Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов

25

Контрольная работа

на тему:

"Культивирование, очистка и титрование рабдовирусов"

1. Введение

Рабдовирусы, обладающие цитопатогенным действием на клеточные культуры, дают бляшки, число которых пропорционально количеству вируса. Определение числа бляшек, образующихся в результате дегенерации зараженных клеток, лежит в основе наиболее точного метода титрования. Число бляшек, сформировавшихся при нанесении на клеточный монослой определенного разведения вируса в объеме V, можно использовать для расчета титра в БОЕ/мл по уравнению

ВВС титруют стандартным методом бляшек. Однако этот простой и точный метод определения инфекционности применим не ко всем рабдовирусам. Для многих с успехом применялись альтернативные подходы, в том числе модификации метода бляшек.

Классический метод бляшек для определения инфекционности вирусов животных, впервые описанный Дюльбекко, заключается в адсорбции вируса на монослое чувствительных клеток с последующим добавлением содержащей агар культуральной среды, затвердевающей при охлаждении. После инкубации в течение определенного промежутка времени при окрашивании клеток нейтральным красным становятся видны бляшки.

Для разных точек кинетической кривой наиболее целесообразно использовать следующие разведения:

Инфекционность ВВС определяют, заражая вирусом монослойную или суспензионную культуру клеток ВНК. - 21. Как правило, предпочитают суспензионную культуру, поскольку в этом случае адсорбция проходит более равномерно. Для определения титра ВВС можно использовать и другие культуры, в частности фибробласты куриного эмбриона или L-клетки мыши.

1. Перед опытом необходимо подписать пробирки, используемые для каждого разведения вируса, например "0 ч 10~²", "0 ч Ю^-3" и т.д.

2. В каждую пробирку вносят по 2 мл клеточной суспензии.

3. Добавляют по 0,4 мл соответствующего разведения вируса.

4. Суспензию клеток с вирусом встряхивают 20 мин при 37 °С.

5. После встряхивания по 1 мл зараженных клеток вносят в подписанные чашки Петри диаметром 60 мм, содержащие по 4 мл культуральной среды с противовирусной антисывороткой. Антитела, содержащиеся в сыворотке, нейтрализуют несвязавшийся вирус и предотвращают образование вторичных бляшек.

6. Клетки инкубируют 10-24 ч при 37 °С. В некоторых случаях для формирования бляшек может потребоваться и более длительное время.

7. После инкубации среду удаляют и клетки осторожно промывают PBS. Клетки окрашивают нейтральным красным или по Гимза и подсчитывают бляшки.

Некоторые штаммы вируса бешенства тоже образуют четкие бляшки на монослое клеток хомячка CER; в настоящее время эта линия клеток широко используется для размножения и титрования вируса бешенства и других вирусов. Метод бляшек с использованием клеток CER особенно чувствителен при титровании стандартного штамма вируса бешенства CVS. При работе этим методом используют монослойные культуры, выращиваемые в шестилуночных планшетах.

1. За сутки до заражения в каждую лунку вносят 1-1,25-*10⁶ клеток в 3 мл среды МЕМ-10; на следующий день, как правило, формируется плотный монослой.

2. Для заражения клеток среду удаляют и в лунки вносят по 0,1 мл вируса в PBS или MEM с 0,2% БСА.

3. Адсорбцию проводят 1 ч при 37 °С в С0₂-инкубаторе. После адсорбции в каждую лунку вносят по 2 мл покрытия, состоящего из 0,5%ной агарозы в соответствующей среде, и инкубируют клетки 4-5 сут при 37 °С в СОг-инкубаторе. Бляшки подсчитывают после окрашивания нейтральным красным в составе агарозного покрытия или кристаллическим фиолетовым после удаления агарозы.

2.2.2 Модифицированный метод бляшек с использованием агарозы

Бляшки, образуемые каждым разведением вируса, подсчитывают на нескольких идентичных чашках. Титр вируса в неразведенном препарате можно рассчитать, исходя из суммы всех бляшек в данном разведении при соблюдении следующих условий.

1. Среднее число бляшек, как правило, обратно пропорционально разведению. Это соотношение обычно не соблюдается при большой плотности бляшек, когда они сливаются друг с другом. Поэтому не следует использовать при расчете титра разведения, дающие такую картину.

2. Разброс числа бляшек на чашках с одним и тем же разведением вируса не должен превышать ожидаемого, исходя из случайного распределения. Если же наблюдается больший разброс, что может быть обусловлено негомогенностью монослоя или погрешностями разведения, то и такие результаты не следует использовать при расчетах.

2.2.4 Получение очищенного вируса из бляшек

Хорошо обособленные друг от друга бляшки обычно формируются при максимальном разведении вируса. Для выделения очищенного вируса индивидуальные бляшки извлекают пастеровской пипеткой и помещают в культуральные флаконы, содержащие 5 мл суспензии только что трипсинизированных клеток ВНК-21. Бляшки суспендируют энергичным пипетированием. Чтобы контролировать инфекционный процесс, по 0,5 мл суспензии из каждого флакона вносят в лунки 4-камерных стекол для культуры клеток. Флаконы и стекла с зараженными клетками инкубируют трое суток и идентифицируют на стеклах зараженные клетки методом иммунофлуоресценции.

2.2.5 Титрование вирусов методом иммунофлуоресценции

Титр вируса можно определить, заражая клетки последовательными разведениями вируса и определяя число зараженных клеток методом иммунофлуоресценции. Одно из преимуществ этого метода состоит в том, что на каждое разведение вируса идет меньшее количество клеток, поскольку разведения готовят в лунках планшета для культур клеток; таким образом достигается существенная экономия реактивов. Последовательные 10 - или 5-кратные разведения вируса в планшете готовят следующим образом.

1. Планшет располагают длинной или короткой стороной к экспериментатору в зависимости от того, сколько разведений нужно приготовить. В каждую лунку планшета вносят 80 мкл MEM-10; каждый ряд лунок используют для приготовления разведения определенного образца вируса.

2. С помощью микропипетки, меняя наконечник при каждом переносе, вносят в первую лунку ряда 20 мкл неразведенной суспензии вируса, после чего последовательно переносят из лунки в лунку по 20 мкл, доходя до конца ряда.

3. В каждую лунку с помощью пастеровской пипетки вносят по 1 капле суспензии свежетрипсинизированных клеток ВНК-21 с концентрацией 2-Ю⁶ кл/мл. Таким образом, в каждой лунке содержатся 5 - 10⁴ клеток и вирус в соответствующем разведении в объеме 105 мкл.

4. Для приготовления последовательных 10-кратных разведений проводят описанные выше операции, но в каждую лунку добавляют по 90 мкл MEM-10 и переносят затем из лунки в лунку по 10 мкл вируса.

5. Осторожно перемешав содержимое лунок, из каждой лунки отбирают 2 или 3 аликвоты по 10 мкл и переносят их в отдельные лунки микропланшета Терасаки с 60 или 72 лунками.

6. Планшеты закрывают и инкубируют 1-2 сут в СОг-инкубаторе при 37°С. Если используется суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 1 * 10⁶ кл/мл, то инкубацию проводят 3-4 сут. Для максимально точного определения титра предпочтительна более длительная инкубация.

Примечание. В случае быстро размножающихся рабдовирусов, например ВВС, удается через 2 сут после заражения визуально определить предельное разведение, при котором наблюдается ЦПД, и, исходя из этого, рассчитать титр исходного вируса. Для многих вирусов, которые размножаются медленнее и не обладают ЦПД, после нескольких суток инкубации титр рассчитывают по тому максимальному разведению, при котором еще удается выявить иммунофлуоресценцию зараженных клеток.

Вирус обнаруживают в лунках планшета Терасаки после фиксации клеток и постановки иммунофлуоресценции.

1. Перед фиксацией в планшет вносят 10 мл PBS.

2. Среду перемешивают с PBS, пользуясь пастеровской пипеткой.

3. Разведенную PBS среду удаляют; пипеткой и погружают планшет на 1 мин в охлажденный до 4°С раствор, состоящий из 80% ацетона и 20% воды. Затем планшет переносят в другой сосуд с охлажденным 80% -ным ацетоном и инкубируют 30 мин.

4. После фиксации планшет вынимают из сосуда с ацетоном и удаляют остатки ацетона встряхиванием.

5. Планшет высушивают полностью 30 мин при 37°С.

6. Использованный ацетон фильтруют через Whatman № 1 и сохраняют для дальнейшего использования.

7. Для выявления вирусного антигена в зараженных клетках используют флуоресцирующие антитела. В каждую лунку планшета Терасаки вносят по 5 мкл конъюгированных с флуоресцеином антител против одного из вирусных антигенов и инкубируют планшет 30-60 мин при 37 °С во влажной камере. Следует убедиться в том, что на стенках лунок отсутствуют пузырьки воздуха. Альтернативный, непрямой метод идентификации вирусных антигенов предполагает использование моноклональных противовирусных антител мыши и конъюгированных с флуоресцеином антител против иммуноглобулинов мыши.

8. После окрашивания планшет два раза промывают PBS и один раз водой.

9. Влажные планшеты исследуют с помощью флуоресцентного микроскопа.

10. Чтобы рассчитать титр исходного вируса, определяют предельное разведение, при котором в ячейке еще обнаруживаются зараженные клетки. Считают, что при этом разведении в каждую лунку внесено по 1 инфекционной единице.

Инфекционность исходного вируса рассчитывают по формуле Спирмена-Кербера, которая позволяет определить 50% -ную конечную точку. При расчете 50% -ной конечной точки используют следующую формулу:

Затем рассчитывают разность логарифмов разведения, дающего менее 50% положительных результатов, и 50% -ной конечной точки. Если число положительных результатов уменьшается с увеличением разведения, 50% -ная конечная точка оказывается меньше того разведения, которое дает менее 50% положительных результатов. И тогда из логарифма величины, обратной данному разведению, вычитают полученную разность логарифмов. Этот метод расчета известен как метод Рида и Менча.

3. Выделение и очистка вирусов

3.1 Рабдовирусы животных

Рабдовирусы млекопитающих, принадлежащие к родам Vesiculovirus и Lissavirus, размножаются в мозге взрослых мышей и крыс после интрацеребрального заражения и могут быть выделены из природного материала после одного пассажа через мозг животных. Однако более чувствительной системой для выявления и размножения этих рабдовирусов являются мыши-сосунки. В зависимости от продолжительности инкубационного периода длительность пассажа в мозге мышей может составлять от 7 до 18 сут, а в случае медленно размножающегося вируса бешенства и больше. Для ВВС инкубационный период, как правило, намного короче. Вирус обнаруживают методом иммунофлуоресценции.

1. Для выделения вируса готовят 10% -ную суспензию ткани мозга зараженных животных на среде MEM-10. Для этого ткань мозга измельчают в гомогенизаторе или растирают в ступке. Не следует пользоваться гомогенизаторами, вызывающими образование аэрозолей.

2. Суспензию осветляют центрифугированием на холоду, супернатант собирают и проверяют на стерильность. Осветленный супернатант хранят при - 70 °С.

3. Готовят суспензию только что трипсинизированных клеток ВНК-21 на среде МЕМ-10 с концентрацией Ы0⁶ кл/мл. Плотный монослой клеток во флаконе типа Т-75 образован в среднем 20-10⁶ клеток.

4. Для выделения, например, вируса бешенства 1 мл суспензии клеток ВНК-21 смешивают с 0,25 мл суспензии мозговой ткани во флаконе типа Т-25; смесь инкубируют несколько минут при комнатной температуре.

5. К смеси добавляют 5 мл МЕМ-10, перемешивают и переносят по 0,5 мл суспензии в отдельные ячейки стекла для культуры тканей типа Lab-Tek.

6. Клетки во флаконе и на стекле инкубируют при 37 °С.

7. После 24 ч инкубации среду меняют для удаления остатков мозговой ткани.

8. После 3 сут инкубации клетки на стекле фиксируют и определяют процент зараженных клеток методом прямой иммунофлуоресценции.

9. Определить число зараженных клеток можно и на планшетах Терасаки. В этом случае перед добавлением 5 мл культуральной среды аликвоты клеточной суспензии объемом 10 мкл переносят в лунки планшета Терасаки; затем клетки фиксируют и определяют вирус методом иммунофлуоресценции.

10. Если заражено менее 50% клеток, среду из культурального флакона удаляют и хранят при - 70 °С.

11. Клетки трипсинизируют, ресуспендируют в 2 млМЕМ-10, распределяют во флаконы типа Т-25 по 0,5 мл и вносят в каждый флакон по 5 мл MEM-10.

12. При необходимости инкубацию клеток повторяют, контролируя размножение вируса методом прямой иммунофлуоресценции до тех пор, пока все клетки не будут заражены.

13. Рассчитывают титр вируса в первой культуре или после дополнительного инфицирования. Если при повторном инфицировании вирус не обнаруживается, считают, что он в данной культуре не размножается, и культивирование прекращают.

3.1.1 Очистка рабдовирусов

Вирионы рабдовирусов имеют весьма характерную структуру; в препаратах, окрашенных методом негативного контрастирования, обнаруживаются частицы вариабельной длины, имеющие закругленный и уплощенный концы. Нормальные инфекционные вирионы имеют длину 170-180 нм и диаметр 70 нм. Дефектные интерферирующие частицы сохраняют характерную для инфекционных частиц пулевидную форму, но имеют меньшую длину. Они неинфекционны и накапливаются в возрастающем количестве при пассировании большинства типичных рабдовирусов без разведения благодаря их способности успешно конкурировать с нормальными инфекционными частицами. ДИЧ имеют такой же химический состав, как и стандартные вирионы, но их геномная РНК имеет меньший размер. ДИЧ и стандартные вирионы данного вируса существенно различаются по коэффициентам седиментации, что используется для их разделения методом зонального центрифугирования. Метод, описанный ниже, эффективен для очистки вируса из культуральной среды. Хотя рабдовирусы высвобождаются из зараженных клеток почкованием через плазматическую мембрану, как правило, вирусы, вызывающие слабое ЦПД и накапливающиеся в культуральной жидкости, мало загрязнены клеточными компонентами. Ранний сбор вируса облегчает его очистку, поскольку в культуральной среде не успевает накопиться клеточный дебрис; в то же время, чтобы избежать связывания вирионов с некоторыми компонентами сыворотки, для выращивания зараженных клеток используют среду с 0,1-0,3% Б С А.

На первой стадии очистки вирус необходимо отделить от клеток и клеточного дебриса, содержащегося в культуральной жидкости. Как правило, для этого используют низкоскоростное центрифугирование при 600 g. На второй стадии вирус, находящийся в осветленном супернатанте, концентрируют и освобождают от большинства низкомолекулярных и высокомолекулярных примесей с помощью любого из известных методов концентрирования вирусов при низкой температуре, рН 6,8-8,0 и средних значениях ионной силы. Ниже рассматриваются два метода: осаждение вируса высокоскоростным центрифугированием и преципитация ацетатом цинка, сульфатом аммония или полиэтиленгликолем. Преципитация удобна для получения вирусов как в малых, так и в больших количествах и обладает тем преимуществом, что обеспечивает отделение вируса от большей части посторонних белков.

Наиболее широко используемый метод концентрирования рабдовирусов - осаждение высокоскоростным центрифугированием. Коэффициент седиментации стандартных инфекционных частиц ВВС и вируса бешенства составляет около 600S; длина ДИЧ на 1/3-3/4 меньше длины стандартных вирионов, и соответственно они имеют меньшие коэффициенты седиментации. В большинстве лабораторий для выделения вируса из инфицированных тканей осветленную содержащую вирус культуральную жидкость в ламинарном боксе переносят в плотно закрывающиеся центрифужные пробирки или стаканы большого объема от соответствующего углового или бакет-ротора, например центрифуги Spinco и др.

1. Вирус осаждают центрифугированием 90 мин при 48000 - 50 000 g и 4°С.

2. По окончании центрифугирования закрытые пробирки вновь помещают в ламинарный бокс и осторожно сливают супернатант.

3. Остаток супернатанта тщательно удаляют из пробирок

4. Осадок вируса ресуспендируют в небольшом объеме раствора, содержащего 0,13 М NaCl, 0,05 М трис-HCl и 1 мМ

ЭДТА; объем буфера должен составлять 1% исходного объема культуральной жидкости.

5. Пробирки инкубируют 3-4 ч при 4°С, периодически встряхивая, или в течение ночи без встряхивания для размягчения осадка. После этого, чтобы ресуспендировать вирус, достаточно осторожного пипетирования.

6. Клеточный дебрис и агрегаты вирионов, которые не удается ресуспендировать таким образом, удаляют центрифугированием 20 мин при 1000 g и 4°С.

В ресуспендированном осадке содержится почти вся инфекционность, имеющаяся в исходном препарате.

1. Для осаждения вирионов ионами Zn²⁺ смешивают 1 объем 1 М ацетата цинка и 50 объемов вируссодержащей культуральной жидкости. После перемешивания рН вирусной суспензии снижается приблизительно до 6,8.

2. Смесь инкубируют 20-60 мин при 0-4°С, после этого осаждают образующийся преципитат центрифугированием 40 мин при 1000 g.

3. Прозрачный супернатант, практически не содержащий вируса, отбрасывают, а осадок ресуспендируют в насыщенном растворе Ыа₂ЭДТА. Объем раствора ЭДТА, используемый для ресуспендирования вируса, должен составлять по крайней мере 1,25% исходного объема вируссодержащей культуральной жидкости.

4. Следует убедиться в том, что полученная суспензия вируса прозрачна; оставшиеся частицы растворяют, внося дополнительное количество раствора ЭДТА.

5. Сконцентрированный вирус осветляют центрифугированием 20 мин при 1000 g; такие препараты могут по-прежнему содержать небольшое количество бычьего сывороточного альбумина, клеточных белков и низкомолекулярных соединений, которые часто захватываются формирующимся преципитатом.

Альтернативные методы концентрирования рабдовирусов - преципитация сульфатом аммония или ПЭГ 6000.

1. К осветленной культуральной жидкости, содержащей вирус, добавляют сухой ₂S0₄ или ПЭГ 6000. Вещества добавляют медленно при постоянном перемешивании на холоду, поддерживая рН 7-8 с помощью 1 М раствора трис-HCl.

2. Преципитат осаждают центрифугированием 30 мин при 1500 g. Осадок, полученный с помощью сульфата аммония, растворяют в 0,4М ₂S0_4> 0,1 М трис и 0,01 М ЭДТА и центрифугируют 70 мин при 82 000 g на подушке 100% -ного глицерина объемом 1 мл в бакет-роторе.

3. По окончании центрифугирования раствор над зоной вируса полностью удаляют и собирают вирус, образующий зону на поверхности подушки, добавляя буферный раствор, содержащий 2S0₄, трис и ЭДТА, и предельно осторожно покачивая пробирку для растворения вируса.

4. Вирусную суспензию разводят в 3-5 раз для дальнейшей очистки методом центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, как описано ниже.

На третьем этапе очистки рабдовирусов отделяют стандартные инфекционные вирионы от ДИЧ, которые могут присутствовать в составе вирусного потомства. Разделение достигается центрифугированием вирусного препарата в линейном градиенте концентрации сахарозы благодаря различию коэффициентов седиментации инфекционных вирионов и ДИЧ. Седиментация вируса в градиенте концентрации сахарозы обычно сопровождается снижением инфекционности в 2 - 3 раза, так как значительная часть вирусных частиц разрушается при диализе, который проводят для удаления сахарозы. Для того чтобы свести инактивацию к минимуму, диализ следует проводить в несколько стадий против растворов с убывающей концентрацией сахарозы.

1. Для отделения стандартных вирионов от ДИЧ концентрированную суспензию вируса наслаивают на 5-30% -ный или 10-60% -ный линейный градиент концентрации сахарозы, приготовленный на буфере NTE, и центрифугируют 45 мин при 54 ООО g или 60 мин при 61 ООО g соответственно.

2. После центрифугирования собирают 20-30 фракций градиента, прокалывая дно пробирки; если в пробирке видны зоны вируса, их отбирают, прокалывая пробирку сбоку.

3. Собранный вирус разводят 3-5 объемами NTE и осаждают центрифугированием 3 ч в бакет-роторе при 189 ООО g.

4. Осадок ресуспендируют в NTE для дальнейшего биохимического анализа.

В отсутствие белка-носителя инфекционность вируса, очищенного описанным методом, достаточно лабильна. Однако после добавления бычьего сывороточного альбумина до концентрации 0,5-1% вирус можно хранить в течение нескольких месяцев при - 70 °С практически без потери инфекционности.

3.2 Рабдовирусы растений

Большинство методов очистки вирусов растений не подходит для рабдовирусов, поскольку предусматривают осветление грубых растительных экстрактов прогреванием при 55-60 °С или обработкой органическими растворителями. Неприемлемость этих процедур для очистки рабдовирусов обусловлена, во-первых, возможностью термической инактивации и, во-вторых, разрушением оболочки вирионов органическими растворителями. Поэтому методы очистки рабдовирусов растений были разработаны на основе методов очистки рабдовирусов животных. Опубликован прекрасный обзор этих методов, в котором обсуждаются применение центрифугирования в плотностных градиентах и электрофореза для отделения вирусов от остатков тканей, а также дополнительные процедуры для экстракции рабдовирусов из тканей растений.

Описанный ниже метод используется в настоящее время на кафедре вирусологии Сельскохозяйственного университета в Вагенингене. Вирус получают из листьев Nicotiana glutinosa или Nicotiana christii через 10-12 сут после заражения. Здоровые растения заражают механическим способом, используя в качестве инокулята гомогенат 1-2 листьев больного растения, растертых в 0,01 М Na₂S0₃. Когда механическое инфицирование растений невозможно, растения заражают с помощью насекомых. На степень очистки и выход вируса влияют условия культивирования растений; при слишком интенсивном солнечном освещении возможно снижение выхода вируса.

На первом этапе выделяют вирус из зараженного растения.

1. Зараженные листья собирают и через 60-80 г листовой массы под вакуумом пропускают буфер для экстракции, содержащий 0,1 М глицин, 0,01 М MgCl₂ и 0,01 М KCN, рН 8,2-8,4.

2. Обработанные таким образом листья через 1-2 ч измельчают в течение 15 с в гомогенизаторе Уоринга с 3 объемами буфера для экстракции.

3. Необходимо контролировать рН суспензии и при необходимости доводить его до 7,2; при более низких значениях рН могут возникнуть затруднения при отделении вируса от компонентов тканей растения в процессе очистки. Если почему-либо используют большее количество ткани листьев, гомогенизацию можно проводить в равном объеме холодного глицинового буфера в течение 1 мин при максимальной скорости вращения ножей гомогенизатора.

4. Для удаления пульпы из гомогената через 4 слоя марли отжимают сок. Следует помнить, что экстрагирующий глициновый буфер можно хранить при 4°С, а затем непосредственно перед использованием добавлять ЫагБОз. Присутствие восстановителя необходимо для получения вируса.

5. Сок центрифугируют 5 мин при 8000 g.

6. Супернатант собирают и осветляют, добавляя целит до конечной концентрации 10% и фильтруя полученную смесь через слой целита или Hyflo Supercell, смоченного экстрагирующим буфером, на воронке Бюхнера. В некоторых случаях приходится создавать в колбе-приемнике вакуум с помощью мощного насоса. Сок следует пропускать через воронку до тех пор, пока уровень жидкости не дойдет до поверхности подушки. Однако при этом поверхность обязательно должна оставаться влажной.

7. На поверхность подушки медленно наливают 60 мл глицинового буфера для экстракции и пропускают жидкость через воронку под вакуумом так, чтобы поверхность подушки оставалась влажной.

8. Приливают вторую порцию того же буфера и пропускают через воронку, пока поверхность подушки не станет сухой. Полученный фильтрат должен иметь желтовато-оранжевый цвет без зеленого оттенка.

9. В препаратах, содержащих значительное количество вируса, можно зарегистрировать светорассеяние.

Примечание. Правильное приготовление подушки из целита имеет большое значение и требует определенного навыка. Для обработки 300 г листьев подушку готовят на воронке Бюхнера диаметром 19,5 см. Обычно 85 г целита; размешивают в достаточном объеме экстрагирующего глицинового буфера для получения гомогенной суспензии, которую затем наслаивают на 2 листа фильтровальной бумаги Whatman ЗММ и осторожно под вакуумом пропускают раствор через воронку до тех пор, пока не образуется слой толщиной 5-7 мм, слегка влажный сверху. Подушка должна иметь на всех участках одинаковую толщину; ее следует готовить не более чем за 1 ч до начала очистки вируса и хранить до употребления при 4°С. Одной такой подушки хватает для обработки 300 г листьев.

1. Вирус из фильтрата концентрируют добавлением 0,3 объема 30% -ного раствора полиэтиленгликоля в воде.

2. Смесь размешивают I ч при 4°С для формирования преципитата вируса.

3. Преципитат осаждают центрифугированием 20 мин при 9000 об/мин в роторе с большой емкостью и растворяют осадок в буфере для хранения; объем буфера должен составлять 1/5 объема осветленного фильтрата.

4. Вирусную суспензию вновь фильтруют через более тонкую подушку из целита. Ее готовят, как описано выше, но для приготовления суспензии 30 г целита размешивают в буфере для хранения и каждую промывку проводят 35 мл того же буфера.

5. Фильтрат переносят в центрифужные пробирки и осаждают вирус центрифугированием 1 ч при 20000 g.

6. Осадок ресуспендируют в 1,5 мл буфера для хранения и наносят полученную суспензию вируса на 15 - 30% -ный линейный градиент концентрации сахарозы в буфере для хранения. Вирус должен образовать зону при центрифугировании в течение 25 мин при 67 000 g.

7. Видимую простым глазом зону вируса извлекают из градиента, прокалывая пробирку сбоку, и проводят дальнейшую очистку вируса повторным центрифугированием в более крутом градиенте концентрации сахарозы.

8. Из градиента вновь извлекают зону вируса, разводят ее примерно 5 объемами буфера для хранения и осаждают вирус высокоскоростным центрифугированием в разбавленном растворе сахарозы.

9. После центрифугирования супернатант осторожно сливают, его остатки тщательно удаляют фильтровальной бумагой и ресуспендируют осадок вируса в 0,5 мл буфера для хранения. Вирус хранят в замороженном виде при - 20 или - 70 °С.