pgd и рп. Оказалось, что оба гена в инверсии инактивированы в среднем на 50%.

Данный результат указывает на то, что в пределах определенного района хромосомы степень инактивации разных генов может быть одинаковой. Что же может представлять собой такой "домен инактивации"? Это могла бы быть содержащая несколько генов петля хроматина, выходящая из остова хромосомы в норме и остающаяся в компактном состоянии в части клеток в случае МЭП. Дальнейший анализ распространения МЭП на данной молекулярно-генетической модели поможет охарактеризовать возможные дальнодействующие регуляторные элементы в изучаемом районе генома дрозофилы.

Заключение

Корень термина "геном" отсылает нас только к генам, и геном какого-либо организма обычно рассматривается как полная последовательность нуклеотидов его ДНК, в которой записана информация обо всех генах. Действительно, геномы бактерий и дрожжей состоят преимущественно из кодирующих гены областей. Однако у многоклеточных эукариот гены составляют только малую часть генома. Мы еще далеки от детального знания о негенных элементах генома, определяющих функции гетерохроматина, теломеры, центромеры, участвующих в процессах компактизации хромосомы, транскрипции, репликации, митоза, мейоза, репарации. В настоящее время наиболее важными задачами являются поиск и характеристика элементов генома, определяющих правильную временную и пространственную экспрессию генов, детальная идентификация энхансеров, сайленсеров, инсуляторов и других регуляторных элементов, а также анализ нуклеосомного и/или хроматинового кода, выявление мест связывания различных белковых факторов с ДНК и хроматином. В дальнейшем мы узнаем больше о таких элементах генома, как, например, гены, кодирующие РНК, которые не кодируют белков, участки начала репликации ДНК и генетические элементы, контролирующие структуру хромосом. Однако уже сейчас ясно, что в геномной ДНК многоклеточных эукариот и, в частности, дрозофилы в очень плотном виде записан исключительно большой объем информации. Читать ее можно научиться на основе экспериментального выявления и детального анализа перечисленных выше элементов генома для типичных районов генома, таких, например, как район 2DF Х-хромосомы дрозофилы.