Горизонтальный перенос генов в природных популяциях бактерий. Гены и транспозоны устойчивости к соединениям ртути

Реферат

по биологии на тему:

"Горизонтальный перенос генов в природных популяциях бактерий. Гены и транспозоны устойчивости к соединениям ртути"

2009

1. Горизонтальный перенос генов - фундаментальная и медицинская проблема

В настоящее время горизонтальный перенос генов между различными видами организмов рассматривается в качестве одного из основных механизмов адаптивной эволюции.

Представление о ГПГ оформилось около 30 лет назад в связи с широким использованием в лечебных целях антибиотиков и других антибактериальных препаратов. К этому времени накопилось много фактов появления в клинике устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий и их быстрого распространения от одних больных к другим, причем этот процесс был описан одновременно исследователями разных стран и континентов. Выяснилось, что устойчивые к лекарственным препаратам штаммы бактерий приобрели способность защищаться от их губительного действия с помощью различных механизмов. Один из распространенных способов защиты состоит в инактивации антибиотика посредством специфического фермента, образуемого устойчивыми клетками. Очень часто гены, кодирующие эти ферменты, расположены не на хромосоме, а на внехромосомных элементах - плаз-мидах. На рис. показано, как осуществляется инактивация ампициллина и его производных ферментом, кодируемым плазмидным геном. Плазмиды с высокой эффективностью могут перемещаться из одних бактериальных клеток в другие и придавать им новые свойства. Во многих случаях перенос происходил между бактериями, относящимися к различным видам, родам и даже семействам. Так, было обнаружено, что наследственные признаки могут передаваться не только от предков к потомкам, но и между неродственными организмами, т.е. "по горизонтали".

В последующие годы подробно исследовали способы горизонтального переноса генов, открыли и всесторонне изучили различные мобильные элементы, в том числе плазмиды и транспозоны, осуществляющие этот процесс. В настоящее время плазмиды и транспозоны широко используются для переноса генов в лабораторных условиях.

Природные штаммы бактерий, обитающие в почве и воде, отличаются от клинических и лабораторных штаммов по своему видовому составу. Кроме того, условия жизни природных бактерий существенно отличаются от условий, в которых находятся клинические и лабораторные бактерии. Значительные колебания температуры и влажности, дефицит питания, частые стрессы, вызываемые изменением погоды, приводят к тому, что скорость размножения природных бактерий часто не превышает нескольких делений в год. Поэтому ГПГ у бактерий в природных условиях, несомненно, может иметь свои характерные особенности.

Изучение переноса генов у природных бактерий представляет значительно большие трудности по сравнению с его исследованиями у клинических микроорганизмов, и полученные сведения до сих пор во многом являются противоречивыми. Остаются неизвестными масштабы этого явления, его конкретные механизмы, а также его закономерности и биологические последствия.

Исследование ГПГ в природе важно не только для понимания фундаментальных основ эволюционного процесса, но и в прикладном аспекте - для оценки экологического риска интродукции генно-инженерных микроорганизмов и растений в окружающую среду.

В Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов исследования ГПГ у бактерий, обитающих в природе, были начаты в 1983 г. Они были задуманы и инициированы Р.Б. Хесиным в развитие его представлений о роли мобильных генетических элементов в микро- и макроэволюции живых организмов, изложенных в его монографии "Непостоянство генома". В качестве модельной системы для этих исследований были избраны детерминанты устойчивости к ртути. Этот выбор был обусловлен тем, что бактерии, устойчивые к ртути, встречаются повсеместно, и их легко изолировать на селективных средах. Кроме того, уже были расшифрованы механизмы устойчивости к соединениям ртути и показано, что детоксификация различных соединений ртути осуществляется группой генов, объединенных в mer-оперон. Как схематически показано на рис., токсичные ионы двухвалентной ртути, Hg2+, попадая в клетку, восстанавливаются до менее токсичной металлической ртути, Hg°, и выделяются в окружающую среду.

Hg-г-бактерии могут жить при концентрации HgCl2 до 100 мг/л, при этом в местах их обитания происходит снижение уровня ртутного загрязнения.

Главная задача исследований, развернутых в ЛМГМ, состояла в изучении вопроса о существовании и распространенности горизонтального переноса в природе на модели детерминант устойчивости к ртути. Основные усилия были сконцентрированы на сравнительном анализе молекулярно-гене-тической структуры mer-оперонов и обеспечивающих их перенос мобильных элементов, а также на определении характера их распределения в природных популяциях бактерий.

После смерти Р.Б. Хесина в 1985 г. эту работу возглавил В.Г. Никифоров.

В результате исследований, проведенных в ЛМГМ, была собрана уникальная коллекция устойчивых к ртути штаммов бактерий и при ее комплексном изучении выявлены многочисленные случаи горизонтального переноса оперонов и транспозонов устойчивости к ртути, изолированы и подробно исследованы ранее неизвестные транспозоны, содержащие тег-опе-роны, а также изучены механизмы и закономерности их распространения в природе.

2. ОПЕРОНЫ И ТРАНСПОЗОНЫ УСТОЙЧИВОСТИ К РТУТИ, ИХ ВЫДЕЛЕНИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

2.1 Создание коллекции штаммов Нд-бактерий

Hg-r бактерии обнаружили еще в XIX в. при выяснении причины снижения эффективности лечения сифилиса ртутными препаратами. В 1968-1969 гг. были впервые выделены природные Hg-г-бактерии из почвы, и начато изучение механизмов устойчивости. К настоящему времени наиболее изучен механизм, определяемый mer-опе-ронами.

В большинстве исследований зарубежных ученых Hg-r штаммы бактерий, использованные в работах по изучению структуры mer-оперонов, выделяли из ограниченных регионов, загрязненных соединениями ртути, и соседних с ними незагрязненных водоемов и участков земли. В отличие от них мы применили глобальный подход и создали коллекцию, состоящую из небольших выборок Hg-r-бактерий, изолированных из отдаленных географических регионов, причем отбирали только штаммы, высокоустойчивые к соединениям ртути. Подобные коллекции в литературе не описаны. Трудности создания такой коллекции описаны Треворсом с соавт.

Наша коллекция содержит Hg-r штаммы, выделенные из ртутных месторождений, находящихся в горах Западного Тянь-Шаня в Киргизии, в восточном предгорье Карпат, на Северном Кавказе, в Никитовке на Украине, а также Hg-r-штаммы, выделенные из неразрабатывающихся ртутных месторождений на Камчатке и острове Кунашир. В некоторых случаях проводили отлов грызунов и земноводных, обитающих внутри или вблизи шахт, и отбирали пробы из кишечника этих животных. Позднее коллекция была дополнена штаммами, собранными вне ртутных месторождений в нескольких местах Центральной России, Северной Америки и Новой Зеландии.

Для идентификации бактерий использовали морфологические и биохимические методы. В ряде случаев определяли нуклеотидную последовательность гена 16S г РНК. Для выявления отличий между некоторыми штаммами сравнивали структуры их повторяющихся межгенных палиндромных последовательностей.

Грамотрицательные Hg-r-бактерии нашей коллекции относятся преимущественно к трем систематическим группам г-подкласса: Acinetobacter, Pseudomunadaceae, Enterobacteriaceae.

Грамположительные Hg-r-бактерии являются представителями обеих эволюционных ветвей этих бактерий - групп с высоким и низким {Bacillus, Exiguobacterium) содержанием Г + Ц в ДНК. Они были выделены из грунта Закарпатья, Подмосковья, Средней Азии, Камчатки и Курильских островов.

2.2 Выделение оперонов и траспозонов ртутной устойчивости

Как упоминалось выше, устойчивость бактерий к соединениям ртути может обеспечиваться не только присутствием тяег-оперонов, но и другими механизмами, например способностью синтезировать сероводород, как у бактерий в коллекции Треворса. Поэтому на первом этапе работы в результате анализа почти 150 штаммов грамотрицальных и грамположительных бактерий мы отобрали Hg-r штаммы, несущие mer-one-роны. О присутствии у бактерий wzer-оперонов судили по активности кодируемых ими ферментов ртуть-редуктаз.

В дальнейшем поиск оперонов и транспозонов устойчивости к ртути проводили двумя способами:

1) методом гибридизации по Саузерну: колонии бактерий или ДНК, выделенную из Hg-r-штаммов, гибридизовали с фрагментами гаег-оперонов или транспозонов в качестве специфических зондов. Затем гаег-опероны вместе с прилегающими к ним участками ДНК клонировали или ПЦР-амп-лифицировали и определяли их нуклеотидные последовательности.

2) путем выделения активных транспозонов с помощью плазмид широкого круга хозяев, переноса возникших гибридных плазмид в клетки Escherichia coli и последующего их перемещения на векторные плазмиды. Этот метод позволяет не только находить ранее неизвестные транспозоны, но и исследовать распространение как самих транспозонов, так и их составных элементов. Тем не менее этот метод практически не использовался в работах зарубежных лабораторий.

2.3 Генетическая организация тег-опероны и ртутных транспозонов

В настоящее время молекулярно-генетическая структура тег-оперонов и функции генов, входящих в их состав, в основном выяснены. Показано, что они кодируют регуляторные белки, белки транспорта иона ртути внутрь клетки, фермент ртуть-редуктазу, восстанавливающую ионы ртути в металлическую ртуть, и фермент органомеркуриат-лиазу, гидролизующую органические соединения ртути. Среди генов, входящих в состав mer-оперона, различают гены, строго необходимые для его функционирования, и гены дополнительные. Первые обязательно присутствуют во всех оперонах; вторые встречаются в них в различных сочетаниях.

Бактерии, содержащие raer-оперон без гена merB, устойчивы только к неорганическим соединениям ртути. Ген тегВ обеспечивает устойчивость бактерий и к органомеркуриатам. Некоторые штаммы могут содержать два или три отличающихся по своей структуре raer-оперона. Транспозоны, несущие wer-опероны, широко распространены среди клинических штаммов бактерий. Первые из описанных транспозонов этой группы, ѕфьПЙ и Тп27 были исследованы особенно подробно и полностью секвенированы. Предполагают, что они произошли от более просто организованных ртутных транспозонов, возникших первоначально у бактерий окружающей среды.

3. ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ МЕЖДУ РАЗЛИЧНЫМИ БАКТЕРИЯМИ

3.1 Методы тестирования ГПГ

По мере развития и совершенствования методов молекулярной биологии происходило и повышение уровня достоверности при определении фактов ГПГ. На первых этапах, помимо анализа фенотипических признаков, использовали метод сравнительного изучения полиморфизма ферментов; в настоящее время основным методом является секвенирование геномов различных организмов и их сравнительный анализ.

В наших исследованиях мы использовали два способа доказательства фактов ГПГ:

1) когда, при относительно недавнем переносе, у неродственных бактерий удается обнаружить очень сходные нуклеотидные последовательности: блоки генов, отдельные гены или их участки, а также полноразмерные плазмиды и транспозоны или их фрагменты;

2) когда в геноме бактерии обнаруживают мозаичные участки ДНК, причем сохраняется граница между последовательностями разного происхождения, а в идеальных случаях удается идентифицировать исходные донорные последовательности.

Важно, что анализ только недавних случаев ГПГ может позволить выяснить механизмы этого процесса: анализировать механизмы давно произошедшего ГПГ затруднительно из-за постоянных изменений генома, вызываемых перестройками и мутационным процессом.

Исходя из этого, мы проводили широкомасштабный поиск сходных по нуклеотидной последовательности raer-оперонов и Hg-r транспозонов у разных бактерий нашей коллекции. В этих исследованиях нами было выявлено разнообразие raer-оперонов, удалось обнаружить новые, ранее не описанные структурные варианты этих генов, найти рекомбинантные опероны и получить указания на то, что ранее тег-опероны были распространены гораздо шире, чем это наблюдается теперь, т.е. в процессе эволюции бактерий происходила их постепенная утрата.

Обнаруженные факты ГПГ позволили нам исследовать возможные механизмы этого явления. Мы выяснили внутриклеточную локализацию тег-оперонов, чтобы выявить роль плазмид в их перемещении, и анализировали нуклеотидные последовательности, окружающие опероны, чтобы выяснить, связаны ли они с транспозонами.

Для выявления случаев ГПГ мы использовали также другой, оригинальный подход - анализировали структуру функционально активных, т.е. способных к перемещению, Hg-г-транспозонов. В ходе этой работы были выделены и исследованы более 30 Hg-r-транспозонов и выявлены мозаичные транспозоны и принципиально новые структурные варианты транспозонов.

Детальный анализ мозаичных raer-оперонов и обнаруженных нами мозаичных Hg-г-транспозонов позволил выявить механизмы рекомбинации, происходящие при образовании этих структур, и, следовательно, участвующие в горизонтальном переносе.

3.2 Горизонтальный перенос тег-оперонов между непосредственными бактериями

На первом этапе исследований мы применили метод иммунологического сравнения ртуть-редуктаз различных Hg-г-штаммов бактерий. С этой целью получили антитела к пяти различным ртуть-редуктазам грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий. ).

При сравнении ртуть-редуктаз из 60 штаммов грамотрицательных и 60 штаммов грамположительных бактерий, выделенных в Киргизии, Закарпатье, на Северном Кавказе и Камчатке, было выявлено не менее 4 типов иммунологически не родственных ртуть-редуктаз и около 20 подтипов.

Электрофорез белков с последующим иммуноблоттингом показал разнообразие молекулярных масс ртуть-редуктаз, а опыты по ограниченному про-теолизу этих ферментов позволили получить более детальные сведения об их структуре и обнаружить новые структурные варианты. Эта работа впервые показала: 1) большую степень разнообразия ртуть-редуктаз, а, следовательно, и игег-оперонов; 2) отсутствие горизонтального переноса этих генов между грамотрицательными и грамположительными бактериями и даже между двумя эволюционными ветвями грамположительных бактерий; 3) дала указания на существование горизонтального переноса игег-оперонов среди неродственных бактерий из географически удаленных районов. Эти результаты были особенно важны для последующей работы с грамположительными бактериями, для изучения игег-оперонов которых долгое время отсутствовали нуклеотид-ные зонды.

Как отмечалось ранее, строгие доказательства факта ГПГ можно получить только определением нуклеотидных последовательностей предполагаемых перемещенных участков ДНК. В начале нашей работы из литературы были известны нуклеотидные последовательности только двух mer-оперонов, Тп501 иТп21. К настоящему времени нами полностью секвениро-ваны около 20 и тег-оперонов из различных грамотрицательных бактерий, а также проведен сравнительный анализ их структуры.

Результаты исследований, проведенных как в нашей, так и зарубежных лабораториях, показали высокий уровень дивергенции генов и тег-оперонов и выявили не менее 10 их различных типов. В то же время анализ относительно небольшого количества штаммов позволил обнаружить горизонтальный перенос трех типов игег-оперонов: Тп5053, Тп5041 и pKLH2. Например, почти идентичные игег-опероны рКЬН2-типа были найдены в бактериях различных систематических групп, изолированных в отдаленных географических регионах: Enterobacter cloacae в Закарпатье, Е. coli в Чикаго, Enterobacter agglomerans в Киргизии, и у Acinetohacter sp. в Саратове, в р. Волге.

После предварительного анализа игег-оперонов 25 штаммов грамположительных бактерий, относящихся к ветви с низким Г + Ц-составом, в основном бацилл, нами были полностью секвенированы 5 разных вариантов mer-оперонов. Практически идентичные игег-опероны с узким спектром действия мы обнаружили в штаммах разных видов бацилл, изолированных на Камчатке и в Средней Азии соответственно. У Exiguobacterium sp. из рудника в Закарпатье мы обнаружили игег-оперон широкого спектра действия, практически идентичный оперо-ну В. cereus RC607 из Бостонского залива в США, и позднее описанным оперонам В. megaterium МВ1 и анаэробной Clostridium butiricum Mersaru из залива Минамата в Японии.

Таким образом, при анализе относительно небольшого количества штаммов бактерий мы обнаружили факты горизонтального переноса 5 разных вариантов игег-оперонов. Основные выводы, которые позволяют сделать эти результаты: 1) распространенность горизонтального переноса тег-оперонов среди различных систематических групп природных бактерий и 2) всемирное распространение близких вариантов этих генов.

Далее, мы обнаружили, что разные типы игег-оперонов распространены неравномерно: одни встречаются повсеместно и с высокой частотой, другие - значительно реже и, в некоторых случаях, имеют, по-видимому, локальное распространение. Данные нашей лаборатории и групп Ричи и Саммерс свидетельствуют о том, что в природе наиболее часто встречается лишь ограниченное число типов игег-оперонов..

Закономерности горизонтального переноса игег-оперонов у грамотрица-тельных и грамположительных бактерий, по-видимому, сходны.

Наконец, совокупные данные нашей и других лабораторий продемонстрировали присутствие почти одних и тех же игег-оперонов не только у бактерий окружающей среды, но и в штаммах неродственных бактерий, обитающих в кишечнике животных и человека.

При исследовании грамположительных бактерий, относящихся к. родам Micrococcus, Brevibacterium и Rhodococcus, мы впервые обнаружили у бактерий широкое распространение дефектных raer-оперонов, не способных обеспечить устойчивость бактерий к соединениям ртути. На основании этих данных мы предположили, что предки современных бактерий содержали, по-видимому, необходимые им полноценные, функционирующие raer-опероны, а в процессе эволюции происходила их постепенная утрата. Действительно, в настоящее время при сиквенсе геномов различных бактерий часто обнаруживают один из генов игег-оперона, merR, расположенный внутри различных последовательностей, например, у Haemophilus influenza, Е. coli и Bacillus subtilis.

3.3 Новые транспозоны, содержащие детерминанты устойчивости к ртути

Благодаря использованию оригинальных методов и подходов, упомянутых выше, нам удалось при анализе сравнительно небольшого материала найти ранее неизвестные ртутные транспозоны, кардинально отличающиеся от транспозонов клинических бактерий по структурно-функциональной организации. Мы подробно описали четыре новых транспозона, обнаруженных нами в штаммах грамотрицательных бактерий, Тп5053, Тп5041, Тп5044 и ѕз5070 и провели их сравнительный анализ с "классическими" транспозо-нами Тп507 и Тп27.

Транспозиционный модуль Тп5053 содержит четыре гена, негомологичные генам транспозиции Тп27 и родственных ему транспозонов, и нестандартно организованную res-область. ѕз5053 обладает необычно высокой специфичностью при выборе сайта встраивания: он интегрирует преимущественно в res-сайты плазмид и транспозонов. В настоящее время Тп5053 вместе с некоторыми другими транспозонами и ретровирусами объединяют в самостоятельное семейство мобильных элементов.

Второй из найденных транспозонов, ѕф\5041, по последовательности гена транспозазы оказался близкородственным транспозону Тп4651, несущему гены деградации толуола. Тп5041 способен перемещаться в ограниченном круге бактерий-хозяев. Транспозоны Тп5041 и Тп4651 выделили в отдельную группу внутри семейства Та?.

Транспозон Тп5044, обнаруженный на Камчатке, отличается от других транспозонов как по структуре транспозиционного модуля, так и по строению raer-оперона. Последний, в дополнение к стандартному набору генов, содержит ген sigY, кодирующий белок, родственный сигма-субъединице РНК-полимеразы. Тп5044 вместе с родственными транспозонами также выделили в отдельную группу внутри семейства Та?.

Обособленное положение занимает также транспозон Тп5070. По структуре транспозиционного модуля он отличается от "классических" ртутных транспозонов. Нестандартно организован и игег-оперон Тп5070, который содержит только четыре гена, и все они транскрибируются в одном и том же направлении.

Транспозоны с генами устойчивости к ртути у грамположительных бактерий до последнего времени не были известны. Впервые в нашей лаборатории были получены данные о том, что игег-оперо-ны грамположительных бактерий сцеплены с генами транспозиции. Дальнейшие исследования, проведенные в нашей лаборатории и в Японии, полностью подтвердили вывод о том, что по крайней мере некоторые mer-one-роны грамположительных бактерий находятся в составе транспозонов, сходных с транспозонами ТпЗ-типа. К настоящему времени у грамположительных бактерий описаны четыре Hg-r-транспозона, три из которых были впервые обнаружены и исследованы в нашей лаборатории: Тп5085, ѕз5084, и ѕз5083. Мы обнаружили, что Тп5085 способен перемещаться в клетках грамотрицательных Е. coli.

В ряде исследований показано, что транспозоны, близкородственные транспозонам клинических бактерий Тп507 и Тп2/, повсеместно встречаются среди бактерий, обитающих в природе. Однако нет доказательств распространения идентичных или почти идентичных транспозонов среди бактерий различных систематических групп. Такие данные удалось получить в нашей лаборатории в ходе исследований структуры транспозонов, выделенных из Hg-r-штаммов почвенных и водных бактерий.

Два практически идентичных транспозона, ѕз5036 и ѕз5036н1 были выделены из штаммов Enterobacter cloacae и Aeromonas sp., соответственно. Эти транспозоны оказались высокогомологичными транспозону клинических бактерий, Тп3926.

В различных регионах США были обнаружены также два почвенных штамма псевдомонад, содержащие транспозоны, практически не отличающиеся от классического транспозона клинических бактерий Tn507.

Несколько случаев горизонтального переноса были выявлены и у транспозонов, относящихся к другим типам и семействам мобильных элементов. Наиболее интересны данные о всемирном распространении вариантов транспозона Тп5053 среди бактерий различных систематических групп. Эти транспозоны были обнаружены в Подмосковье, Саратове, Закарпатье и Киргизии, в США, и в Великобритании у разных видов Pseudomonas, Enterobacter sp., Xanthomonas sp. и Alcaligenes sp. Результаты частичного секвенирования нескольких из этих транспозонов показали, что они отличаются от описанного нами "классического" транспозона Тп5053 менее чем на 0,5%, что свидетельствует о сравнительно недавнем горизонтальном переносе предшественника или варианта этого транспозона.

Горизонтальный перенос транспозонов устойчивости к ртути недавно удалось обнаружить и среди грамположительных бактерий. Так, TnMERIl, обнаруженный в штамме В. megaterium МВ1, отличается от Тп5085 из Exigoubacterium sp. TC38-2b только наличием интрона, в остальном они практически идентичны.

Полученные данные полностью подтвердили выводы о закономерностях ГПГ, сделанные на основании изучения игег-оперонов: широкую распространенность горизонтального переноса ртутных детерминант среди бактерий разных видов и родов и преобладание практически одних и тех же, "наиболее успешных" типов этих генов в разных частях земного шара.

3.4 Участие плазмид в переносе детерминант устойчивости к ртути

По литературным данным, но в основном из работ нашей лаборатории следует, что игег-опероны часто находятся на плазмидах.

Многие из них способны обеспечить горизонтальный перенос, генов устойчивости к ртути между различными штаммами и видами природных бактерий. Так, конъюгативные плазмиды, обладающие широким кругом хозяев, были обнаружены в штаммах Pseudomonas, Alcaligenes, Citrobacter, Enterobacter, Acinetobacter, Ralstonia и др. Они принадлежат к различным группам несовместимости.

Сложная система распространения Hg-r-детерминант среди широкого круга бактерий была обнаружена нами у некоторых штаммов Acinetobacter, содержащих Hg-r-плазмиды двух типов: крупные и мелкие. Крупные плазмиды посредством конъюгации могли распространяться только среди штаммов различных видов ацинетобактеров; мелкие плазмиды не обладали конъюгативными свойствами, но с помощью крупных плазмид могли проникать в различные виды бактерий, в том числе далекие в систематическом отношении.

Идентичные игег-опероны рК1Л2-типа были обнаружены в составе крупных конъюгативных плазмид pKLH272 и pKLH247 у штамма Enterobacter и штамма Acinetobacter соответственно. Четыре близких варианта гаег-оперона pKLHl-типа были найдены в составе одной и той же неконъюгативной, но мобилизуемой плазмиды у разных видов Acinetobacter в разных ртутных рудниках Азии и Европы.

Наконец, мы экспериментально показали перенос ДНК неконъюгатив-ных плазмид при совместном выращивании систематически далеких бактерий Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa.

До последнего времени считали, что Hg-r-детерминанты многих грамположительных бактерий, в частности бацилл, в большинстве случаев находятся не на плазмидах, а в хромосоме.

Недавно полученные нами данные о плазмидной локализации детерминант устойчивости к ртути у нескольких штаммов бацилл, в том числе широко используемого в качестве тестерного американского штамма Bacillus cereus RC607, заставляют пересмотреть это положение.

4. РОЛЬ РЕКОМБИНАЦИИ В ГОРИЗОНТАЛЬНОМ ПЕРЕНОСЕ

4.1 Мозаичная структура mer-ПРЕСПЗПВ м распространение мозаичных mer-ПРЕСПЗПВ в природных популяциях

В тех случаях, когда удается идентифицировать родительские формы, с достоверностью можно говорить, что возникновение как отдельных мозаичных генов, так и целых оперонов или транспозонов произошло в результате рекомбинации между различными элементами, объединившимися в одной клетке в результате горизонтального переноса.

Мозаичные опероны устойчивости к ртути, содержащие участки различного происхождения, впервые были обнаружены в исследованиях нашей лаборатории при сравнительном анализе структуры Hg-r-детерминант крупных и мелких плазмид ацинетобактеров. Оказалось, что нуклеотидные последовательности Hg-r-детерминант мелких плазмид могут быть представлены в виде продукта рекомбинации между соответствующими последовательностями крупной плазмиды и mer-опе-рона, входящего в состав транспозона Tn50i. Поскольку Tn50i был исходно обнаружен в штамме P. aeruginosa, присутствие идентичных ему последовательностей в плазмидах ацинетобактеров позволяет сделать вывод о межвидовом переносе этого транспозона.

Дальнейшие исследования показали, что мозаичные опероны часто встречаются в нашей коллекции грамотрицательных бактерий. Например, в бактериях различных систематических групп, изолированных в географически отдаленных районах, мы нашли практически одни и те же игег-опероны, близкородственные игег-оперону pKLH2 и содержащие вставки других типов последовательностей. Одну из них удалось идентифицировать как последовательность Тп50/-типа.

Мозаичные игег-опероны мы обнаружили также у разных видов Pseudomonas в составе транспозонов, близкородственных Тп5041. В случае штамма ТС97 игег-оперон содержал, кроме фрагмента игег-оперона ѕз5041, участки генов плазмиды pKLH2 и плазмиды pDU1358 из клинического штамма Serratia marcescens.

Мозаичный ген ртуть-редуктазы был обнаружен нами в составе mer-оперона грамположительной В. megaterium МК64-1.

Позднее мозаичные игег-опероны были обнаружены и детально исследованы в лабораториях Ричи и Саммерс.

Таким образом, совокупные данные ЛМГМ и зарубежных лабораторий с очевидностью свидетельствуют о широком распространении мозаичных raer-оперонов у бактерий различных систематических групп.

4.2 Мозаичные транспозоны

Анализ молекулярно-генетической структуры транспозонов показывает, что многие из них являются рекомбинантами и возникли в результате взаимодействия между родственными или неродственными мобильными элементами. Впервые рекомбинантная структура была установлена у транспозона Тп507. Предполагают, что при его образовании имело место внедрение одного родственного транспозона в другой с последующим делетированием генов транспозиции первого транспозона.

Литературные данные о существовании рекомбинантных транспозонов в природе очень немногочисленны и в основном носят косвенный характер. Благодаря использованному нами оригинальному подходу к изучению Hg-r-транспозонов, нам удалось показать, что рекомбинантные транспозоны встречаются в бактериях окружающей среды с высокой частотой. Так, из 29 транспозонов, исследованных в одной из наших последних работ, 12 имели очевидные признаки рекомбинантного происхождения, например, Тп5036, Тп5041, Тп5053 и Тп5059.

Для некоторых рекомбинантных транспозонов удалось четко выявить обе исходные родительские формы. Так, было показано, что транспозон Тп5046 является мозаичным и состоит из фрагментов ДНК, близкородственных соответствующим фрагментам транспозонов Тп5044 и Тп5041.

Три из четырех известных Hg-r-транспозонов бацилл, Тп5084, Тп5083 и TnMERIl также можно считать рекомбинантными. Структура рекомбинантных транспозонов ѕю5084 и ѕю5083, изученных в нашей лаборатории, схематически представлена на рис. Видно, что оба этих транспозона имеют общего родителя - ѕз5085. ѕю5084 представляет собой в основном Тп5085, ген резольвазы и res-область которого заменены на аналогичный фрагмент неизвестного транспозона. Другой - Тп5083, возник, по-видимому, в результате сайт-специфической рекомбинации в области res-сайта между Тп5085 и значительно отличающимся от последнего транс-позоном, близким транспозону из В. firmus и содержащим гены устойчивости к кадмию. Гены транспозиции последнего всего на 60% гомологичны генам транспозициии Тп5085.

Для образования рекомбинантных wer-оперонов и транспозонов необходимо одновременное присутствие внутри бактерии двух или более этих элементов. Действительно, по нашим и литературным данным, в клетке часто обнаруживаются разные игег-опероны и транспозоны в составе одной или нескольких плазмид. А в штамме Е. coli CH-210 мы обнаружили два транспозона, Тп5057 и Тп5059, относящиеся к различным семействам мобильных элементов; первый находится в хромосоме, второй - на плазмиде.

Все полученные данные о мозаичных игег-оперонах и транспозонах явились подтверждением вывода о распространенности горизонтального переноса Hg-r-детерминант в окружающей среде и позволили выяснить механизмы рекомбинации, участвующие в горизонтальном переносе этих генов.

4.3 Механизмы рекомбинации, участвующие в горизонтальном переносе генов

Подробное исследование структуры рекомбинантных mer-оперонов и Hg-r-транспозонов позволяет в ряде случаев хотя бы частично расшифровать историю их возникновения. Ряд данных указывает на участие системы гомологичной рекомбинации при возникновении мозаичных генов, например, в случаях mer-оперонов и транспозонов, содержащих последовательности pKLHl- и рКЪН2-типов, raer-оперона транспозона Тп5083, а также генов транспозиции Тп5084.

Присутствие в составе транспозона последовательности, гомологичной концевому повтору другого транспозона, свидетельствует о том, что при его возникновении произошло внедрение одного транспозона в другой, неродственный ему, путем транспозиции. Таково, по-видимому, происхождение транспозона Тп5053 и, возможно, Тп5041.

Мозаичная структура res-области транспозонов ѕз5036, ѕз5059 и ѕз5083 указывает на то, что при их возникновении происходила сяйт-специфическая рекомбинация между двумя res-сайтами, по-видимому, res-сайтами двух разных транспозонов. Транспозоны с гибридными res-сайтами встречались в нашей коллекции с высокой частотой.

Во многих случаях при возникновении рекомбинантных транспозонов, несомненно, имели место несколько последовательных актов рекомбинации, механизм которых не всегда понятен, например, при формировании Тп5053 и Тп5083.

Данные, недавно полученные в нашей лаборатории, указывают на то, что в процессах горизонтального переноса генов могут участвовать также и системы резолюции. В плазмидах ацинетобактеров, поблизости от дефектных Hg-r-транспозонов, Г.Я. Холодий обнаружил новую систему резолюции CinH/RS2 и исследовал особенности ее функционирования. Оказалось, что, резольваза CinH в отличие от других резольваз, характеризуется низкой избирательностью при выборе res-сайтов и в связи с этим обладает способностью не только разрешать коинтеграты, но и объединять в них разнообразные плазмидные репликоны. Последующее разъединение образовавшихся коинтегратов может приводить к перераспределению генетического материала исходных плазмид и как следствие к возникновению новых плазмид, в том числе с широким кругом хозяев. Таким образом может происходить перемещение дефектных Hg-r-транспозонов и других генетических структур среди систематически отдаленных бактерий.

Заключение

К настоящему времени стала известна последовательность хромосом более 50 видов бактерий и ряда плазмид. В результате одним из самых существенных выводов, вытекающих из сравнительного анализа целых геномов, явилась оценка роли горизонтального переноса генов в эволюции микроорганизмов - оказалось, что эта роль гораздо более значима, чем думали раньше. Геномика показала эволюционное разнообразие генов-"пришельцев", их предполагаемую долю в геноме и их локализацию. Например, в геноме хламидий, патогенов человека и животных, предполагают присутствие около 30 эукариотических генов, часть из которых была перенесена, по-видимому, из растений. Возможно, на ранней стадии эволюции хламидий были патогенами одноклеточных растительных организмов и лишь потом стали патогенами животных. В результате се-квенирования генома бактерии Thermotoga maritima обнаружили, что четверть ее генов, возможно, была перенесена из представителей другого царства живых организмов - из архебактерий. Эти "островки" и "архипелаги" чужих геномов размером от 4 до 20 тыс. пар нуклеотидов находятся в 15 участках генома термотоги.

Геномика показала также большую роль, которую играли мобильные элементы в эволюции бактерий. Например, в хромосомах Bacillus halodurans и цианобактерии Synechocystis обнаруживаются около 100 генов транспозаз и их фрагментов. У Sinorhizobium meliloti эти гены составляют около 2% генома. /5-подоб-ные элементы обнаружены и в хромосоме высокорадиорезистентных Deinococcus radiodurans. Наконец, в хромосоме Bacillus subtilis были выявлены, по крайней мере, 10 профагов или их фрагментов, что указывает на участие трансдуцирующих фагов в эволюции этой бактерии.

В то же время ограниченный круг секвенированных геномов не позволяет оценить роль ГПГ в популяционной динамике и эволюции бактерий окружающей среды, остаются не ясны масштабы, распространенность и движущие силы этого процесса. Современная геномика не позволяет сделать заключений и о конкретных механизмах ГПГ, которые оказываются "скрытыми" последующими перестройками генома и мутационным процессом. Даже выводы геномики об источниках "генов-пришельцев" далеко не всегда кажутся обоснованными, например, часто не учитывается возможность существования общего предка или возможность конвергентной эволюции белков. Ряд исследователей даже полагают, что в работах, цитированных выше, роль ГПГ в эволюции живых организмов явно завышена.

В будущем непрерывно продолжающееся увеличение количества секвенированных геномов, по-видимому, расширит современное представление о роли ГПГ в эволюции бактерий и даст новые примеры возможных ГПГ. Однако для выявления распространенности ГПГ в популяциях бактерий, его конкретных механизмов у разных видов бактерий, особенно бактерий окружающей среды, и движущих сил этого процесса необходимо сравнение геномов различных бактерий из разных популяций, в том числе близких систематически, и обитающих в отличающихся экологических условиях и в географически удаленных регионах. Коллекция бактерий, устойчивых к соединениям ртути, созданная в нашей лаборатории, удовлетворяет всем этим требованиям и подготовлена к такой работе.

Интересно отметить, что в Японии недавно начаты и проводятся широким фронтом работы по изучению ГПГ на примере игег-оперонов из бактерий залива Минамата.

Наш подход заключается в поиске и анализе только бесспорных фактов относительно недавнего ГПГ - когда у разных штаммов, видов, родов организмов удается обнаружить достаточно протяженные идентичные или почти идентичные нуклеотидные последовательности генов, которые сами по себе достаточно дивергенты, т.е. в большинстве случаев значительно отличаются у разных организмов. Поэтому решение поставленных вопросов требует принципиального увеличения масштабов секвени-рования геномов. По-видимому, упрощение и удешевление методов автоматического секвенирования позволит проводить секвенирова-ние большого количества и значительно более протяженных фрагментов хромосомных и плазмидных геномов природных бактерий, чем это было возможно до недавнего времени.

Дальнейшее изучение проблемы ГПГ у бактерий окружающей среды должно быть направлено на выяснение прежде всего 1) вклада ГПГ в динамику генотипов популяций, 2) оценку скорости изменения генотипов, 3) механизмов этого явления. Полученные результаты, возможно, позволят прогнозировать влияние интродуцируемых человеком генно-инженерных эукариотических и прокариотических организмов на природные бактерии окружающей среды.