Кластер семенник-специфичных генов у дрозофилы

Реферат

по биологии на тему:

"Кластер семенник-специфичных генов у дрозофилы"

2009

Введение

Сперматогенез, т.е. процесс образования спермы из терминальных стволовых клеток, протекает в семенниках у млекопитающих и у дрозофилы сходным образом. На рис. схематично показаны стадии этого процесса у дрозофилы. На первом этапе стволовая клетка делится, воспроизводя себя и давая начало сперматогониальной клетке. Сперматогониальные клетки проходят несколько митотиче-ских делений и вступают в стадию первичных сперматоцитов. На этом этапе идет активная подготовка к мейозам. Происходит 25-кратное увеличение клеток в объеме, сопровождаемое активной транскрипцией множества генов. Часть синтезированных мРНК транслируется на этой же стадии, в то время как другая, большая, часть служит матрицами для синтеза белков на более поздних стадиях сперматогенеза, на которых транскрипция практически не идет. Происходит так называемая "отложенная трансляция" этих мРНК. После того как сперматоциты созрели, т.е. накопили все необходимое для последующих превращений, в них осуществляются два последовательных мейотических деления, после завершения которых клетки вступают в стадию ранних сперматид.

На этом этапе множество митохондрий сливаются в две гигантские митохондрии, видимые под микроскопом в виде темного образования рядом с ядром. Затем происходит ряд морфологических изменений, сопровождающих дифференцировку сперматид в зрелую сперму. В первую очередь, это образование хвостика спермия, сформированного преимущественно из белка Р2-тубулина. Для придания подвижности спермиям хвостики совершают колебательные движения, для которых необходима энергия. Запасение энергии осуществляется в слитых в единую структуру митохондриях, которые в ходе дифференцировки сперматид распределяются вдоль всей длины их хвостиков. В это же время происходит компактизация хроматина в ядре, расположенном в головной части сперматид. Наконец, на последнем этапе созревания сперматид происходит их "индивидуализация". До этого пучки из 64 сперматид были покрыты общей оболочкой, внутри которой находилась единая цитоплазма, в результате чего каждая гаплоидная сперматида получала одинаковый, и независимый от ее хромосом, набор факторов для своей дифференцировки. На этапе "индивидуализации" у каждой сперматиды образуется своя собственная цитоплазматическая мембрана, а ненужная цитоплазма выдавливается в мешок, образующийся из остатков общей оболочки. Созревание спермы завершается.

Транскрипционная активация множества генов в первичных сперматоцитах необходима для синтеза практически всего материала, формирующего зрелую сперму. Поэтому один из ключевых вопросов, необходимых для понимания процесса сперматогенеза, состоит в следующем: каким образом на этапе первичных сперматоцитов осуществляется транскрипция массы молчащих до этого генов? К сожалению, здесь в наших знаниях имеется еще множество пробелов. У дрозофилы известен ряд генов, таких, например, как always early, и cannonball, мутации которых блокируют транскрипцию большинства известных семенник-специфичных генов. Ген aly кодирует белок, предположительно участвующий в изменении структуры хроматина. Возможно, что белок Aly необходим для перевода хроматина сперматоцит-специфичных генов в декомпактизованное, транскрипционно-активное состояние, которое является необходимой предпосылкой для последующей активной экспрессии этих генов. Однако декомпактизованное состояние хроматина является необходимым, но не достаточным условием массированной транскрипции генов на стадии первичных сперматоцитов. Здесь требуются белковые факторы, способные непосредственно взаимодействовать с регуляторными элементами конкретных генов, чтобы инициировать их транскрипцию. Действительно, охарактеризованный недавно белковый продукт гена оказался семенник-специфичным транскрипционным фактором. Если он в самом деле участвует в распознавании промоторных областей генов, экспрессирующихся в ходе сперматогенеза, то эти области должны иметь сходные нуклеотидные последовательности. Проведенные исследования показали, что рядом со стартом транскрипции нескольких таких генов находится короткая последовательность, необходимая для транскрипции этих генов в семенниках. Однако все еще не ясно, насколько такая последовательность универсальна и какие белковые факторы с ней связываются.

В ходе наших исследований у дрозофилы был обнаружен кластер генов, экспрессирующихся в ходе сперматогенеза. На этой модельной системе мы исследуем механизмы транскрипционной регуляции семенник-специфичных генов. Изучаются как промоторные области генов, входящих в кластер, с целью выявления в них участков, необходимых для транскрипции в семенниках, так и дальнодействующие транскрипционные регуляторы, вероятно, присутствующие в кластере. Предполагается также исследование состояния хроматина в кластере на разных стадиях сперматогенеза. Мы надеемся, что раскрытие системы активации транскрипции в первичных сперматоцитах у самцов дрозофилы позволит в дальнейшем легче понять механизм транскрипционной регуляции, действующий в ходе образования спермы у млекопитающих и человека.

Кластерная организация семенник-специфичных генов у дрозофилы

Примеры кластеров

В настоящее время у различных организмов известно множество примеров скоплений на хромосомах, родственных по последовательности и сходных по функциям генов. Обычно такие кластеры сформированы последовательно повторенными множество раз копиями, либо представлены менее регулярно организованными, содержащими меньшее число копий и менее сходными по последовательности генами. Как правило, гены, входящие в кластер, экспрессируются в определенной ткани, либо на определенной стадии развития. В этих случаях предполагается, а иногда и показано существование в кластере общих регуляторных элементов, в число которых входят энхансеры, активирующие транскрипцию в определенный момент развития или в определенной ткани, и инсуляторы, защищающие гены кластера от влияния внешних по отношению к генам кластера энхансеров. Однако известны примеры кластеров генов, имеющих общие регуляторные элементы, но экспрессирующихся при этом в разных тканях, органах или на разных стадиях развития. Так, ген, кодирующий гормон роста человека, экспрессируется в гипофизе, в то время как родственные ему гены, входящие в единый с ним кластер и имеющие общие с ним регуляторные элементы, экспрессируются в плаценте.

Известно лишь несколько примеров кластерной организации генов, экспрессирующихся в ходе сперматогенеза. Так, у дрозофилы описан кластер из четырех Mst84D-reHOB, экспрессирующихся в семенниках и кодирующих белки, существенные для подвижности спермы. У мыши известен кластер из трех сперматоцит-специфичных генов, кодирующих протамины. В обоих случаях кластеры сформированы родственными генами и, вероятно, образовались в результате нескольких актов локальных дупликаций исходного предкового гена с последующим накоплением различий между копиями.

Кластер из пяти неродственных генов, активированных на определенной стадии сперматогенеза

В ходе наших исследований у дрозофилы был обнаружен участок хромосомы, состоящий из пяти генов, экспрессирующихся только в ходе сперматогенеза. По признаку экспрессии в определенной ткани эти гены можно объединить в семенник-специфичный кластер. При этом гены, входящие в кластер, оказались неродственны между собой, что является первым примером такого рода организации. Работа была начата, когда выяснилось, что изучаемый нами ген CK2?tes, кодирующий семенник-специфичную регуляторную субъединицу казеинкиназы 2, расположен на хромосоме 2 дрозофилы вблизи гена Pros28.1B, кодирующего одну из семенник-специфичных субъединиц ответственного за расщепление отработавших в клетке белковых молекул протеасомного комплекса. Проведенный нами анализ показал, что в непосредственной близости от этих генов находятся три новых гена с неизвестными функциями, которые также экспрессируются исключительно в семенниках самцов. Структура исследуемого кластера приведена на рис.

К кластеру с обеих сторон примыкают гены, экспрессирующиеся во всех тканях взрослых мух, обозначая, таким образом, вероятные границы семенник-специфичного домена. Можно предположить, что элементы, расположенные на границах этого домена, проявляют свойства инсуляторов, т.е. способны защищать гены кластера от влияния активаторов транскрипции, расположенных вне его и работающих в других тканях и органах, либо, наоборот, ограждать внешние гены от гипотетического активатора, находящегося внутри кластера. Нахождение в одном коротком хромосомном фрагменте пяти неродственных друг другу генов, экспрессирующихся в семенниках, предполагает существование внутри кластера общего для всех генов тканеспецифичного энхансера, активирующего их транскрипцию на определенной стадии сперматогенеза.

В пользу существования энхансера и инсуляторов в кластере свидетельствуют также результаты компьютерного предсказания участков связывания с ядерным матриксом в исследуемом районе. Считается, что это места прикрепления ДНК к белковому слою, выстилающему ядерную мембрану, которые создают определенную пространственную структуру хромосом в ядре, тем самым регулируя активность расположенных на хромосомах генов. Известно, что такие места часто совпадают по локализации с участками, выполняющими функции энхансеров и инсуляторов. В нашем случае такие предсказанные места находятся на границах кластера и внутри него.

Как уже упоминалось, пять генов, входящих в кластер, неродственны между собой. Тем не менее они экспрессируются в генеративной ткани самцов дрозофилы на определенной стадии сперматогенеза, что предполагает существование общих для всех генов регуляторных элементов. Можно думать, что исходно в данном районе существовали один-два гена, промоторы которых активировались семенник-специфичным энхансером, а влияние на эти гены окружающих последовательностей, либо влияние энхансера на соседние гены, ограничивалось расположенными вокруг инсуляторами. В ходе эволюции генома в результате случайных транспозиций душшцированных копий клеточных генов в участок хромосомы, в котором находился семенник-специфичный энхансер, новые реплики приобрели способность к экспрессии в семенниках. Возможно, именно так возник описываемый кластер семенник-специфичных генов.

Эта гипотетическая схема подтверждается существованием в геноме дрозофилы по меньшей мере двух экспрессирующихся во всех тканях генов, от которых произошли тканеспецифичные гены кластера. Так, ген CK2?tes возник около 50 млн лет назад в результате дупликации гена, кодирующего представленную во всех клетках в-субъединицу СК2, и внедрения реплики в район хромосомы, где теперь находится описываемый кластер. При этом, ген-реплика, в отличие от исходного гена, приобрел способность транскрибироваться только в семенниках. Другой семенник-специфичный ген кластера, Pros28.1B, также образовался вследствие внедрения в район будущего кластера реплики гена Pros28.1, в различных типах клеток кодирующего субъединицу протеасомы. Таким образом, представляется, что образование тканеспецифичных кластеров по описываемому выше механизму должно происходить достаточно часто в ходе эволюции геномов.

Как было сказано выше, помимо трех новых генов с неизвестной функцией, в кластер входит ген, кодирующий одну из семенник-специфичных субъединиц протеасомы - белкового комплекса, ответственного за расщепление ненужных клетке, отработавших свое белковых молекул. Известно, что такие белки "помечаются" пришиваемыми к ним молекулами убиквитина, что и является для протеасомы сигналом для их расщепления. Однако в недавней работе было обнаружено, что многие транскрипционные факторы также метятся молекулами убиквитина, и это является необходимым условием для осуществления этими факторами активной транскрипции. Кроме того, появились данные, показывающие необходимость присутствия самой протеасомы для проведения транскрипции РНК-полимеразой. Эти результаты свидетельствуют об участии протеасом не только в процессе белковой деградации, но и в процессе регуляции транскрипции. В этой связи роль семенник-специфичной субъединицы протеасомы Pros28.1B еще предстоит выяснить. Помимо вышеперечисленных генов в описываемый кластер входит также ген CK2?tes, кодирующий регуляторную субъединицу казеинкиназы 2, функционирующую в сперматогенезе дрозофилы.

Казеинкиназа 2 и ее роль в сперматогенезе дроздофилы

Около трети всех белков в эукариотической клетке фосфорилированы, т.е. содержат фосфатные группы, связанные с аминокислотными остатками тирозина, серина либо треонина. Такие модификации изменяют свойства белков, и, таким образом, выполняют определенные регуляторные функции. Так, например, широко известна роль фосфорилирования в регуляции клеточного цикла, дифференцировке и передаче сигнала. Фосфорилируют белки сотни различных протеинкиназ, причем некоторые из них строго специфичны в отношении какого-либо одного белка, в то время как другие могут модифицировать несколько белков. Казеинкиназа 2 -одна из первых обнаруженных протеинкиназ, была названа так из-за своей способности фосфорилировать белок молока казеин. Позже выяснилось, что казеин является далеко не единственным и не главным физиологическим субстратом СК2. Среди белков, фосфорилируемых СК2, оказались РНК-полимеразы, ДНК-топоизомеразы, факторы трансляции и транскрипции, белки, участвующие в передаче сигнала, белки цитоскелета, хроматина и пр. Так, в недавней работе было показано, что СК2 фосфорилирует ДНК-связывающий белковый домен у многих транскрипционных факторов и это приводит к изменению их способности связываться с ДНК и, таким образом, стимулировать транскрипцию. В целом казеинкиназа 2 фосфорилирует по остаткам серина, либо треонина более полутора сотен клеточных белков, что делает ее достаточно уникальной, если не единственной в своем роде. Она представляет собой крайне интересный объект для исследований, поскольку вовлечена в такие различные процессы, как раковое перерождение клетки, передача сигнала, контроль транскрипции, апоптоз, регуляция клеточного цикла и другие.

СК2 большинства организмов представляет собой тетрамер, состоящий из двух каталитических а- и/или а-субъединиц и двух в-субъединиц, играющих регуляторную роль. У дрожжей S. cerevisiae имеется также другая регуляторная в-субъединица, а у растений в геноме находятся три гена, кодирующие разные в-субъединицы СК2.

Данные биохимических экспериментов свидетельствуют, что регуляторные субъединицы СК2 увеличивают стабильность, активность и специфичность действия каталитических субъединиц. В то же время каталитическая субъединица СК2 обладает заметной фосфорилирующей активностью сама по себе, что поднимает вопрос о возможности существования клетки вообще без регуляторных субъединиц СК2. Известно, что инактивация обоих генов каталитических а- и а'-субъединиц у S. cerevisiae летальна, хотя "выключение" гена лишь б-субъединицы не влияет на жизнеспособность дрожжей, но делает их чувствительными к изменениям температуры. Мутации, одновременно инактивирующие гены обеих в-субъединиц СК2, не приводят к каким-либо заметным фенотипическим проявлениям у дрожжей при росте на нормальной среде; в то же время дрожжи становятся более чувствительными к концентрации в среде солей Na+ и Li+. У S. pombe, где имеется по одному гену для а- и в-субъединиц, мутации по гену б-субъединицы летальны. Делеция гена в-субъединицы у S. pombe приводит к замедлению скорости роста и повышенной чувствительности к холоду.

Резюмируя данные по мутациям генов регуляторных и каталитических субъединиц у дрожжей, можно сказать, что полная инактивация каталитической активности СК2 является летальной для клетки, в то время как частичное снижение этой активности, связанное с "выведением из строя" регуляторных субъединиц, приводит лишь к некоторым изменениям фенотипа.

Максимальная фосфорилирующая активность казеинкиназы 2 у млекопитающих наблюдается в семенниках. В этой связи особенно интересны данные работы Хью с соавторами. Оказалось, что ген а'-субъединицы СК2 у мышей наиболее активно экспрессируется на поздних стадиях сперматогенеза. У особей с искусственно инактивированным геном не было выявлено каких-либо аномалий развития, за исключением нарушений сперматогенеза. У самцов наблюдаются олигоспермия и глобозооспермия, что приводит к стерильности. Вероятно, одна из двух каталитических субъединиц СК2 у млекопитающих является специфичной и необходимой для сперматогенеза, обеспечивая максимальную фосфорилирующую активность в семенниках.

В согласии с этими результатами находятся другие данные, показывающие что количество регуляторной в-субъединицы СК2 у млекопитающих в ?семенниках также максимально по сравнению с другими тканями. Мы задались вопросом, какие субъединицы СК2 функционируют в процессе сперматогенеза у дрозофилы. В геноме D. melanogaster нами был обнаружен ген CK2?tes, родственный гену в-субъединицы СК2 и предположительно кодирующий регуляторную субъединицу казеинкиназы 2, специфичную для процесса сперматогенеза. Эволюционный анализ показал, что около 50 млн лет назад предшественник гена CK2?tes возник у дрозофилы в результате вставки в геном копии гена основной в-субъединицы СК2, причем образование копии происходило с участием процесса обратной транскрипции. Позднее, в результате размножения реплики гена CK2?tes, попавшей в половые хромосомы дрозофилы, в Х-хромосоме возникли кластеры семенник-специфичных генов с неизвестной функцией Stellate, а в Y-xpoмосоме - кластер их супрессоров Su..

Эволюционное древо генов, родственных регуляторной субъединице казеинкиназе 2, у D. melanogaster

Ген CK2?tes действительно кодирует семенник-специфичную субъединицу СК2 у дрозофилы. Белок ?tes связывается с каталитической субъединицей СК2 in vitro и in vivo, и взаимодействие субъединиц приводит к стимуляции фосфорилирующей активности СК2. Таким образом, fites - это первая известная тканеспецифичная регуляторная субъединица СК2. В недавней работе показано существование у дрозофилы еще одного гена, кодирующего белок, родственный в-субъединице СК2. Проведенные нами эксперименты продемонстрировали, что эта третья в-субъединица, так же как и CK2?tes, экспрессируется только в семенниках самцов дрозофилы. Таким образом, в действительности у дрозофилы имеется одна экспрессирующаяся во всех тканях и две семенник-специфичных регуляторных субъединицы СК2.

Данные на млекопитающих и на дрозофиле свидетельствуют, что наибольшая концентрация молекул регуляторной субъединицы СК2 требуется именно в ходе сперматогенеза. Для чего же необходимо такое большое количество и разнообразие в-субъединиц СК2 в семенниках? К сожалению, ответ на этот вопрос пока неизвестен. Как было сказано выше, мутации по гену регуляторной субъединицы СК2 получены лишь у дрожжей. Мы попытались искусственно снизить количество в/Я'5-субъединицы в семенниках самцов дрозофилы. Для этого были получены мухи, экспрессирующие в семенниках "антисмысловую" РНК CK2?tes. У трансгенных самцов количество ?fes-cyбъeдиницы СК2 оказалось сниженным в семенниках в 3-5 раз. Однако, как выяснилось, такое снижение не привело к стерильности самцов. Вероятно, для ответа на вопрос о необходимости регуляторных субъединиц казеинкиназы 2 для нормального прохождения сперматогенеза требуется полностью инактивировать CK2tyes-ген, а еще лучше - оба гена семенник-специфичных субъединиц СК2.

Заключение

Из данных статистических исследований известно, что примерно каждая шестая пара, находящаяся в репродуктивном возрасте, страдает бесплодием. Среди причин мужского бесплодия можно отметить мутации по генам, участвующим в сперматогенезе, хромосомные абберации, органические нарушения семенного тракта, гормональные нарушения, нарушения эрекции. Если пара хочет иметь ребенка, то многие из этих проблем могут быть обойдены с помощью современных методов медицины, в частности с помощью метода внутрицитоплазматического введения спермы в зрелую яйцеклетку. Оказывается, что достаточно одного сперматозоида для проведения искусственного оплодотворения яйцеклетки, с последующей имплантацией развивающегося эмбриона в матку матери и рождения здорового ребенка. Поэтому, даже в случае азооспермии, т.е. практически полного отсутствия спермы, у мужчины сохраняется шанс стать отцом. Однако во многих случаях мутации, блокирующие сперматогенез на ранних стадиях, приводят к тому, что в семенной жидкости отсутствуют даже единичные зрелые сперматозоиды. Учитывая такие ситуации, в лабораториях всего мира ведутся попытки доращивания in vitro спер-матоцитов, взятых у страдающих азооспермией мужчин, до стадии зрелых сперматид с последующим оплодотворением ими яйцеклеток будущих матерей. К сожалению, такие попытки часто заканчиваются неудачами. Вероятно, в некоторых случаях, например когда мутация затрагивает структурный белок аксонемы, такие попытки принципиально неосуществимы. Потенциально здесь могли бы помочь генотерапевтические подходы, при которых в геном мужской генеративной стволовой клетки in vitro вводился бы ген, корректирующий дефект созревания спермы. Затем трансформированная стволовая клетка переносилась бы в семенники страдающего данным типом бесплодия мужчины и дифференцировавшись, приводила бы к появлению у него нормальной спермы. Следует отметить, что описываемый подход не является научно-фантастическим. Так, расширение наших знаний о генах, участвующих в сперматогенезе, приводит ко все большим возможностям генодиагностики нарушений плодовитости у мужчин. Трансформация стволовых клеток нужным геном также не является непреодолимой проблемой. Да и перенос терминальных стволовых клеток в семенники в настоящее время технически возможен. Тем не менее описываемая схема является чисто гипотетической, поскольку сегодня на подобного рода генотерапевтические эксперименты наложен запрет по этическим соображениям. Как известно, в большинстве стран законодательно запрещены целенаправленные изменения генома человека, передающиеся по наследству. Очевидно, пока такое ограничение существует, человеческое сообщество будет избавлено от ряда этических и юридических проблем, но при этом люди будут недополучать потенциально возможную медицинскую помощь. В любом случае, расширение наших знаний о генах и белках, функционирующих в ходе сперматогенеза, является безусловно необходимым. Как уже упоминалось, процесс образования спермы протекает у дрозофилы и млекопитающих сходным образом, поэтому исследования, проводимые в этой области на дрозофиле, могут существенно расширить наши представления и о механизмах регуляции сперматогенеза у млекопитающих и человека.