Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов

Контрольная работа

"Культивирование, идентификация и очистка пикорнавирусов"

2008

Введение

Пикорнавирусы -- это мелкие, не содержащие липидов вирусы, геном которых представлен однонитевой РНК, выполняющей функцию матричной; РНК заключена в белковый капсид диаметром 25-30 нм. Пикорнавирусы вызывают распространенные заболевания человека и других млекопитающих; сходные с ними вирусы обнаружены также у насекомых и растений. В этой работе мы ограничимся рассмотрением пикорнавирусов млекопитающих, которые подразделяются на кислотоустойчивых энтеровирусов, размножающихся преимущественно в желудочно-кишечном тракте, и кислоточувстви-тельных риновирусов, обнаруживаемых главным образом в носоглотке. Энтеровирусы в свою очередь делятся на вирусы полиомиелита, вирусы Коксаки, вирусы ECHO, энтеровирусы, обозначаемые номерами, и кардиовирусы мышей. Афтовирусы, этиологические агенты ящура, объединяются с риновирусами. Классификация пикорнавирусов и типичные представители приведены в табл. 1.

Выбор методики получения вирусного препарата определяется целью дальнейшего исследования. Для изучения круга хозяев, серологических свойств, а также в качестве инфекционного материала можно использовать и неочищенные препараты вируса. В качестве антигена или иммуногена, для клонирования и секвенирования вирусной РНК и получения матричной РНК, транслируемой в бесклеточных системах, необходимо иметь высокоочищенный вирус, не содержащий контаминантов клеточного или другого происхождения. Для изучения цикла репродукции вируса в зараженной клетке, характеристики полиовируса методом олигонуклеотидного картирования РНК, анализа вирионных белков и в ряде иммунологических исследований применяют вирус, меченный радиоактивным изотопом.

Таблица 1. Классификация пикорнавирусов

Группа	Подгруппа	Представитель	Заболевание человека
Энтеровирусы Риновирусы	Полиовирусы Вирусы Кокса- ки Вирусы ECHO Энтеровирусы Кардиовирусы Энтеровирусы Риновирусы Афтовирусы	РЗ/Ьеоп/США Вирус Коксаки А9 Вирус Коксаки В4 ECHO 11 Энтеровирус 70 эмк Вирус Менго Вирус гепатита А Риновирус человека, тип 1а Риновирус человека, тип 14 Вирус ящура, тип SAT 1	Паралитический полиомиелит Лихорадка, поражение горла, асептический менингит, ринит Асептический менингит, миокардит, перикардит, ор-хит; возможно, благоприобретенный диабет у взрослых Асептический менингит Геморрагический конъюнктивит, временный паралич Возможно, лихорадка с поражением ЦНС Гепатит Острое респираторное заболевание

Настоящая работа состоит из четырех разделов, в которых рассматриваются необходимые меры безопасности, методы культивирования, идентификации и очистки пикорнавирусов. В качестве типичного представителя пикорнавирусов в ходе изложения будет рассматриваться полиовирус типа 3, так как именно он был основным объектом исследований, проведенных в лаборатории автора; другие вирусы будут привлекаться для обсуждения по мере необходимости.

1. Меры безопасности

Человек является природным хозяином многих пикорнавирусов, представляющих в силу этого наибольший интерес. Обычно энтеровирусная инфекция протекает бессимптомно, но возможно развитие и симптоматических заболеваний, примеры которых приведены в табл. 1. Особенно чувствительны к энте-ровирусам дети, и поэтому беременным женщинам и людям, имеющим маленьких детей, необходимо соблюдать предельную осторожность. Так, например, вирус Коксаки В4, вероятно, вызывает врожденные поражения сердца, развивающиеся в результате внутриматочного заражения плода. Описано также заражение вирусом Коксаки А в лабораторных условиях, хотя его этиологическая роль четко не доказана. Желательно переодеться и принять душ, перед тем как покинуть лабораторию, время от времени необходимо контролировать титр антител в сыворотке крови.

В настоящее время не существует вакцин против вирусов Коксаки и энтеровирусов, перечисленных в табл. 1. С другой стороны, имеются исключительно эффективные и совершенно безопасные полиовирусные вакцины, и невозможно переоценить значение проверки уровня антител, а в случае необходимости и ревакцинации перед началом любой работы с полиовирусом. Высокий уровень иммунитета предотвратит заболевание самих работающих, а также развитие у них бессимптомной инфекции, при которой они могут быть источником вируса. По-видимому, для стимуляции образования антител к полиовирусу для взрослых больше всего подходит инактивированная вакцина Солка. Проведение любой работы с вирусом ящура строго регулируется в законодательном порядке, поскольку он вызывает эпизоотии среди домашних животных.

2. Культивирование пикорнавирусов

В этом разделе после некоторых вводных замечаний приводятся три конкретные методики культивирования полиовируса разных типов.

2.1 Выбор клеток

Хотя описаны штаммы, адаптированные к размножению в куриных эмбрионах, большинство пикорнавирусов размножаются только в гомологичных клеточных культурах, например пикорнавирус человека -- в культуре клеток человека или других приматов. Одна из основных трудностей в работе с пикор-навирусами состоит в подборе подходящей клеточной культуры; с этой точки зрения полиовирус является одним из наиболее удобных объектов исследования, поскольку он размножается в легко культивируемых клетках разных типов; при этом титр его составляет Ш7--109 инфекционных единиц на миллилитр культуральной среды. В то же время другие энтеровирусы и риновирусы дают титры лишь около 104 инфекционных единиц на миллилитр, причем только в определенных клеточных линиях. При таком низком выходе трудно получить значительное количество очищенного вируса, и исследования ограничиваются изучением нейтрализации ин-фекционности с помощью антител и цикла репродукции с применением иммунофлуоресценции. Для выращивания рино-вирусов рекомендована определенная сублиния клеток HeLa, однако часто оказывается, что свойства одной и той же линии клеток различаются при культивировании ее в разных лабораториях, а кроме того, разные типы риновирусов дают неодинаковые титры в одних и тех же клетках. В табл. 2 перечислены некоторые линии клеток, используемые для выращивания детально исследованных пикорнавирусов. Список не претендует на полноту, в него включены только широко распространенные линии. Информацию о том, какая клеточная линия оптимальна для размножения того или иного пикорнавируса, обычно можно получить в лабораториях, предоставляющих вирусный посевной материал.

Таблица 2. Культуры клеток для размножения пикорнавирусов

Вирус	Клетки
Полиовирус Коксаки А Коксаки В ECHO 11 Энтеровирус 70 эмк Вирус Менго Вирус гепатита А Риновирус Вирус ящура	Нер-2с HeLa HeLa Вторичная культура почек обезьян RD HeLa LLCMK2 RD RD Асцитные клетки мыши Кребс II Вторичная культура клеток мышиного эмбриона L-клетки Клетки крысиной гепа-томы Новикова NISI-67 Вторичная культура клеток мышиного эмбриона Первичная культура клеток печени обезьян мар-мозеток FRMK-6 MRC-5 HeLa 0 MRC-5 KB внк	Эпителиальная карцинома человека Карцинома человека Карцинома человека Почки обезьян Рабдомиосаркома человека Карцинома человека Почки эмбрионов макак-резусов Рабдомиосаркома человека Рабдомиосаркома человека Опухоль мыши Эмбрион мыши Опухоль мыши Гепатокарцинома крысы Эмбрион мыши Печень мармозеток Почки эмбрионов макак-резусов Легкие эмбриона человека Карцинома человека Легкие эмбриона человека Карцинома человека Почки сирийского хомячка

2.2 Условия культивирования

Хотя инфекционность большинства пикорнавирусов достаточно стабильна, вирусный посевной материал лучше всего хранить при --70 °С. Оттаивание вируса необходимо проводить при комнатной температуре, поскольку пикорнавирусы обычно термолабильны и при неоднократном оттаивании при 37 °С их инфекционность падает. При необходимости клетки заражают пикорнавирусами с высокой множественностью инфекции, так как в отличие от других вирусов при этом не происходит быстрого накопления дефектных интерферирующих частиц.

Выбранную культуру клеток можно выращивать на поверхности культурального флакона в стационарных условиях или в роллерной установке, а также в суспензии при осторожном перемешивании. Клетки наращивают до монослоя или высевают с нужной плотностью из трипсинизированной культуры за сутки до использования. В нашей лаборатории оказалось наиболее удобным использовать для получения небольших количеств полиовируса вращающиеся пробирки, поскольку в них значительное количество клеток покрывается небольшим объемом среды, что обеспечивает экономный расход радиоактивных соединений и позволяет получить препарат вируса, не требующий концентрирования перед очисткой. Культивирование полиовируса в роллерных установках обычно дает такой же выход и удельную радиоактивность, как и выращивание в монослое на флаконах при одинаковых концентрациях клеток, вируса и радиоактивного предшественника. Риновиру-сы, однако, предпочтительнее выращивать в роллерных культурах, поскольку для их репродукции нужны хорошая аэрация и слабокислый рН, хотя сами вирионы в кислой среде лабильны.

Риновирусы лучше всего размножаются при 33 °С, хотя вполне удовлетворительный выход достигается и при 35°С; все полученные Сэбином вакцинные штаммы полиовируса термолабильны, температурный оптимум их размножения -- 33-- 35 °С. Сыворотки крупного рогатого скота и лошадей часто содержат ингибиторы репликации полиовируса, и культуры клеток для его выращивания следует вести на фетальной сыворотке крупного рогатого скота или выдерживать в бессывороточной среде в течение суток перед заражением.

2.3 Сбор вирусов

Размножение вируса и его выход из клеток обычно сопровождаются дегенерацией последних, причем цитопатическое действие наиболее четко выражено при размножении вируса в монослое клеток. Начиная работу, полезно ставить в качестве контроля незараженную культуру, хотя обычно дегенерация клеток очевидна и выражается в их частичной гибели и деструкции монослоя.

Рис. 1 иллюстрирует ЦПД, вызываемое полиовирусом. Однако размножение пикорнавирусов не всегда сопровождается видимыми эффектами. Вирус гепатита А не дает заметного ЦПД в клетках FRh К-6, причем в культу-ральной среде воспроизводимо обнаруживается лишь небольшое количество вируса. Обычно при достижении максимального ЦПД энтеровирусы полностью высвобождаются из зараженных клеток, в то время как риновирусы остаются частично связанными с клетками. В некоторых случаях очень важно время сбора вируса; так, имеются сообщения, что вирионы вируса ящура содержат связанную рибонуклеазу, которая разрушает геномную РНК, если собирать вирус через 12, а не через 8 ч после заражения. Аналогичные данные имеются и для риновирусов.

Общепринятый метод разрушения зараженных клеток -- три цикла замораживания и оттаивания; после этого в случае необходимости клеточную суспензию пропускают через иглу для инъекций. Остатки клеток обычно удаляют низкоскоростным центрифугированием.

2.4 Наращивание полиовируса типа 3 для заражения клеток

Все процедуры следует проводить в стерильных условиях.

1. Клетки Нер-2с высевают на стеклянную бутылку объемом 16 унций или на пластиковый культуральный флакон площадью 150 см2 в 100 мл минимальной питательной среды Игла, содержащий 4% эмбриональной телячьей сыворотки, 2,2 г/л бикарбоната натрия, 120 мг/л пенициллина и 100 мг/л стрептомицина. Клетки выращивают до образования монослоя при 35--37°С.

2. Среду осторожно сливают. На монослой наливают 0,1 мл культуральной жидкости, содержащей полиовирус типа 3. Для адсорбции вируса клетки инкубируют 30 мин при комнатной температуре, периодически покачивая флакон.

3. Добавляют 50 мл среды MEM, содержащей бикарбонат и антибиотики, как указано выше, но без сыворотки. Инкубируют при 35 °С до полной деструкции монослоя.

4. Содержимое флакона замораживают при --70 "С и оттаивают при комнатной температуре. Остатки клеток удаляют низкоскоростным центрифугированием, суперна-тант сливают и сохраняют.

5. Аликвоты супернатанта хранят при --70 °С.

В результате получают пул полиовируса, содержащий 108-- 109 БОЕ/мл.

2.5 Получение меченного метионином полиовируса типа 3 на

монослойных клеточных культурах в химических пробирках

Все процедуры проводятся в стерильных условиях.

1. Путем трипсинизации монослоя получают суспензию клеток Нер-2с в среде MEM, содержащей сыворотку, антибиотики и бикарбонат, как указано в разд. 3.4, стадия 1. Суспензию разводят до концентрации 2-106 кл/мл. В стерильные вымытые кислотой химические пробирки высевают по 5 мл клеточной суспензии; пробирки затыкают резиновыми силиконовыми пробками, в горизонтальном положении помещают в барабан роллерной установки, вращающийся со скоростью 5 об/ч и инкубируют в термостате при 35°С. В течение ночи клетки прикрепляются к стеклу.

2. Среду осторожно сливают и в каждую пробирку вносят 0,1--0,3 мл неразведенной культуральной жидкости, содержащей полиовирус типа 3. Пробирки инкубируют в роллерной установке 1 ч при 35°С, после чего добавляют 1 мл среды MEM без метио-нина, но содержащей 1% ЭТС, 2,2 г/л бикарбоната натрия, 120 мкг/л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина. Пробирки инкубируют в роллерной установке еще 5 ч; при этом начинается инфекционный процесс и подавляется синтез клеточных белков.

3. В каждую пробирку вносят по 25 мкКи -метионина. Пробирки инкубируют в роллерной установке в течение ночи при 35 °С.

4. Через 24 ч после заражения должно наблюдаться полнее ЦПД, при этом не должно оставаться клеток, прикрепленных к стеклу. Пробирки замораживают при *--70 °С и оттаивают в водяной бане при комнатной температуре. Среду из всех пробирок объединяют и остатки клеток удаляют низкоскоростным центрифугированием. Вирус, содержащийся в супернатанте, подвергают дальнейшей очистке. Обычный выход вируса из трех пробирок -- около 1010 БОЕ при удельной радиоактивности 2-10--4 имп/мин на 1 БОЕ.

2.6 Получение вируса в суспензионной культуре клеток HeLa

Все процедуры проводятся в стерильных условиях.

1. Определенные сублинии клеток HeLa могут расти в средах с низкой концентрацией ионов кальция. Для эффективного заражения существенно, чтобы клетки хорошо росли в виде однородной суспензии. Клетки осаждают низкоскоростным центрифугированием и ресуспендируют в среде CaS2MEM до концентрации -- 2-107 кл/мл.

2. К клеточной суспензии добавляют вирус в концентрации 10--50 БОЕ на клетку; инкубируют ее на магнитной мешалке в течение 1 ч при 35 °С.

3. Суспензию разводят той же средой до концентрации 2-Ю6 кл/мл и добавляют 100 мкКи -уридина.

4. Клеточную суспензию инкубируют в течение 8 ч, после чего осаждают клетки низкоскоростным центрифугированием и промывают один раз фосфатным буферным раствором, не содержащим ионов магния и кальция.

5. Клетки ресуспендируют в PBS и проводят три цикла замораживания -- оттаивания.

6. Остатки клеток удаляют центрифугированием.

7. Супернатант сохраняют для дальнейшей очистки.

3. Идентификация вирусов

Многие пикорнавирусы в определенных условиях агглютинируют эритроциты некоторых видов животных; эту реакцию можно использовать для выявления вируса. Однако наиболее часто определяют инфекционность вируса, его антигенные свойства или идентифицируют отдельные компоненты вириона после фракционирования.

3.1 Методы определения инфекционности

Все методы определения инфекционности требуют чувствительной линии клеток и тщательного соблюдения стерильных условий.

3.1.1 Определение TCIDso') полиовируса типа 3

1. Готовят стерильные пробирки, содержащие по 0,9 мл раствора для разведения.

2. Готовят последовательные 10-кратные разведения вирусного препарата, внося в первую пробирку '0,1 мл препарата, перемешивая и перенося 0,1 мл в следующую пробирку и т. д. Для приготовления каждого разведения используют чистую пипетку.

3. Стерильные микропланшеты, подходящие для выращивания культуры клеток, выпускаются, например, фирмой Linbro. Каждый планшет содержит 96 плоскодонных лунок объемом 0,3--0,4 мл. С помощью микропипетки по 0,025 мл каждого разведения вируса вносят в четыре лунки. В перерывах между внесениями вируса для сохранения стерильности планшет можно прикрыть стерильной фильтровальной бумагой.

4. Клетки Нер-2с трипсинизируют, снимают со стекла и разводят средой до концентрации 5000--10 000кл/мл. В каждую лунку вносят по 0,1 мл клеточной суспензии. Для контроля вносят клетки в один ряд лунок, не содержащих вируса.

5. Планшет заклеивают достаточно прочной клейкой лентой и инкубируют при 35°С.

6. На четвертый и седьмой день после заражения исследуют клетки с помощью инвертированного микроскопа и выявляют дегенеративные изменения.

7. Рассчитывают титр вируса. Титром считается разведение, достаточное для проявления ЦПД в 50% лунок. Так, например, если при разведении Ю-7 дегенерация клеток наблюдается в 50% лунок, то титр вируса составляет 107 единиц TCID50 на 0,025 мл. Если при разведении Ю-7 дегенерация наблюдается во всех лунках, а при разведении Ю-8 -- ни в одной, то титр считается равным 107'5 единиц TCID50 на 0,025 мл. Дегенерация клеточного монослоя в одной лунке соответствует изменению титра примерно на 100'25 единиц TCID50. Титр вируса выражают обычно в TCID50 на 1 мл.

3.1.2 Определение инфекционное™ лолиовируса типа 3 методом

бляшек

1. Планшеты с 6 лунками диаметром 3,5 см засевают клетками Нер-2с в концентрации 3-Ю6 на лунку в 3 мл среды для использования на следующий день. Можно также засевать планшеты клетками в количестве 3-105 на лунку и выращивать до формирования монослоя в термостате в атмосфере 5% С02 при 35 °С.

2. Готовят 2%-ный агар на дистиллированной воде в количестве около 1,5 мл на лунку. Агар автоклавируют и держат расплавленным при 56 °С.

3. Готовят двукратный концентрат среды Лейбовича L15, содержащий 2% ЭТС, 240 мкг/л пенициллина и 200 мкг/л стрептомицина, в количестве 1,5 мл на лунку. Среду держат при 37°С.

4. Готовят последовательные 10-кратные разведения вируса на среде Лейбовича L15, содержащей 1% ЭТС, 120 мкг/л пенициллина и 100 мкг/л стрептомицина.

5. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1--0,25 мл вируса. Вирус ровно распределяют по поверхности клеточного монослоя и проводят адсорбцию при комнатной температуре в течение 15--60 мин с периодическим покачиванием. При этом необходимо следить за тем, чтобы монослой не подсыхал.

6. Смешивают равные объемы 2%-ного агара и двукратного концентрата среды Лейбовича. Смесь слегка охлаждают и вносят в каждую лунку по 3 мл. Планшет покачивают, чтобы агар смешался с вирусом, и дают агару затвердеть при комнатной температуре.

7. Планшет инкубируют в перевернутом виде, чтобы избежать просачивания конденсата между агаром и монослоем. Ин

кубацию проводят при 35 °С в увлажненном контейнере в термальной комнате или в увлажненном термостате в атмосфере 5% С02.

8. Бляшки достигают оптимального размера через 3--4 сут. Их окрашивают нафталиновым черным, красителем Лейшмана, кристаллическим фиолетовым по Гимза или каким-либо другим подходящим красителем. Для приготовления рабочего раствора нафталинового черного используют 1 г сухого красителя, 13,6 г ацетата натрия, 60 мл ледяной уксусной кислоты и дистиллированную воду до общего объема 1 л.

9. Рассчитывают титр вируса. Если при разведении Ю-6 и внесении 0,1 мл вируса в лунку обнаруживается 19 бляшек, титр инфекционности составляет"

3.1.3 Сравнение методов определения инфекционности по TCID5o

и по бляшкам

Преимущество метода определения инфекционности по TCID50 состоит в том, что он не требует сложного оборудования, легок в исполнении и предполагает использование небольшого количества клеток. Кроме того,-- и это, по-видимому, наиболее существенно в случае пикорнавирусов -- для определения TCID50 достаточно иметь клеточную систему, в которой вирус вызывает дегенерацию, в то время как метод бляшек требует, чтобы в толстом клеточном слое формировались хорошо заметные бляшки. Если необходима непрерывная регистрация результатов, можно окрашивать клетки, хотя опытный специалист обычно обнаруживает деструктивные изменения клеточного слоя и без окрашивания. Метод определения инфекционности по TCID50, описанный здесь, не так точен, как метод бляшек, и позволяет в лучшем случае определять титр вируса с точностью до 100,5. Однако точность метода можно повысить, используя большее число лунок на одно разведение вируса. В любом случае для определения инфекционности по TCID50 требуется больше разведений вируса, чем для определения методом бляшек.

3.2 Методы определения антигенных свойств

Антигенная структура пикорнавирусов необычна в том отношении, что пустые капсиды и некоторые другие неинфекционные частицы, как правило, несут на своей поверхности антигены, отсутствующие у инфекционных частиц, например «С»- или «Н»-антигены полиовируса. Аналогичным образом на поверхности инфекционных частиц имеются антигены, не обнаруживаемые в пустых капсидах. Возможно, на поверхности инфекционных и неинфекционных частиц есть и общие антигенные детерминанты. «D» или «N» антигены, характерные для инфекционных частиц, нестабильны. Прогревание полиовируса при 56°С в течение 30 мин способствует переходу практически всего «D» -антигена в «С»-антиген. Такой же переход в разной степени происходит и в результате адсорбции вируса на твердых подложках, используемых в радиоиммуноанализе и в иммуно-ферментном анализе. ELISA и другие иммуносорбентные методы использовались для выявления антигенов вируса гепатита А, полиовируса и вируса ящура. Мы встретились со значительными трудностями, пытаясь применить методы этого типа. Возможно, трудности были вызваны неэффективной адсорбцией вируса, взаимопревращением антигенов, а частично -- неспецифическими эффектами, связанными с тем, что даже препараты вируса с высоким титром инфекционности содержат больше клеточного, чем вирусного материала.

Для исследования репродукции вируса применяют также иммунофлуоресцентные методы, но рутинным методом, используемым в нашей лаборатории для выявления очищенного вирусного антигена, является одиночная радиальная иммуно-диффузия.

3.2.1 Идентификация полиовируса типа 3 методом одиночной

радиальной иммунодиффузии

1. 10 г агарозы типа Seakem ME растворяют в 1 л фосфатного буферного раствора Дюль-бекко A в кипящей водяной бане при перемешивании.

2. Раствор агарозы фильтруют через фильтровальную бумагу Whatman ПЗг и добавляют азид натрия до концентрации 0,05%. Раствор делят на аликвоты по 20--25 мл.

3. Стеклянные пластины размером 12X12 см моют детергентом, ополаскивают водой и высушивают.

4. Расплавляют агарозу из расчета 14 мл на одну пластину. Каждая пластина вмещает 16 образцов. Агарозу разливают в предварительно нагретые сосуды порциями по 12 мл и оставляют при 60 °С; оставшейся агарозой смачивают кусок папиросной бумаги, протирают им поверхность каждой стеклянной пластины и дают агарозе застыть.

5. На внутренний край формы диаметром 9 см наносят тонкий слой силиконовой смазки и помещают форму на покрытую тонким слоем агарозы поверхность стеклянной пластины.

6. Чтобы закрепить форму на пластине, по ее внутреннему краю наливают небольшое количество расплавленной агарозы и дают ей затвердеть.

7. К каждой порции расплавленной агарозы добавляют нужное количество гипериммунной антиполиомиелитной сыворотки, тщательно перемешивают, избегая образования пузырей, и выливают в форму, удаляя пузыри, если они все же образуются, пастеровской пипеткой.

8. Агарозе дают затвердеть в течение 10 мин, после чего удаляют форму резким движением, слегка надавливая на нее сверху. С помощью штопора или другого подходящего приспособления в агарозе проделывают 16 симметрично расположенных лунок диаметром 4 мм.

9. Два объема антигена смешивают с одним объемом 20%-ного раствора детергента. Чтобы один раз заполнить лунку, достаточно образца объемом 20 мкл. После того как жидкость впитается, можно заполнить лунку еще раз.

10. Слой агарозы накрывают крышкой от чашки Петри и помещают стопку пластин во влажную камеру. Диффузию проводят в течение 1--3 сут.

11. Для удаления избытка сыворотки пластины на ночь помещают в PBSA.

12. Буферный раствор сливают и на поверхность агарозы помещают кружок из фильтровальной бумаги. Пластины высушивают в термальной комнате в токе воздуха. Агарозу окрашивают каким-либо красителем, выявляющим белок, 5 мин при комнатной температуре. Затем отмывают пластины 20%-ной уксусной кислотой, 50%-ным метанолом и вновь высушивают. Этот метод исключительно гибок; его легко адаптировать для авторадиографии или тестирования антител, в том числе моноклональных. Антигены, используемые при этом, должны быть, однако, очищены во избежание неспецифических эффектов.

3.3 Другие методы идентификации пикорнавирусов

После того как зараженная клеточная культура подвергается дифференциальному центрифугированию или какой-либо другой процедуре фракционирования, необходимо идентифицировать фракции, содержащие нужный материал. При необходимости можно использовать методы, описанные в разд. 3.1 и 3.2, но они требуют довольно много времени; альтернативные подходы состоят в том, что во фракциях градиента по поглощению в ультрафиолете идентифицируют пики РНК или белка или же в материал, подвергаемый очистке, включают в качестве маркера радиоактивно меченный вирус. Затем в аликвотах из каждой фракции любым стандартным методом можно определить радиоактивность. Если есть возможность получить радиоактивно меченный материал, данный метод очень удобен, поскольку он занимает мало времени, точен и прост в исполнении.

4. Очистка вирусов

4.1 Общие замечания

Препараты пикорнавирусов, полученные из культур тканей, контаминированы клеточными компонентами, в том числе мембранами, и если вирус предполагается использовать для антигенного или биохимического анализа, его необходимо очистить. При этом, как правило, используют тот или иной метод центрифугирования в градиенте плотности. Если работа ведется со значительными количествами вируса, очистке обычно предшествует концентрирование, например осаждение вируса сульфатом аммония или полиэтиленгликолем в присутствии хлористого натрия; осадок затем собирают с помощью низкоскоростного центрифугирования. Применяют и непосредственное осаждение вируса ультрацентрифугированием, особенно если исходный объем невелик.

4.2 Концентрирование пикорнавирусов

4.2.1 Осаждение сульфатом аммония

1. Берут навеску сульфата аммония из расчета 0,4 г на 1 мл культуральной жидкости.

2. К сульфату аммония приливают культуральную жидкость, содержащую 1% сыворотки для ускорения осаждения вируса, и тщательно перемешивают до растворения кристаллов. Раствор при этом подкисляется и слегка мутнеет.

3. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 g и 4°С в течение 1--2 ч, например на центрифуге MSE 4L.

4. Супернатант осторожно сливают, а осадок растворяют в буферном растворе, объем которого должен составлять не менее 10% исходного, чтобы обеспечить достаточное разбавление сульфата аммония. Данный метод с успехом применялся как для кислоточувствительных риновирусов, так и для кислотоустойчивых энтеровирусов. При этом удается сконцентрировать вирус не более чем в 10 раз, но преимущество метода в его быстроте. Выход вируса составляет 99% или больше.

4.2.2 Осаждение полиэтиленгликолем в присутствии хлористого

натрия

1. В 100 мл культуральной жидкости при 4°С на магнитной мешалке растворяют 2,22 г хлористого натрия.

2. После растворения соли добавляют 7 г полиэтиленглико-ля 6000.

3. Суспензию перемешивают по крайней мере 4 ч.

4. Суспензию центрифугируют при 2000 g и 4°С 2 ч, например на центрифуге MSE 4L.

5. Супернатант сливают, а осадок ресуспендируют в PBS, содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина. Суспензию обрабатывают ультразвуком или гомогенизируют, чтобы разрушить крупные агрегаты.

6. Суспензию центрифугируют при 3000 g 10 мин для удаления нерастворившегося материала. Данный метод обеспечивает 100%-ный выход вируса, позволяет избежать колебаний рН и достигнуть более высокой степени концентрирования, чем метод с использованием сульфата аммония. Однако осаждение полиэтиленгликолем требует больше времени.

4.2.3 Концентрирование пикорнавирусов с помощью

ультрацентрифугирования

Из пробирки высотой 5 см полиовирус можно количественно осадить центрифугированием при 100 000 g в течение 1 ч, а из пробирки высотой 12 см -- в течение 3 ч. Данный метод имеет преимущество перед описанными выше, поскольку не требует добавления никаких реагентов к препарату вируса, что снижает вероятность соосаждения примесных белков. Однако метод удобен лишь при работе с образцами небольшого объема; возможны затруднения и при растворении осадка вируса.

4.3 Очистка пикорнавирусов

4.3.1 Общие замечания

Хотя сами по себе вирионы пикорнавирусов не содержат липидов, в клеточных фракциях они часто связаны с мембранами, и для разрушения этой связи обычно применяют детергент в концентрации 1%. Если не удалить клеточные мембраны, то на следующих стадиях очистки не удается освободить вирус от примесей. Использовались самые разные детергенты, начиная с мягкого неионного детергента нонидета Р-40 и кончая ДДС-Na или саркозилом. По-видимому, наиболее разумно использовать мягкие детергенты, так как пустые капсиды и вирионы некоторых вирусов могут разрушаться более сильно действующими агентами. Мы, как правило, используем 1%-ный NP-40.

Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в градиенте плотности. В связи с малыми размерами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150-- 160 S, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной структуре они имеют высокую плавучую плотность. В градиентах концентрации сахарозы такая плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида или сульфата цезия.

Градиенты фракционируют с помощью имеющихся в продаже специальных приспособлений или с помощью той или иной модификации прибора, изображенного на рис. 3.



Среди вирионов полиовируса обнаруживаются инфекционные частицы с коэффициентом седиментации 150--160 S, обладающие «0»-антигенностью, и неинфекционные частицы с коэффициентом седиментации 130 S, обладающие «С»-антигенностью и образующиеся, вероятно, из-за неспособности части вирионов проникнуть в клетки после адсорбции. Пустые капсиды имеют коэффициенты седиментации около 80 S и несут «С»-антиген, однако иногда обнаруживаются и частицы с «0»-антигеном и коэффициентом седиментации 70 S; могут образоваться также субвирусные частицы с коэффициентом седиментации 14 S. Очевидно, что если вирус выделяют для иммунологического анализа, необходимо разделить все эти компоненты.

4.3.2 Очистка пикорнавирусов с использованием градиентов

концентрации сахарозы

1. Готовят два раствора сахарозы в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl и 50 мМ NaCl. Первый раствор содержит 15 г, а второй --45 г сахарозы в 100 мл буфера.

2. Используя по 15 мл каждого из этих растворов и приспособление для получения градиентов, готовят линейные градиенты концентрации сахарозы объемом 30 мл в пробирках объемом 35--40 мл.

3. Готовят 10%-ный раствор NP-40 в буфере PBS. К образцу добавляют 1/10 объема этого раствора; объем образца не должен превышать 6 мл. При встряхивании образца с детергентом раствор должен становиться прозрачным.

4. Образец осторожно наслаивают на полученный ранее градиент. Пробирки уравновешивают минеральным маслом.

5. Пробирки центрифугируют при 80 000 g и 4°С в течение 4 ч.

6. Градиент фракционируют, как описано в разд. 4.4, или каким-либо другим методом. Во фракциях определяют содержание вируса. Инфекционный вирус должен давать пик примерно на расстоянии 2/3 длины пробирки от мениска.

Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах концентрации сахарозы не требует много времени и существенных материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов. Однако при этом препараты вирусов могут содержать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Как правило, это необязательно; можно осадить вирус для удаления сахарозы.

4.3.3 Очистка пикорнавирусов центрифугированием в градиентах

плотности хлористого цезия

Можно предложить следующую методику с использованием преформированных градиентов.

1. Готовят 40%-ный раствор хлористого цезия, растворяя 4 г сухой соли в 6 мл 0,01 М трис-HCl.

2. Готовят 5%-ный раствор хлористого цезия, растворяя 0,5 г хлористого цезия в 9,5 мл 0,01 М трис-НС1.

3. Используя по 5 мл каждого из приготовленных растворов и приспособление для получения градиентов, готовят 10 мл линейного градиента концентрации хлористого цезия в пробирке для ультрацентрифуги объемом 12 мл. Образец объемом 1 мл, содержащий 1% NP-40, наслаивают на градиент. Можно для приготовления градиента вместо 5%-ного раствора хлористого цезия использовать 6 мл образца, содержащего 1% NP-40, и 6 мл 40%-ного CsCl. После приготовления градиента используемое приспособление промывают и дезинфицируют. Пробирки уравновешивают.минеральным маслом.

4. Градиенты центрифугируют при 120 000 g и 4°С по крайней мере около 4 ч.

5. Градиенты фракционируют, как описано в разд. 4.4 или каким-либо другим методом, и определяют содержание вируса во фракциях. Можно фракционировать образцы и в устанавливающихся по ходу центрифугирования градиентах, пользуясь следующей методикой.

1. К раствору образца добавляют сухой хлористый цезий из расчета 0,46 г на 1 мл конечного объема раствора. Если объем пробирки 4,5 мл, к образцу добавляют 2,07 г сухого хлористого цезия и доводят объем до 4,5 мл PBS или 0,01 М трисом; добавляют NP-40 до концентрации 1%.

2. Центрифугируют раствор при 140 000 g и 4°С в течение 24 ч.

3. Градиенты фракционируют, как описано ниже или каким-либо другим методом, и определяют содержание вируса во фракциях.

Методы с использованием хлористого цезия требуют существенных материальных затрат, но позволяют получить высоко-очищенный вирус и работать с большими объемами образцов как в случае преформированного, так и формирующегося по ходу центрифугирования градиента. Использование ДДС-Na в качестве детергента не рекомендуется, так как додецилсульфат цезия нерастворим. Существенный недостаток градиентов хлористого цезия помимо высокой стоимости этой соли состоит в том, что в них может происходить модификация вирусов. В частности, имеются данные, что риновирусы могут поглощать ионы цезия и в результате приобретать аномально высокую плотность. Аналогичное явление описано и для полиовируса.

4.4 Фракционирование градиентов

В продаже имеются устройства для фракционирования градиентов, но простое самодельное приспособление дает не худшие результаты; при этом оно дешевле и удобнее в обращении.

Это приспособление представляет собой резиновую пробку, подходящую по диаметру к используемой центрифужной пробирке. В центральное отверстие пробки вставлена тонкая стальная трубочка; на нее сверху натянут небольшой кусок силиконового шланга.

1. Пробирку с градиентом зажимают вертикально в штативе и затыкают пробкой.

2. Силиконовый шланг зажимают, после чего дно пробирки прокалывают нагретой иглой.

3. Под отверстием в дне пробирки помещают какой-либо подходящий сосуд и вытекание раствора контролируют, отпуская или частично зажимая силиконовый шланг.

Определяя объем на глаз, легко собирать фракции по 0,5-- 2 мл; этим методом удобно пользоваться, если нужно собрать пиковые фракции, а в точном определении скорости седиментации необходимости нет. На рис. 4, а приведен результат подобного раскапывания градиента объемом 36 мл на 2-мл фракции; в градиенте центрифугировали вирус, меченный -метионином. Здесь А -- пик инфекционных частиц, а В --пик пустых капсидов.

Градиенты можно фракционировать, не прокалывая дно пробирки, с помощью приспособления, показанного на рис. 3, б. Оно представляет собой резиновую пробку, в которую вставлены тонкая стальная трубка, соединенная с коротким куском силиконового шланга, стеклянная трубка, соединенная силиконовым шлангом с резервуаром, содержащим жидкое минеральное масло, и стеклянная трубка, одним концом доходящая до дна центрифужной пробирки, а другим соединенная с силиконовым шлангом {3).

а) пробирку вертикально зажимают в штативе;

б) трубки 2 и 3 зажимают и пробку осторожно вставляют в пробирку;

в) с трубки 2 снимают зажим и впускают в верхнюю часть пробирки масло так, чтобы оно заполнило трубку /;

г) трубку / зажимают;

д) с трубки 3 снимают зажим и, по мере того как раствор вытесняется со дна пробирки, собирают фракции объемом 0,5--2 мл каждая.

Данный метод позволяет повторно использовать пробирки, но можно предположить, что в этом случае произойдут нарушение градиента и контаминация вируса. На практике, однако, мы с этим не встречались. На рис. 4, б приведены результаты раскапывания градиента объемом 36 мл, в котором центрифугировали меченный 32Р полиовирус, на 2-мл фракции. Здесь А-- пик инфекционного вируса.

Более точное раскапывание градиента на фракции определенного объема может быть достигнуто с помощью приспособления, показанного на рис. 3, е. Оно, как и описанные выше приспособления, представляет собой резиновую пробку, в которую вставлены стальная трубка, соединенная с коротким куском силиконового шланга, и стеклянная трубка, соединенная с дозатором, позволяющим вводить в пробирку порции минерального масла объемом 0,5--2 мл.

а) пробирку в вертикальном положении зажимают в штативе;

б) в пробирку вставляют резиновую пробку;

в) в пробирку вводят масло до тех пор, пока оно не начнет вытекать из трубки /, после чего трубку / зажимают;

г) дно центрифужной пробирки прокалывают;

д) вытесняя из пробирки порции раствора равного объема введением соответствующих порций масла, собирают фракции.

На рис. 4, в приведен результат раскапывания градиента объемом 36 мл, содержащего меченный -метионином полиовирус типа 3, на фракции объемом 0,5 мл. Здесь А -- пик инфекционного вируса, В -- пик пустых капсидов, С -- пик неинфекционных частиц, содержащих РНК.