Ферменты как метки в иммуноанализе

Реферат

по биологии

на тему:

Ферменты как метки в иммуноанализе

1. Основные физико-химические и каталитические свойства ферментов

Структура ферментов. В активном центре фермента, образованном сближенными и определенным образом ориентированными в пространстве участками полипептидной цепи, происходит связывание субстрата и его химическое превращение. Иногда в состав таких центров входят так называемые кофакторы -- низкомолекулярные органические вещества довольно сложного строения или неорганические ионы.

Кофактор, прочно связанный с белковой глобулой {апоферментом) и остающийся в неизменном состоянии после каталитического акта, называют простетической группой.

Примером такой простетической группы может служить молекула гема, принимающая участие, например, в катализе пероксидазой:

В некоторых случаях кофактор менее прочно удерживается в активном центре и химически изменяется в результате протекания каталитической реакции. Такие специализированные для данного класса ферментов субстраты получили название коферментов. К наиболее распространенным из них относятся ATP:

и NAD+:

Эти два кофермента нашли также самостоятельное использование в качестве меток в иммуноанализе.

В результате целого набора взаимодействий между отдельными частями полипептидной цепи, в которых определенную роль играет и растворитель, фермент принимает специфическую активную конформацию и способен эффективно осуществлять превращение субстрата! Однако, если условия окружающей среды изменяются таким образом, что часть из этих взаимодействий нарушается или отсутствует, нативная конформация молекулы существенно меняется, при этом способность фермента осуществлять каталитическое превращение субстрата падает. Такой процесс называют денатурацией. Факторами, вызывающими денатурацию. В более широком плане можно говорить об инактивации ферментов, т. е. потери ими каталитической способности, которая может быть обусловлена как денатурацией, так и химической модификацией отдельных функциональных групп молекул фермента.

В иммуноферментном анализе введение ферментной метки осуществляют путем ковалентного связывания молекулы фермента с молекулой антигена или антитела, При этом оно должно проводиться таким образом, чтобы модификация фермента не вызывала его инактивации. В водном растворе молекулы белков обладают структурой, при которой в поверхностном слое располагаются преимущественно гидрофильные боковые цепи отдельных аминокислотных остатков, часть из которых находится в ионизированном состоянии. Среди этих функциональных групп наиболее удобными для связывания являются е-аминогруппы лизина, карбоксильные группы аспарагинового или глутаминового остатков, SH-группа цистеинового остатка. Очевидно, что такая модификация не должна затрагивать функциональных групп активного центра, а также влиять на каталитически активную конформацию всей ферментной глобулы.

Каталитические свойства ферментов. Общую схему ферментативной реакции обычно записывают следующим образом:

где Si и S2 -- субстраты; Pi и P₂ -- продукты ферментативной реакции; E -- фермент.

Для многих ферментов в качестве одного из субстратов выступает вода, поэтому, ввиду того, что ее концентрация велика и постоянна в ходе ферментативной реакции, часто такие реакции рассматривают как псевдомоносубстратные. Для целых классов ферментов вторыми специализированными субстратами являются молекулы коферментов.

Весьма важной и часто используемой на практике характеристикой препаратов является каталитическая активность фермента.. За единицу каталитической активности любого фермента принимают такое его количество, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в 1 с в реакционной системе при определенных условиях. Наиболее удобным для практических целей является нанокаталь. Однако до сих пор часто употребляется старое обозначение каталитической активности, известное как «международная единица» определенное как количество фермента, катализирующее превращение 1 ммоль субстрата в 1 мин. Соотношение между этими единицами следующее:

* 1 нкат=10-⁹ кат=0,06.

Для сравнительной оценки различных препаратов фермента часто используют удельную каталитическую активность, т. е. каталитическую активность, отнесенную к единице массы белка.

Согласно приведенному выше определению каталитическая активность не тождественна понятию скорости ферментативной реакции, которая определяется как количество субстрата, превращаемого ферментом за единицу времени в единице объема системы, в которой протекает реакция. На скорость ферментативной реакции оказывают влияние различные факторы, среди которых основными являются температура, природа буфера и рН, субстраты, коферменты, ингибиторы й другие эффекторы, а также количество белка в системе.

Температура. Влияние температуры на скорость обычных химических реакций описывается зависимостью Аррениуса:

В случае ферментов температурные зависимости скорости имеют более Наложный вид, что обусловлено как термолабильностью белковых глобул, так и влиянием температуры на константы

Михаэлиса, константы скоростей распада отдельных фермент-субстратных комплексов и положение рН-оптимума. В области низких температур, когда структура активного центра достаточно стабильна, константа скорости распада фермент-субстратного комплекса описывается уравнением типа Аррениуса. Среднее значение эффективной энергии активации для ферментативных процессов обычно близко к 40 кДж/моль. Как правило, зависимость скорости ферментативных реакций имеет температурный оптимум, обусловленный тепловой денатурацией фермента.

Буфер и рН. Все ферменты характеризуются определенным рН-оптимумом активности. Этот диапазон максимальной активности может иметь весьма узкий интервал. рН-Оптимум активности зависит от ионной силы, вида используемого буфера и меняется с температурой. Например, для щелочной фосфатазы рН-оптимум при температурах 37, 30 и 25°С составляет 9,9; 10,1 и 10,3 соответственно.

Субстраты. Определяемая каталитическая активность фермента сильно зависит от используемого субстрата. Субстраты данного фермента могут быть как природными, так и синтетическими, при этом скорости их превращения также значительно варьируют. Например, фермент в-П-галактозидаза гидролизует синтетические субстраты 2-нитрофенил-р-?)-галактозид и 4-нитрофенил-р-1)-га-лактозид соответственно в 7 и 17 раз быстрее, чем естественный субстрат лактозу.

Эффекторы. К эффекторам относят как ингибиторы, так и активаторы ферментативных реакций, т. е. вещества, оказывающие замедляющее или ускоряющее действие на превращение субстрата. Эффекторы могут вноситься в реакционную среду как с растворами реагента, так и анализируемого образца. В некоторых случаях для ферментативных реакций наблюдается ингибирование высокими концентрациями субстрата или одним из продуктов реакции. Наличие в реакционной среде эффекторов может приводить к нежелательному отклонению от линейной зависимости наблюдаемой скорости ферментативной реакции от количества фермента в системе.

Экспериментальные методы определения ферментативной активности. В иммуноферментном анализе наибольшее распространение получил фотометрический метод регистрации активности ферментов. В качестве субстратов ферментов при этом используют такие вещества, продукты превращения которых являются окрашенными соединениями или, наоборот, окраска самих субстратов изменяется в процессе реакции.

Окрашенные соединения поглощают видимый свет, т. е. электромагнитное излучение с длинами волн 400--700 нм. При прохождении пучка света через кювету раствора толщиной d интенсивности прошедшего света / по сравнению с начальной интенсивностью I₀ связана законом Бугера--Ламберта-Бера:

I=f_Q-10~^,dC, где е -- постоянная для данного вещества в определенном растворе величина, называемая молярным коэффициентом поглощения; С -- концентрация вещества, поглощающего свет. На практике часто измеряют оптическую плотность, которая связана с / и Io следующим простым соотношением:

Таким образом, если поглощение света подчиняется закону Бугера--Ламберта--Бера, то оптическая плотность раствора в определенном диапазоне прямо пропорциональна концентрации вещества.

В последнее время в иммуноферментном анализе получили распространение субстраты, которые образуют продукты, регистрируемые флуориметрическим методом. Молекула при поглощении фотона переходит из основного электронного состояния в возбужденное. Возбужденная молекула может вернуться в основное состояние, при этом избыток энергии перейдет в теплоту, но может произойти обратный процесс перехода электрона на основной уровень, сопровождающийся выделением кванта света, который носит название флуоресценции. Благодаря частичной потере энергии при переходе молекулы из возбужденного состояния в основное длина волны испускаемого света всегда больше длины волны поглощаемого света. Как отмечалось выше, оптическая плотность раствора определяется следующим соотношением:

Долю молекул, перешедших из возбужденного состояния в основное с испусканием света, определяет квантовый выход ц. При условии, что edC<0,l, предыдущее уравнение принимает вид

Интенсивность флуоресценции пропорциональна. количеству света, адсорбированного образцом, з так как /~/о, можно записать, что

Таким образом, интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества С н абсолютному значению начальной интенсивности света Ia, в то время как в фотометрии сравниваются относительные интенсивности / и Iq. Этот факт позволяет на 1--2 порядка повысить чувствительность определения вещества в растворе флуориметрическим методом по сравнению с фотометрическим.

В качестве детектирующих систем в иммуноферментном анализе нашли также применение ферментативные реакции, энергия которых реализуется в виде светового излучения -- реакции био- и хемилюминесценции. За скоростью таких реакций следят по интенсивности свечения реакционной системы, регистрируемой с помощью люминометра. Реакции биолюминесценции катализируются люциферазами светляков и бактерий, а реакция окисления циклических гидразидов перекисью водорода катализируется пероксидазой хрена.

В последние годы распространение получают электрохимические способы определения активности ферментов, используемых в качестве меток в иммуноанализе. Такие датчики позволяют проводить определение скорости ферментативных реакций в мутных средах и удобны для создания проточных иммуноферментных ячеек.

Основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций. В иммуноферментных методах анализа в качестве метки антигенов и антител могут использоваться как ферменты, так и их субстраты. Если меткой служит молекула фермента, то выбранный способ детекции должен обеспечивать регистрацию сигнала, пропорционально зависимого от концентрации фермента, а в случае применения в качестве метки субстрата -- концентрации субстрата. В первом случае фермент выполняет роль маркера, во втором -- детектора. Оптимизация условий каталитической реакции осуществляется в соответствии с используемой модификацией ИФА.

Рассмотрим основные кинетические закономерности протекания ферментативных реакций и принципы, на которых базируется употребление ферментов в качестве меток в ИФА.

После проведения всех иммунохимических стадий любого метода ИФА необходимо установить концентрацию меченного ферментом компонента иммунохимической реакции, т. е. определить каталитическую активность фермента. Для этого в систему добавляют соответствующие субстраты фермента и измеряют скорость ферментативной реакции. По наблюдаемой скорости реакции судят о концентрации фермента-маркера в системе. Очевидно, что для этого необходимо наличие пропорциональности между концентрацией фермента и измеряемой скоростью ферментативной реакции, т. е. выполнение соотношения

Следует отметить, что так как ИФА всегда строится на сравнительном определении в идентичных условиях стандартного и измеряемого образца, то требование пропорциональности скорости и концентрации является скорее желательным, чем обязательным для разработки конкретного метода ИФА. Достаточным является существование взаимно однозначного соответствия между количеством образовавшегося продукта ферментативной реакции и количеством фермента в системе. Однако выполнение условия пропорциональности в определенном диапазоне концентраций обеспечивает, как правило, большую точность эксперимента и, кроме того, позволяет построить теоретическую модель и провести математическое описание метода с целью его оптимизации.

В простейшем случае односубстратных ферментативных реакций, подчиняющихся кинетике Михаэлиса--Ментен, зависимость начальной скорости от концентраций субстрата и фермента в стационарном режиме описывается уравнением

которое отражает пропорциональность между наблюдаемой скоростью ферментативной реакции и концентрацией фермента в растворе. Чтобы снизить ошибку в определении скорости ферментативной реакции, ее ведут обычно в условиях, т. е. находят максимальную скорость ферментативной реакции.

На практике при проведении ферментативной реакции на последней стадии нммуноферментного анализа обычно измеряют не скорость ферментативной реакции, а оптическую плотность или флуоресценцию продукта через определенный фиксированный промежуток времени. Для того чтобы такое измерение было эквивалентно определению скорости реакции, необходимо, чтобы кинетические зависимости накопления продукта реакции от времени имели вид прямых во всем временном диапазоне. В таком случае оптическая плотность раствора, измеренная через фиксированный интервал времени после начала ферментативной реакции, будет реально отражать концентрацию фермента в системе. Так как скорость реакции, согласно уравнению, сильно зависит от концентрации субстрата, проводить ее следует на такую глубину, чтобы можно было пренебречь расходованием субстрата в ходе ферментативной реакции. В противном случае ввиду уменьшения концентрации субстрата в системе скорость ферментативной реакции будет постепенно падать, а следовательно, измеряемая через фиксированный промежуток времени оптическая плотность не будет отражать истинную концентрацию фермента в растворе.

2. Ферменты, используемые в ИФА в качестве меток

Принципиальная возможность применения ферментов в качестве меток в ИФА обусловлена чрезвычайно высокой чувствительностью регистрации ферментов в растворе. Нижний предел регистрации ферментативной метки можно легко оценить, воспользовавшись выражением для максимальной скорости ферментативной реакции:

За время At концентрация образующегося продукта будет равна:

Из уравнения можно вычислить минимальную определяемую концентрацию фермента о.

Если принять KaT⁵=IO³C^-1, время реакции ~15 мин и считать, что обычными спектрофо-тометрическими методами можно зарегистрировать образование продукта в концентрации* 10~⁶-- IO^-7 моль/л, то концентрация фермента ₀ составит:

Таким образом, даже такой простой расчет показывает возможность детекции ферментов в очень малых количествах. Причем принципиально осуществимым является значительное уменьшение пределов обнаружения ферментов как за счет увеличения времени ферментативной реакции, так и увеличения чувствительности регистрации образующегося продукта. В этой связи к перспективным относятся люминесцентные методы детекции ферментативных реакций, а также методы, основанные на ферментативном усилении детекции продуктов первичной ферментативной реакции.

К выбору ферментных меток в ИФА предъявляется ряд общих требований. Основными являются следующие:

а) высокая специфичность и удельная каталитическая активность фермента, позволяющая обнаруживать ферментативную метку в низких концентрациях;

б) доступность ферментов; возможность получения достаточно чистых ферментных препаратов, сохраняющих высокую ферментативную активность после химической модификации при получении конъюгата с антителами или антигенами;

в) стабильность в оптимальных условиях взаимодействия антигена с антителом;

г) простота и чувствительность метода определения концентрации фермента,

Следует отметить, что все методы ИФА можно отнести к двум различным категориям -- гетерогенным и гомогенным. В гетерогенных методах используются иммобилизованные на поверхности твердых носителей реагенты, а в гомогенных -- все стадии ИФА проводят в водном растворе. В гетерогенных методах фермент играет роль обычного маркера антигенов или антител, в то время как в гомогенных методах фермент выступает как составная часть иммунохимической реагентной системы и должен обладать рядом весьма специфических свойств. В табл. 1 и 2 приведены основные свойства ферментов, используемых соответственно в гетерогенных и гомогенных методах, и способы регистрации их активности.

Наибольшее распространение в гетерогенном ИФА среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и в П-галактозидаза. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций. Наиболее доступной является пероксидаза. Она содержит легко окисляемые перйодатом углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента, с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. При работе с большинством из них следует учитывать их канцерогенные и мутагенные свойства и соблюдать осторожность. Каталитическая активность глюкозооксидазы регистрируется с теми же хромогенами, что и пероксидазы, однако чувствительность ее определения по сравнению с пероксидазой несколько ниже. Основным достоинством фермента является полное отсутствие его в плазме крови, что дает возможность использования фермента в гомогенных методах ИФА.

Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. fi-D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА.

Другие ферменты, перечисленные в табл. 1, находят гораздо меньшее практическое использование в гетерогенных методах ИФА. Ацетилхолинэстераза обладает высокой удельной активностью и низким значением K_m; активность можно измерять как с помощью рН-электрода, так и фотометрически. Каталаза имеет наивысшую каталитическую активность, однако недостатком является необходимость слежения за реакцией в УФ области, что не всегда возможно. Существуют теоретические методы определения ее активности, однако они недостаточно чувствительны. В случае уреазы имеются некоторые проблемы со стабильностью конъюгатов, возможно связанные с окислением сульфгидрильных групп фермента, приводящим к инактивации. Наиболее распространенным среди гомогенных методов в настоящее время является так называемый ЕМЙФ-анализ, в, котором в качестве метки молекул антигенов использована глюкозо-6-фосфатдегидро-геназа. Высокая активность фермента по NAD позволяет использовать его при анализе гемолизированных образцов крови, в которых возможно присутствие фермента, имеющего специфичность по NADP. Малатдегидрогеназа -- очень активный фермент, однако он имеет ограниченное применение -- только в анализе мочи. В гомогенном ИФА лизоцим имеет лишь историческое значение.

Чувствительность многих вариантов иммуноферментных методов анализа может быть ограничена наименьшей регистрируемой концентрацией ферментативной метки в растворе, поэтому чем в более низкой концентрации возможно определение меченного ферментом антигена или антитела, тем лучшими характеристиками будет обладать данный метод ИФА.

В табл. 2 даны предельные значения количества ферментов, детектируемых в растворе или на носителе при регистрации ферментативной активности в течение 1 ч фотометрическим или флуориметрическим методами.

Для сравнения отметим, что удельная активность обычно используемого в радиоиммунологическом анализе радиоизотопа ¹²⁵I, имеющего период полураспада 60,2 дня, составляет 4,8 распада в 1 мин на 1 амоль.

Таким образом, из данных таблицы следует, что флуориметрический метод регистрации каталитической активности в-ЖЯ-галактозидазы позволяет выявлять значительно меньшие количества метки, чем радиоизотопный. Для других ферментов эти величины являются сравнимыми, а следовательно, по своей чувствительности иммуноферментные методы анализа не должны уступать радиоиммунологическим.

При разработке конкретного варианта ИФА перед исследователем встает проблема выбора фермента в качестве метки. Для правильного выбора следует учитывать многие факторы: например, в гомогенном ИФА в исследуемом образце должны отсутствовать свободный фермент-метка, или фермент, имеющий сходную с ним специфичность, ингибиторы или активаторы фермента и т. д. Выбор фермента может быть обусловлен также и целями ИФА. Например, при одновременном анализе очень большого числа образцов, выполняемого в течение довольно длительного времени, необходимо для уменьшения ошибки анализа использовать более стабильные субстраты. Гидролитические ферменты, например щелочная фосфатаза и р-?)-галактозидаза, имеют более стабильные субстраты, чем оксидоредуктазы, такие, как пероксидаза и глюкозооксидаза, поэтому последние менее предпочтительны в случае реакции с продолжительным периодом инкубации, но могут быть с успехом использованы в быстрых методах иммуно-анализа.

3. Характеристика ферментов, используемых в ИФА

Пероксидаза хрена

Структура. Пероксидаза хрена представляет собой глобулярный белок М_г=40 000, диаметр молекулы 5,0 нм. Молекула состоит из апофермента и простетической группы -- гемина.

Ионообменной хроматографией пероксидаза разделяется на

7 изоферментов, обозначаемых как А-1, А-2, А-3, В, С, D и Е, которые отличаются по аминокислотному и углеводному составу.

8 коммерческих препаратах пероксидазы в основном содержится изофермент С. В состав молекулы изофермента С входит 308 а. о. и 8 нейтральных углеводных остатков, связанных с остатками аспарагиновой кислоты, стабилизирующих фермент относительно воздействия протеолитических ферментов. Эти углеводные остатки имеют также существенное значение при синтезе иммунопероксидазных конъюгатов методом перйодатного окисления. Молекула изофермента С имеет шесть остатков лизина, содержащих свободные аминогруппы, четыре из которых находятся вблизи поверхности белковой глобулы и легко доступны для модификации.

В состав активного центра молекулы пероксидазы входит феррипротопорфирин IX, образующий с апобелком очень прочный комплекс. Степень чистоты препаратов пероксидазы характеризуется величиной RZ, которая соответствует отношению оптических плотностей при л=403 и 275 нм · Хорошо очищенные препараты пероксидазы имеют RZ^3,0.

Часто для приближенной оценки концентрации пероксидазы в водном растворе рН б--7 используют следующее соотношение:

C=A_m- 0,44,

где Л₄оз -- оптическая плотность раствора пероксидазы при л=403 нм.

Специфичность. Фермент катализирует двухсубстратные реакции с участием перекиси водорода. На первой стадии взаимодействие фермента E с перекисью приводит к образованию промежуточной окисленной формы Ей. На второй стадии происходит одноэлектронное восстановление Ei вторым субстратом АНг, являющимся донором водорода, с образованием второй промежуточной формы фермента Ец, которая после взаимодействия со второй молекулой донора переходит в нативный фермент: E+H₂CvЈEj

E₁+AH_a-* E₁₁+ -АН

E₁₁+AH₂ -E+ -АН

2"-*ў+БЗ₂

Фермент обладает широкой специфичностью по второму субстрату и способен окислять замещенные фенолы, анилины, о-фенилендиамины, о-дианизидин, люминол, я-аминобензойную кислоту и целый ряд других органических и неорганических соединений.

Измерение активности. Для измерения каталитической активности пероксидазы могут быть использованы следующие методы: фотометрический, флуориметрический, хемилюминесцентный, электрохимический.

Среди хромогенных субстратов наибольшее распространение получили о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота и диаммониевая соль 2^'-азино-ди. Во флуориметрическом методе в качестве субстрата используют л-оксифенилпропионовую или гомованилиновую кислоту.

Флуориметрический метод регистрации активности пероксидазы обладает некоторыми преимуществами по сравнению с фотометрическим: более чувствителен, низкая фоновая реакция, интенсивность флуоресценции образующегося продукта стабильна по крайней мере в течение 4 ч. Раствор субстрата может быть приготовлен заранее и храниться в течение длительного времени в замороженном состоянии при --20°С, в то время как рабочие растворы хромогенных субстратов должны быть приготовлены непосредственно перед измерением активности.

Принцип работы электрохимического датчика для определения активности пероксидазы основан на известной реакции окисления йодид-ионов перекисью водорода, катализируемой пероксидазой. Обычно регистрируют либо скорость изменения тока, либо предельный ток, проходящий через электрод за определенный промежуток времени.

Определение каталитической активности пероксидазы с использованием в качестве субстрата о-фенилендиамина. Метод основан на фотометрической регистрации продукта окисления о-фенилендиамина, имеющего, максимум спектра поглощения при 435 нм. Так как иммуноферментный анализ обычно проводят с большим количеством образцов, то часто для остановки ферментативной реакции используют так называемый стоп-реагент, например концентрированную H2SO4. При добавлении в реакционную смесь равного объема 0,1 M H2SO4 максимум спектра поглощения сдвигается на 50 нм в длинноволновую область, поэтому в этом варианте регистрацию оптической плотности следует проводить при 490 нм. рН-Оптимум каталитической активности пероксидазы npif использовании в качестве субстрата-о-фенилендиамина равен 5. В анализе следует использовать свежеприготовленный раствор субстрата и избегать воздействия на него сильного освещения.

Определение каталитической активности пероксидазы с использованием 5-аминосалициловой кислоты. Этот субстрат обычно применяется в случае визуальной детекции результатов ИФА, поскольку при его окислении образуются нерастворимые продукты, имеющие яркую коричневую окраску. К сожалению, в настоящее время в литературе отсутствуют данные по механизмам окисления этого субстрата, составу образующихся продуктов реакции, поэтому его использование для точных измерений в области низких концентраций фермента может быть сопряжено с большими ошибками. о-Фенилендиамин позволяет регистрировать пероксидазу спектрофотометрическим методом в диапазоне от 0,4 до 100 нг/мл, а 5-аминосалициловая кислота -- от 5--10 до 800 нг/мл.

Определение активности пероксидазы с использованием диаммониевой соли 2,2'-азино-ди-. Метод основан на фотометрической регистрации катализируемой пероксидазой химической реакции:

В присутствии пероксидазы и H₂Cb при избытке АБТС при нейтральных значениях рН образуется стабильный катион-радикал, имеющий в растворе интенсивную зелено-голубую окраску.

АБТС и 0,2 мл 0,01 M раствора H₂O₂. Измеряют увеличение оптической плотности при длине волны 405 или 430 нм,

Флуориметрический метод определения каталитической активности пероксидазы с использованием п-оксифенилпропионовой кислоты.

Растворяют 0,25 г очищенной з-оксифенилпропионовой кислоты в 50 мл 0,1 М. фосфатного буфера, рН 8,0. Приготовленный раствор субстрата добавляют в лунки микроплат, содержащие на стенках специфически сорбированные конъюгаты пероксидазы, инкубируют 5 мин при 30 ⁰C и инициируют реакцию добавлением 0,05 мл 0,03%-ной H₂O₂. Через 10--60 мни инкубации при 30°С реакцию останавливают добавлением 0,2 мл 0,1 M глицин-NaOH буфера, с H 10, Измеряют интенсивность флуоресценции образцов.

Хемилюминесцентные способы определения каталитической активности пероксидазы.

1. В полистирольную пробирку, содержащую специфические сорбированные иа стенках конъюгаты At или Ar с пероксидазой, добавляют 10 мкл 3,6 мМ раствора 7)-люциферина в 0,0,1 M трис-HCl буфере, рН 8,0, и 1 мл смеси, содержащей 1,25 мМ люминола и 2,7 мМ перекиси водорода. Пробирку помещают в кювету люмииометра и измеряют интенсивность хемилюмииесцеицин через 30 с.

2. В полистирольную пробирку, содержащую связанный со стенками конъю-гат фермента, добавляют 20 мкл IO^-3 M раствора люминола и 960 мкл 0,21 M NaOH, перемешивают, инкубируют 10--15 мии, после чего реакцию инициируют добавлением 20 мкл 5· IO^-2 M растнора H₂O₂.

Глюкозооксидаза.

Структура. В качестве метки в иммуноферментном анализе обычно используют глюкозооксидазу из Aspergillus niger. Фермент представляет собой гликопротеин, содержащий 16% углеводных групп, молекулярная масса 160000, в состав входят 2 молекулы связанного флавинадениндинуклеотида. Коэффициент молярного поглощения фермента при длине волны 450 нм -- 1,41 10⁴ M^-1-см^-1. В нативном состоянии сульфгидрильные группы в молекуле фермента не обнаруживаются, однако после денатурации в 8 M мочевине титруются 1-2 SH-группы на молекулу белка. Фермент обладает высокой стабильностью и сохраняет активность при хранении в течение нескольких лет в замороженном виде в концентрации 10 мг/мл.

Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления в-П-глюкозы кислородом с образованием перекиси водорода:

2-арабиноза, 2-дезокси-глюкоза и ионы Ag+, Hg²+, Cu²+ являются ингибиторами, рН-оптимум ферментативной активности равен 5,5.

Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации продукта реакции -- перекиси водорода с помощью пероксидазы хрена.

Фотометрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием о-фенилендиамина.

100 мг D-глюкозы растворяют в 10 мл 0,01 М. фосфатного буфера рН 5,5, раствор выдерживают в течение часа, чтобы полностью прошла мутаротация глюкозы. К "полученному раствору добавляют 1 мг пероксидазы хрена и 2,5 мл о-феиилеидиамина. В кювету, содержащую специфически сорбированные на стенках конъюгаты глюкозооксидазы с At или Ar, приливают 1 мл приготовленного раствора. Ферментативную реакцию останавливают добавлением 0,1 мл концентрированной H2SO4. Регистрируют изменение оптической плотности при длине волны 490 им.

Флуориметрический метод определения каталитической активности глюкозооксидазы с использованием п-оксифенилукусной кислоты.

В 50 мл 0,05 M ацетатного буфера рН 5,0 растворяют 50 мг я-оксифеиил-уксусиой кислоты, доводят рН до 5,0 с помощью 10 M NaOH и добавляют 1 мг пероксидазы. К 0,25 мл полученного раствора добавляют 10 мкл раствора глюкозооксидазы в 0,01 M фосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,1 M NaCl и 1 г/л бычьего сывороточного альбумина, и смесь инкубируют при 30°С в течение 5 мин. Ферментативную реакцию инициируют и проводят обычно в течение 10--60 мин при 30°С. Для остановки реакции добавляют 2,5 мл 0,1 M глиции-NaOH буфера, рН 10, Измеряют интенсивность флуоресценции.

Щелочная фосфатаза.

Структура. Продажными препаратами щелочной фосфатазы являются фермент из кишечника телят и из Е. coli. В качестве метки в иммуноферментном анализе обычно используют первый из них, так как он обладает более высокой удельной каталитической активностью. Молекула щелдчной фосфатазы представляет собой димер с ЛЯ_Г~100 000. В состав каждой из субъединиц, входят два сильно связанных атома цинка, один из которых существен для поддержания структурной целостности молекулы, а второй входит в состав активного центра и принимает участие в каталитическом акте.

Специфичность. Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз различных ортофосфатных эфиров, в том числе первичных и вторичных спиртов, сахарных спиртов, циклических спиртов и фенолов:

моноэфир ортофосфорной кислоты + НгО спирт-}-Р04^3-- Ионы Mg²+ являются сильными активаторами фермента. Фосфат-ион и хелаты двухвалентных металлов, например ЭДТА, ингибируют фермент. На активность щелочной фосфатазы значительное влияние оказывает электростатическое окружение.

В сухом виде или в суспензии, рН 7, содержащего 1 мМ MgCb, щелочная фосфатаза стабильна в течение нескольких месяцев при 4°С.

Фотометрический метод определения каталитической активности щелочной фосфатазы с использованием 4-нитрофенилфосфата.

Растворяют 1,1 г 4-иитрофеиилфосфата в 4 мл воды и доводят объем до 5 мл. В кювету спектрофотометра вносят 3 мл 0,1 M глицин-NaOH буфера, рН 10,5, содержащего 1 мМ MgCl₂ и 0,1 мМ ZnCl^ Кювету термостатируют при 30°С в течение 5 мин и добавляют 20 мкл раствора фермента. Реакцию инициируют добавлением ЗО мкл раствора 4-нитрофенилфосфата. Следят за увеличением оптической плотности при длине волны 405 нм.

Флуориметрический метод определения ферментативной активности с использованием 4-метилумбеллиферилфосфата.

Готовит 0,3 мМ раствор субстрата, растворяя 2,6 мг 4-метилумбеллиферилфосфата в 33,3 мл 0,1 M глиции-NaOH буфера, рН 10, В кювету, содержащую специфически сорбированный иа стенках конъюгат фермента с Ar или At, добавляют 0,1 мл 0,1 M глиции-NaOH буфера, рН 10,3, содержащего 1 мМ MgCl₂, 0,1 мМ ZnCl₂, 0,5 г/л NaNa и 250 мг/л альбумина. Раствор инкубируют при 30 ^cC в течение 5 мин и инициируют реакцию добавлением 50 мкл раствора субстрата. Через 10--60 мин реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 0,5 M К2НРО4-КОН буфера, рН 10,4, содержащего 10 мМ ЭДТА. Измеряют интенсивность флуоресценции раствора.

р-О-Галактозидаза

Структура и специфичность. р-.0-галакто-зидаза из Е. coli имеет молекулярную массу около 540 000, молекула содержит значительное число SH-групп.. Коэффициент молярного поглощения при длине волны 280 нм равен 1,13· IO⁶ М^_1-см^-1. Фермент катализирует гидролиз р-О-галактозидов, обладает достаточной стабильностью; в кристаллической суспензии в 2,2 M растворе сульфата аммония сохраняет активность при 4°С в течение нескольких месяцев. Иовы Na⁺ являются ингибиторами фермента.

Фотометрический метод определения каталитической активности с 4-метилумбеллиферил-$-0-галактозидом.

10 мг 4-метилумбеллифернл-Р-0-галактозида растворяют в 2 мл диметил-формамида при встряхивании в течение 4--5 ч и добавляют 98 мл деионизованной воды. В реакционную ячейку, содержащую фермент, добавляют 0,1 мл 0,01 M фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1 M NaCI₁ 1 мМ MgCl₂, 0,05--1 г/л бычьего сывороточного альбумина и 1 г/л азида натрия. Раствор инкубируют при 30 °С в течение 5 мин и инициируют реакцию добавлением 50 мкл раствора субстрата. Через 10--60 мин реакцию останавливают добавлением 2,5 мл 0,1 M глицин-NaOH буфера, рН 10, Измеряют интенсивность флуоресценции.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

Структура. Фермент широко распространен и может быть выделен как из тканей млекопитающих, так и из бактерий. Молекула состоит из двух субъединиц, каждая из которых содержит вблизи активного центра реакционноспособный остаток лизина. В иммуноферментном анализе часто используют бактериальную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу из Leuco-nostos mesenteroides. Фермент не содержит SH-групп и обладает высокой стабильностью.

Специфичность. Фермент катализирует реакцию окисления глюкозо-6-фосфата с образованием б-фосфо-/)-глюконата:

В отличие от фермента из млекопитающих бактериальная глю-козо-6-фосфатдегидрогеназа эффективно использует в качестве кофермента не только NADP⁺, но и NAD+. Большинство двухвалентных ионов металлов являются ингибиторами фермента. Mg²+ в концентрации до 10 мМ активирует, но при высоких концентрациях также ингибирует его. Ингибирующий эффект оказывают фосфат-ионы.

Принцип измерения каталитической активности основан на регистрации образующейся в реакции восстановленной формы кофермента.

Фотометрический метод регистрации каталитической активности глюкоэо-6-фосфатдегидрогеназы.

В кювету спектрофотометра к 2,5 мл 0,1 M трис-HCl буфера. рН 7,8, содержащего 0,03 M MgCl2, добавляют 0,2 мл 0,1 M раствора NAD+ и 0,2 мл 0,15 M раствора натриевой соли глюкозо-б-фосфата. Кювету термостатируют и затем вносят 50 мкл фермента или его конъюгата. Фиксируют скорость изменения оптической плотности раствора при длине волны 340 нм.

Малатдегидрогеназа

Структура. В гомогенном иммуноферментном анализе обычно используют малатдегидрогеназу из сердца свиньи. Молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой по 35 000. Каждая из субъединиц имеет центр связывания молекулы кофермента NAD⁺ и обладает каталитической активностью при диссоциации молекулы на субъединицы. Изоэлектрическая точка 6,2. Молекула содержит 14 SH-групп, две из которых существенны для связывания субстрата в активном центре. Фермент достаточно стабилен и сохраняет активность в течение года при 4°С в виде суспензии под сульфатом аммония.

Специфичность. Малатдегидрогеназа катализирует реакцию восстановления оксалоацетата до малата под действием NADH:

Каталитическую активность измеряют по скорости уменьшения оптической плотности восстановленной формы NADH при длине волны 340 нм. Активаторами фермента являются фосфат, Zn²+, малат; ингибиторами -- оксалоацетат, 8-оксихинолин, AMP, ADP, ATP, сульфит, тироксин, фенолы.

Фотометрический способ определения ферментативной активности малатдегидрогеназы.

В кювету спектрофотометра к 2,58 мл 0,1 M К-фосфатного буфера, рН 7,4, добавляют 0,2 мл 4,5 мМ раствора оксалоацетата в том же буфере и 0,2 мл 3 мМ раствора NADH. Кювету термостатируют и затем вносят 20 мкл раствора фермента и регистрируют изменение оптической плотности раствора в течение 5 мин при длине волны 340 нм.