Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы

Реферат

по биологии на тему:

"Структурно-функциональные исследования РНК-полимеразы"

2009

Введение

Исследования РНК-полимеразы были начаты Р.Б. Хесиным, исходившим из того, что изучение механизмов функционирования РНК-полимеразы должно дать ключ к пониманию механизмов регуляции активности генов. Сейчас известно, что такая регуляция осуществляется на всех стадиях транскрипции - инициации, элонгации и терминации синтеза РНК. Несмотря на громадные различия в деталях, структурные основы механизмов транскрипции всех живых организмов от бактерий до человека едины. Поэтому исследования относительно просто устроенных бактериальных РНК-полимераз способствуют пониманию механизмов транскрипции не только бактерий, но и эукариот. Долгие годы из-за недоступности методов прямого рентгеноструктурного анализа для исследования РНК-полимеразы использовались различные косвенные методы. Они дали возможность описать последовательные стадии транскрипции и выяснить важные принципы организации транскрипционных комплексов на каждой из этих стадий. Было выяснено, что важную роль в транскрипции и ее регуляции играет конформационная подвижность компонентов реакции. Лучше всего была изучена конформационная подвижность нуклеиновых кислот в этих комплексах. Менее подробно и главное менее конкретно была изучена конформационная подвижность самой РНК-полимеразы. И лишь недавно ситуация резко изменилась. В 1999 г. рентгеноструктурными методами высокого разрешения была установлена пространственная структура РНК-полимеразы термофильной бактерии Thermus aquaticus, а в 2001 г. РНК-полимеразы II дрожжей. Эти работы открыли совершенно новые возможности для структурно-функциональных исследований транскрипции путем проецирования результатов косвенных методов на уже установленные пространственные структуры высокого разрешения. Примером такого подхода является наша работа, в которой была построена первая реалистичная молекулярная модель транскрипционного комплекса путем проецирования на кристаллическую структуру минимальной РНК-полимеразы Т. aquaticus результатов картирования химических сшивок РНК-полимеразы Е. coli с искусственными конструкциями, имитирующими ДНК-матрицу и РНК-продукт. Мы надеемся, что использование такого подхода позволит зарегистрировать состояния транскрипционных комплексов, которые трудно или невозможно закристаллизовать, и значительно продвинуться в выяснении молекулярных деталей динамики активного центра РНК-полимеразы и механизмов передачи регуляторных сигналов от белков-регуляторов к этому центру. В данном обзоре кратко изложены основные результаты и перспективы исследований РНК-полимеразы Е. coli в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов. Более подробно механизм функционирования РНК-полимеразы и история ее исследований описаны в обзоре.

СУБЪЕДИНИЧНАЯ СТРУКТУРА РНК-ПОЛИМЕРАЗ

РНК-полимеразы эубактерий состоят из 6 субъединиц, в-, в'-, щ- и две идентичные ос-субъединицы образуют кор, или минимальный фермент, обладающий каталитической активностью, но не способный узнавать начала генов и обеспечивать их специфическую транскрипцию. Такой способностью обладает полный фермент, содержащий всего одну дополнительную субъединицу у. Из изученных бактерий только микоплазмы обходятся единственной у-субъединицей. Остальные бактерии содержат несколько разных у-субъединиц, одна из которых является главной. Есть бактерии с тремя разными субъединицами, у Е. coli их 7, у В. subtilis - 18; рекордсменом на данный момент является Streptomyces coelicolor, содержащая более сорока разных у-субъединиц. Присоединение разных у-субъединиц придает РНК-полимеразе способность использовать разные группы промоторов, что широко используется для регуляции транскрипции. Кроме того, регуляция работы бактериальных промоторов у Е. coli их не менее пятисот - осуществляется с помощью белков-репрессоров и белков-активаторов. В регуляции индивидуального промотора обычно участвует небольшое число белков-регуляторов. Всего у Е. coli их насчитывают 240-260 у Pseudomonas aeruginosa было обнаружено 408 потенциальных регуляторов транскрипции. Один белок-регулятор может участвовать в регуляции нескольких разных промоторов.

Процесс транскрипции у эукариот протекает с участием гораздо большего числа белков, чем в случае бактерий. Транскрипцию хромосомной ДНК у эукариот обеспечивают три эволюционно родственные транскрип-тазы: РНК-полимеразы I, II и III, состоящие из 14, 12 и 17 полипептидов соответственно. 5 субъединиц являются общими для всех трех форм, две - для РНК-полимераз I и III. Две самые большие субъединицы проявляют сходство по аминокислотной последовательности с соответствующими субъединицами бактериальных РНК-полимераз. Подобно минимальным РНК-полимеразам эубактерий, вышеописанные РНК-полимеразы не способны самостоятельно начинать транскрипцию с промоторов. Для базальной транскрипции требуется набор белковых факторов GTF. Для РНК-полимеразы II насчитывают не менее 25 GTF с общей массой 1500 Kda. Для регулируемой инициации транскрипции РНК-поли-меразой II с индивидуальных промоторов кроме специфических белков активаторов и GTF необходим медиатор, содержащий двадцать субъединиц. Общая масса медиатора составляет 1000 KDa.

ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ЦИКЛ

РНК-полимеразы осуществляют последовательное наращивание цепи РНК, используя в качестве субстратов рибонуклеозидтрифосфаты и одну из двух нитей ДНК в качестве матрицы. Синтез РНК начинается с присоединения молекул РНК-полимеразы к специальным участкам ДНК - промоторам, определяющим специфические места инициации транскрипции. Присоединение РНК-полимеразы Е. coli, содержащей у70, к промотору завершается расплетанием 10-15 пар оснований двойной спирали ДНК с образованием так называемого открытого промоторного комплекса, способного к инициации синтеза РНК.

При добавлении НФС к открытому промоторному комплексу РНК-поли-мераза синтезирует и тут же высвобождает набор коротких РНК длиной от 2 до 8 нуклеотидов, не теряя прочных контактов с ДНК-матрицей. Переход от этой стадии абортивного синтеза к стадии элонгации сопровождается существенными структурными перестройками комплекса, в результате которых прочность комплекса значительно возрастает. Транскрипционный комплекс на стадии элонгации отличается поразительной стабильностью, позволяющей РНК-полимеразе, не покидая матрицы, синтезировать молекулы РНК длиной до 104 н. в случае бактерий и до 10б н. - в случае эукариот.

Катализ образования фосфодиэфирной связи между 3'-концом растущей цепи РНК, занимающим так называемый -центр РНК-полимеразы, и 5'-концом альфа-фосфата входящего НФС, занимающего -центр, осуществляется ионом магния, располагающимся на РНК-полимеразе около - и -центров. После присоединения очередного нуклеотида, сопровождающегося освобождением пирофосфата, его 3'-конец некоторое время остается в претранслокационном состоянии, занимая -центр.

В определенных положениях матрицы РНК-полимераза может переходить в арестованное состояние, в котором она, сохраняя прочную связь с матрицей и РНК-продуктом, теряет способность удлинять цепь РНК. Выход из этого состояния возможен только через эндонуклеотическое расщепление цепи РНК на расстоянии нескольких нуклеотидов от ее 3'-конца. Скорость этой реакции, осуществляемой самой РНК-полимеразой, значительно стимулируется специальными факторами элонгации: GreA и GreB у бактерий и TFSII у эукариот. После отщепления фрагмента РНК РНК-полимераза выходит из арестованного состояния, приобретая способность присоединять нуклеотиды к новообразованному 3'-концу РНК. Мы обнаружили, что переход в арестованное состояние происходит в результате возвратного движения РНК-полимеразы, при котором несколько 3'-концевых нуклеотидов вытесняются из гибрида с матричной нитью ДНК. В результате активный центр РНК-полимеразы теряет связь с 3'-концом РНК, но приобретает способность расщеплять фосфодиэфирную связь, против которой он оказался.

В определенных положениях матрицы происходят замедления в движении РНК-полимеразы, особенно заметные при низких концентрациях субстратов. Длительность пауз у бактерий модулируется регуляторными белками NusA и NusG. Паузы сопровождаются возвратными движениями РНК-полимеразы, которые, в отличие от возвратных движений при аресте, имеют меньшую амплитуду и носят обратимый характер. При обратимых возвратных движениях, так же как и при аресте, возможно расщепление РНК с последующим наращиванием новообразованного 3'-конца. Предполагается, что эти процессы не только регулируют скорость элонгации, но и позволяют осуществлять коррекцию РНК в случае включения некомплементарного нуклеотида.

Для терминации транскрипции необходима дестабилизация элонгацион-ного комплекса. В случае бактерий это происходит в результате взаимодействия РНК-полимеразы со специальными последовательностями РНК, закодированными в ДНК-терминаторами. Для узнавания некоторых терминаторов бактериальной РНК-полимеразе не требуется никаких белковых факторов. Важную роль в таких терминаторах играют шпильки РНК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ МИНИМАЛЬНОЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ THERMUS AQUATICUS МЕТОДАМИ РЕНТГЕНОВСКОЙ КРИСТАЛЛОГРАФИИ

Кристаллы минимальной РНК-полимеразы Т. aquaticus давали рентгеновские рефлексы, соответствующие умеренному разрешению 3,7 ангстрема. При таком разрешении нельзя увидеть положение боковых цепей без привлечения дополнительной информации. Подробное описание процедур, позволивших значительно улучшить модель и добиться разрешения индивидуальных аминокислотных остатков, можно найти в статьях. Важную роль сыграли наши данные, позволившие определить положения иона магния, удерживаемого небольшим эволюционно консервативным участком в субъединицы.

При описании структуры молекулы РНК-полимеразы используется пестрая смесь терминов, заимствованных из анатомии и техники. Чаще всего встречается сравнение с клешнями краба. Одна из клешней, которая на исходном рисунке была помещена наверху и названа крышей, образована в основном в-субъединицей, а другая - в субъединицей. Между клешнями располагается канал, средняя ширина которого составляет 27 ангстрем. Наличие канала, в котором может поместиться двуни-тевая ДНК, было обнаружено ранее при изучении структур РНК-полимеразы низкого разрешения. Совершенно неожиданно оказалось, что в этом канале имеется мостик, образованный центральной частью эволюционно консервативного района Св'-субъединицы, имеющий спиральную структуру. Этот так называемый в' -F-мостик пересекает канал примерно посередине, связывая верхнюю клешню с нижней. К в'-С-мостику прилегает петля, образованная консервативным районом G?'-cyбъeдиницы. Вместе они образуют стенку, которая разделяет канал на главный и малый каналы. Малый канал имеет диаметр около 12 ангстрем и следовательно слишком узок для того, чтобы пропускать двунитевую ДНК. Каталитический ион магния располагается при входе в малый канал.

Из других бросающихся в глаза структурных элементов главного канала следует отметить потенциально подвижную заслонку, закрывающую главный канал на одном из его концов, и петлю, поддерживаемую спираль-спираль-подобной структурой, которая по терминологии Дарста напоминает руль самолета и которую я предлагаю называть по-русски шипом.

Рассмотрение структуры показывает, что эволюционно консервативные участки в- и в'-субъединиц пространственно сближены, образуя сердцевину минимальной РНК-полимеразы в виде сферы диаметром 80 ангстрем с центром в районе каталитического магния. Этот результат согласуется с нашими данными по расщеплению РНК-полимеразы свободными радикалами, испускаемыми ионами железа, введенными в РНК-полимеразу вместо каталитического иона магния.

КРАТКАЯ ИСТОРИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ В ЛАБОРАТОРИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ДОРЕНТГЕНОВСКУЮ ЭРУ

Начало исследованиям РНК-полимеразы в нашем Институте положила работа Хесина и сотрудников, продемонстрировавшая, что РНК полимераза Е. coli способна считывать с очищенной ДНК фага Т2 не все имеющиеся в ней гены, а только те, которые функционируют в живой клетке на ранних стадиях инфекции. Эта классическая работа продолжает цитироваться и обсуждаться и в настоящее время.

Крупным прорывом было получение первых мутаций, изменяющих гены РНК-полимеразы Е. coli, а следовательно, и свойства самого белка. Это были мутации устойчивости к антибиотикам рифампицину и стрептолидигину и первая условнолетальная мутация tsX. Молекулярная природа дефекта, вызываемого мутацией tsX, была вскрыта много позже.

После того как в лабораториях Овчинникова и Свердлова была определена полная первичная структура генов РНК-полимеразы Е. coli, в совместной работе лабораторий Хесина и Свердлова были расшифрованы первые мутации устойчивости к антибиотику рифампицину. На Западе эти работы были продолжены в конце десятилетия. Время от времени возвращаемся к ним и мы. В последние годы, когда устойчивость к рифампицину возбудителя туберкулеза стала грозной международной проблемой, эти работы продолжают цитироваться.

Новый этап исследований начался после того как в лаборатории Гольдфарба в Нью-Йорке была разработана система сверхпродукции всех субъединиц РНК-полимеразы Е. coli и сборки из них активного фермента, а в ЛМГМ была разработана система генетического анализа сверхпродуцируемой в-субъединицы и подготовлена программа направленного мутагенеза. В результате объединения усилий двух лабораторий появилась работа, в которой впервые была сконструирована летальная мутация, направленно изменяющая РНК-полимеразу.

В ходе дальнейших исследований генетическими и биохимическими методами в наших лабораториях была изучена доменная организация в и в субъединиц РНК-полимеразы Е. coli. С помощью сочетания генетических и химических методов в составе доменов локализованы участки, имеющие отношение к связыванию субстратов, подробно изучены участки связывания антибиотиков рифампицина и стрептолидигина, обнаружены участки, имеющие отношение к взаимодействию РНК-полимеразы с ДНК и факторами Ale фага Т4 и gp2 фага T7. Локализованы участки РНК-полимеразы, окружающие ион магния, участвующий в катализе. В результате этих исследований мы пришли к заключению, что эволюционно консервативные участки РНК-полимеразы формируют каталитический центр, а эволюционно вариабельные участки отвечают за взаимодействие с регуляторными белками. Это заключение полностью подтвердилось при анализе рентгеновских структур.

Особое внимание в наших исследованиях последнего десятилетия уделялось стадии элонгации РНК. Долгое время считалось, что эта стадия не представляет особого интереса с точки зрения регуляции генной активности и является относительно простым монотонным процессом, в котором присоединение очередного нуклеотидного звена к цепи РНК ничем не отличается от присоединения всех предыдущих и последующих звеньев. Интерес к стадии элонгации резко возрос после обнаружения неравномерности движения РНК-полимеразы и открытия белковых факторов, модулирующих скорость этого движения. Важным событием стала работа М. Чемберлена с соавторами которые обнаружили, что в процессе элонгации РНК-полимераза может осуществлять реакцию расщепления РНК-продукта. Нами были открыты элонгационные факторы GreA и GreB, стимулирующие этот процесс. Изучена доменная организация этих факторов. Были разработаны методы исследования структуры транскрипционного комплекса, иммобилизованного на твердом носителе. С их помощью показано, что на определенных участках матрицы РНК-полимераза переходит в нестабильное состояние, для которого характерны нарушение нормальных контактов с ДНК, резко повышенная чувствительность к фактору GreB и склонность к переходу в неактивное, так называемое арестованное состояние. Получены данные, свидетельствующие о том, что переход в такое нестабильное состояние играет ключевую роль на стадии терминации транскрипции. Установлено, что переход в нестабильное состояние обусловлен сдвигом РНК-полимеразы назад, а не ее сжатием, как одно время представлялось в рамках модели червеобразного движения РНК-полимеразы.

Незадолго до выяснения пространственной структуры РНК-полимеразы нами была предложена модель транскрипционного комплекса на стадии элонгации, которая подвела основные итоги нашей многолетней работы по исследованию химических сшивок и мутантных РНК-полимераз и послужила отправной точкой для построения молекулярных моделей, основанных на данных рентгеноструктурного анализа. Центральным элементом этой модели является гибрид между матричной нитью ДНК и растущей нитью РНК-продукта. Многие годы шли споры относительно длины этого гибрида и о его роли в определении стабильности элонгационного комплекса. Наши данные продемонстрировали, что эта длина составляет около 8 н.п.. Модель включает следующие элементы нуклеинового каркаса: передний и задний ДНК-дуплексы длиной примерно 10 н.п. каждый, РНК-ДНК-гибрид длиной 8-9 н.п., неспаренную нематричную нить ДНК длиной около 12 н. и неспаренную нить РНК позади гетеродуплекса. Предполагается, что все узлы описанного выше нуклеинового каркаса фиксируются специфическими контактами с РНК-полимеразой. Замки, фиксирующие узлы этого каркаса, должны обеспечивать не только его высокую прочность, но и способность РНК-полимеразы легко скользить относительно нуклеиновых кислот, обеспечивая расплетание и заплетание гетеро- и гомодуплексов.

Поверхностным описанием этих устройств может служить аналогия с застежкой "молнией".

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ МОДЕЛЬ ЭЛОНГАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА

Рентгеноструктурные работы открыли недоступные ранее возможности исследования структуры и функций РНК-полимераз, в частности для анализа структур низкого разрешения, видимых под электронным микроскопом, а также для интерпретации данных по контактам РНК-полимеразы с ДНК-матрицей и РНК-продуктом, полученных методом химических сшивок. Рассмотрение структуры показало, что все наши ранее опубликованные предсказания относительно общего характера организации активного центра и прилегающих к нему участков оказались правильными. Более того, на основании этих данных сразу же удалось расположить молекулу ДНК-матрицы на белке и определить направление транскрипции - от иона магния в сторону кармана, где были локализованы мутации устойчивости к рифампицину. Дополнительные эксперименты по химическим сшивкам позволили нам в содружестве с лабораторией С. Дар-ста построить пространственную модель комплекса РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами в процессе удлинения цепи РНК. При построении модели мы придерживались весьма жесткого ограничения, согласно которому ДНК-ДНК- и РНК-ДНК дуплексы имели жесткую структуру, известную для нуклеиновых кислот вне комплексов с белками, а изменений в структуре РНК-полимеразы не допускалось. Поэтому модель не претендует на детальное описание взаимодействий индивидуальных звеньев нуклеиновых кислот и аминокислотных остатков РНК-полимеразы.

Предложенная нами модель дает представление о том, где должны располагаться постулированные нами ранее замки, и ясно показывает, что для их закрывания необходимо сближение верхней и нижней челюстей РНК-полимеразы. В формировании переднего замка может участвовать стенка, а в формировании заднего замка - шип, как это показано на рисунке. Для заслонки напрашивается важная роль во взаимодействии РНК-полимеразы со шпильками РНК в процессе терминации и при паузах. В настоящее время мы занимаемся проверкой этих предсказаний.

Весной 2001 г. появились пространственные модели РНК-полимеразы II дрожжей высокого разрешения, построенные на основании рентгеноструктурного анализа кристаллов свободной РНК-полимеразы и РНК-полимеразы в элонгационном комплексе с ДНК и РНК-продуктом. Как и ожидалось, не только общая организация, но и большинство деталей структуры в районе активного центра и района, обеспечивающего удержание РНК-ДНК гибрида, у дрожжевой и бактериальных РНК-полимераз очень похожи. Существенные отличия наблюдаются на периферии, где располагаются малые субъединицы дрожжевой полимеразы, в частности в тех районах, которые обеспечивают удержание переднего и заднего ДНК-дуплекса. Анализ структур подтвердил наше предположение о том, что в процессе формирования транскрипционного комплекса происходит сближение челюстей фермента, и позволил идентифицировать шарнирные участки, ответственные за этот структурный переход. Эти данные показали, что замыкание РНК-полимеразы вокруг ДНК происходит совсем по-другому, чем в случае репликации ДНК.

ПЕРСПЕКТИВЫ

Наша долгосрочная цель при изучении элонгации заключается в выяснении динамики активного центра в этом процессе и расшифровке структурных механизмов передачи регуляторных сигналов от белковых факторов к активному центру. При выборе конкретных задач на ближайшее время мы уделили особое внимание тем деталям активного центра, в которых на фоне значительного структурного сходства бактериальной и дрожжевой РНК-полимераз, удалось обнаружить характерные отличия. В настоящее время мы пытаемся выяснить возможную функциональную роль этих различий.

В число наших ближайших задач входит также изучение центра взаимодействия РНК-полимеразы с каталитическими ионами магния. Известно, что в односубъединичных ДНК- и РНК-полимеразах синтез фосфо-диэфирной связи осуществляется при прямом участии двух близкорасположенных ионов магния, удерживаемых в каталитическом центре отрицательно заряженными аминокислотными остатками. В ДНК-полимеразе I Е. coli - это D705, D882 и Е883, в РНК-полимеразе Т7 - это D537 и D812. Участие этих остатков в хелатировании двух близко расположенных ионов магния показано ретгеноструктурным анализом. Функциональная важность этих остатков продемонстрирована с помощью мутаций. Предполагается, что ионы двухвалентных металлов играют аналогичную роль и в многосубъединичных РНК-полимеразах, однако вопрос этот изучен явно недостаточно. В наших работах с помощью расщепления белка железом, вытеснившим ион магния из состава РНК-полимеразы Е. coli, был выявлен центр удержания магния и марганца с константой диссоциации порядка 10 мМ. В этих же работах было продемонстрировано, что основную роль в формировании этого центра играет эволюционно-консервативный мотив NADFDGD бета-штрих субъединицы. Именно в этом центре был обнаружен ион металла в кристаллической структуре минимальной РНК-полимеразы Т. aquaticus. Второго иона магния у этой РНК-полимеразы не было обнаружено. Изучая свойства мутантных РНК-полимераз Е. coli, нам удалось получить данные в пользу участия в катализе двух ионов магния и построить пространственную модель их расположения в активном центре. В рамках предложенной модели удалось значительно продвинуться в понимании механизма действия белков GreA и GreB.

Планируем мы также исследования структуры центра узнавания и открывания промоторов и механизмов превращения промоторного транскрипционного комплекса в элонгационный. Для этого предполагается использовать, в частности, развиваемый в нашей лаборатории метод формаль-дегидных сшивок. Результаты этих исследований скоро получат солидную структурную базу, так как в ближайшее время ожидается публикация структуры холофермента Т. aquaticus.