37

Инициация репликации хромосомной ДНК

Содержание

1. Инициация репликации хромосомы E. coli

1.1 Белок-инициатор DnaA

1.2 Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

1.3 Этапы инициации репликации на ОНР oriC

1.4 Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

2.1 Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

2.2 Этапы пути инициации репликации на ОНР у дрожжей

3. Инициация репликации у высших эукариотов

3.1 Белковые компоненты и путь инициации репликации

3.2 Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов

4. Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

ЛИТЕРАТУРА

1. Инициация репликации хромосомы E. coli

1.1 Белок-инициатор DnaA

Белок DnaA играет ключевую роль в инициации репликации хромосомы у многих бактерий. Он последовательно выполняет 3 главные функции: 1) узнает область начала репликации oriC, последовательно связываясь с нонамерными повторами в ДНК - блоками DnaA; 2) способствует расплетанию легкоплавких АТ-богатых участков ДНК oriC; 3) вербует на расплетенные участки oriC ДНК-геликазу DnaB.

У E. coli белок DnaA имеет длину 467 остатков (рис. 3.1) и состоит из 4 определяемых гомологией доменов (I-IV), каждый из которых в разной степени участвует в инициации репликации на oriC. Наиболее консервативными среди бактериальных белков DnaA являются домены III и IV (остатки 130-350 и 351-367 соответственно). Несколько меньше гомология в N-концевом домене I (остатки 1-56), а домены II (остатки 57-129 у E. coli) белков DnaA у разных бактерий сильно различаются по длине и аминокислотной последовательности и иногда рассматриваются как неконсервативные гибкие линкеры, так как вставки или делеции в большей части домена II не влияют на функции.

Все белки DnaA имеют модульную структуру. Первые 86 остатков DnaA образуют домен олигомеризации, состоящий из гептадных повторов гидрофобных остатков. Этот домен участвует в образовании мультимерных комплексов белка DnaA на ДНК oriC. Он может обеспечивать и димеризацию других белков. Так, слияние домена олигомеризации DnaA с N-концевым доменом связывания с ДНК репрессора CI фага придает химерному белку способность к димеризации. Домен олигомеризации DnaA перекрывается с частью домена, связывающего геликазу DnaВ (остатки 24-86). В физическом контакте с DnaВ участвуют также остатки 136-148 белка DnaA. Впрочем, считается, что для эффективной функции погрузки на oriС белка DnaВ требуются почти все области DnaA.

Центральный домен III имеет открытую изогнутую структуру , типичную для связывающих нуклеотиды белков, и содержит контактный участок для связывания нуклеотидов (остатки 168-236), критическую роль в котором играет остаток лиз₁₇₈. Белок DnaA может связывать АТФ и АДФ. Связывание АТФ вызывает изменение конформации DnaA. Комплекс DnaA-АТФ абсолютно необходим для инициации репликации и является функционально активным, в отличие от неактивного комплекса с АДФ. Весь домен III обладает характеристической АТФазной активностью, но она низка и требует стимуляции другими белками. Этот домен необходим для локального расплетания ДНК в АТ-богатых областях oriC. Однако гидролиз АТФ не требуется для активности DnaA, и АТФ можно заменить на его негидролизуемый аналог АТФS.

Короткий участок в начале домена IV (остатки 372-381) участвует в регуляторных взаимодействиях DnaA с кислыми фосфолипидами клеточной мембраны. Большая часть домена IV (остатки 374-467) необходима и достаточна для специфического связывания с ДНК. В таком связывании белок DnaA узнает консервативные участки ДНК длиной 9 п.н. - “блоки DnaA” c консенсусной последовательностью 5'-ТТАТ(C/А)САСА. С этими блоками белок DnaA может взаимодействовать кооперативно и образовывать мультимерные комплексы за счет белок-белковых взаимодействий. Домен связывания с ДНК состоит из трех -спиралей: амфипатических спиралей А и В с основной петлей между ними и длинной спирали С. Мутации во всех этих участках домена связывания с ДНК могут нарушать ассоциацию DnaA с ДНК. Мутации, затрагивающие первые 12 остатков на N-конце спирали С изменяют специфичность узнавания последовательности блока DnaA.

1.2 Минимальная область начала репликации oriC y E.coli

Область начала репликации (ОНР) oriC является уникальным местом инициации нормальной двунаправленной репликации хромосомы E. coli и расположена на 84-ой мин генетической карты. Минимальная ОНР oriC имеет длину 245 п.н. (рис. 3.1). Секвенирование показало, что ОНР кольцевых хромосом других бактерий являются “множественно мутированными” вариантами oriC E. coli. Минимальные ОНР состоят из нескольких консервативных участков и из участков с одинаковой длиной, но разными последовательностями, которые, подобно участкам между блоками -10 и -35 бактериальных промоторов, играют в ОНР роль неконсервативных спейсеров.

Бактериальные ОРС содержат сайты GATC, остатки А в которых специфически метилируются ДНК-метилазой Dam. Число таких сайтов у разных бактерий составляет от 9 до 14. У E. coli в минимальной ОНР oriC содержатся 11 таких сайтов. Эти сайты, играющие важную роль в регуляции инициации репликации, довольно равномерно распределены по oriC и имеют одинаковую ориентацию.

Минимальная ОНР oriC состоит из 2 модулей. Правые 2/3 занимает модуль взаимодействия с белком DnaA. В этой области содержатся 5 потенциальных сайтов связывания DnaA (сайты R1-R5). Два из этих сайтов (R1 и R4) имеют последовательность ТТАССАСА, совпадающую с консенсусным блоком DnaA, и обладают наибольшим сродством к белку-инициатору. Два других сайта (R2 и R3) отличаются от консенсуса всего в одном положении из 9, но являются более слабыми сайтами связывания DnaA. В центре расположен сайт R5(M), который отличается от консенсусной последовательности в 3 положениях. Пары сайтов R1-R2 и R3-R4 организованы в виде инвертированных повторов. Правая область содержит также потенциальные сайты связывания двух архитектурных гистоноподобных белков E. coli: хозяйского фактора интеграции IHF и фактора стимуляции инверсии Fis.

Левая треть ОНР oriC занята АТ-богатыми последовательностями, в которых происходит плавление днДНК во время инициации. Она состоит из 3 прямых повторов длиной 13 п.н. (“13-меров” L, M и R), каждый из которых начинается сайтом GATC и содержит 9-11 пар А:Т. Кроме того, с 5'-стороны от блока 13-меров расположен участок длиной 12 п.н., из которых 11 являются парами А:Т. Для инициации репликации необходимо специфическое взаимодействие белка DnaA с 13-мерами R и М, в которых допустимы очень немногие замены оснований. Левый 13-мер L можно сильно изменить без утраты oriC способности к инициации, лишь бы этот участок остался АТ-богатым. 5'-фланговая АТ-богатая область также участвует в раскрывании двойной спирали ОНР.

aaagacctgggatcctggg tattaaaaagaa gatctatttattt aga gatctgttctatt

tttctggaccctaggaccc ataatttttctt ctagataaataaa tct ctagacaagataa

AT L M

gt gatctcttattag gatcgcactgccc tgtggataa caaggatccggcttttaa

ca ctagagaataatc ctagcgagacggg acacctatt gttcctaggccgaaaatt

R R1

gatcaacaacctggaaaggatcattaac tgtgaatga tcggtgatcctggaccgtataagctgg

ctagttgttggacctttcctagtaattg acacttact agcctctaggacctggcatattcgacc

IHF R5(M)

gatcagaatgagggg ttatacaca actcaaaaactgaacaacagttgttc tttggataa ct

ctagtctttctcccc aatatgtgt tgagtttttgacttgttgtcaacaag AaACCTATT ga

R2 Fis R3

accggttgatccaagcttcctgacagag ttatccaca gtagatcgcac

tggccaactaggttcgaaggactgtctc aataggtgc catctagcgtg

R4

Рис. 2. Минимальная область начала репликации oriC E. coli.

Вертикальными линиями отмечены границы минимальной области ori. Cайты GATC изображены прописными буквами, а блоки DnaA (R1-R5) -подчеркутыми прописными буквами и указана их ориентациия (строчными буквами в этих блоках отмечены отклонения от консенсусной последовательности 5'-ТТАТССАСА). Курсивом с подчеркиванием обозначены сайты связывания белков IHF и Fis. Двусторонние стрелки отмечают положения АТ-богатых областей (АТ-участка и 13-меров L, M и R). Подчеркнутыми жирными буквами набраны сайты связывания DnaA-АТФ и стрелками указана их ориентация

1.3 Этапы инициации репликации на ОНР oriC

Для инициации репликации в ОНР oriC необходимо, чтобы матрица ДНК находилась в сверхскрученной кольцевой форме. Первой стадией инициации является образование начального “преинициирующего” комплекса, в котором белок DnaA в мономерной форме связывается с 4 более сильными из 5 блоков DnaA (R1-R4). Связывание DnaA вызывает изгибание ДНК на 40^о в каждом из этих блоков (рис. 3.3). Первичный комплекс содержит также белок Fis, ассоциированный с узнаваемым им сайтом рядом с нонамером R2. Дальнейшая сборка комплекса инициации требует кооперативной мультимеризации многих молекул белка DnaA. Предполагается, что Fis ингибирует продвижение инициации до тех пор, пока на oriC не соберется достаточный набор молекул DnaA.

Рис. 2. Цикл инициации репликации хромосомы E. coli

После этого белок Fis покидает область oriC, белок DnaA прочно связывается со слабым сайтом R3, и в комплекс входит фактор IHF, который вызывает очень сильное изгибание ДНК. Такой же эффект достигается в отсутствие IHF при более высокой концентрации DnaA. В результате образуется искривленный компактный нуклеопротеиновый комплекс ДНК oriC, содержащий около 20 молекул DnaA. В присутствии ещё одного гистоноподобного белка HU при высокой концентрации АТФ (более 20 мМ) и при физиологической температуре (37^о) образуется “открытый” комплекс инициации, в котором расплетаются АТ-богатые области на левом фланге oriC. В этом процессе должна участвовать активная форма DnaA-АТФ, но гидролиз связанного АТФ не происходит, так что его энергия не используется для расплетания нитей ДНК. Возможно, причиной локального плавления ДНК являются напряжения, возникающие в нуклеопротеиновом комплексе с DnaA-АТФ. Расплетание начинается в правом 13-мере R, а затем распространяется на элементы L и М.

Следует учесть также, что в процессе расплетания ДНК участвуют дополнительные сайты связывания белка DnaA в АТ-богатых участках ДНК, названные пентамерными блоками DnaA-АТФ и имеющие консенсусную последовательность 5'-AGatct. Эти сайты имеют очень низкое сродство к DnaA-АТФ в днДНК и гораздо более высокое сродство в расплетенной онДНК. Высказано предположение, что вначале DnaA-АТФ связывается с высоким сродством с сайтом R1 в днДНК, и из этой якорной области начинается кооперативное связывание DnaA-АТФ с соседними пентамерными блоками. Это приводит к дестабилизации двойной спирали в АТ-богатой области 13-меров и её расплетанию. Разошедшиеся одиночные нити ДНК стабилизируются комплексом DnaA-АТФ, имеющим к ним высокое сродство. В момент начала расплетания с областью oriC связываются 18 мономеров DnaA-АТФ, но в открытом комплексе число связанных комплексов DnaA-АТФ увеличивается до 24-30 за счет взаимодействия с однонитевыми расплетенными участками. Расплавленная область вначале имеет длину 28 п.н., но затем онДНК покрывается белком SSB, и длина области денатурации ДНК увеличивается до 44-46 п.н.

Частичное плавление ОНР служит предпосылой для связывания ДНК-геликазы DnaВ, которая вербуется на свободную от белка SSB онДНК в составе комплекса с её погрузчиком DnaС (см. раздел 2.1). В вербовке этого двойного гексамера на oriC участвует сам связанный с ДНК белок DnaA, который взаимодействует N-концевым доменом I с центральной -областью DnaВ и центральным доменом III с N-концом DnaВ. Для погрузки геликазы DnaВ требуется почти весь белок DnaA, но связывание АТФ с DnaA не является обязательным.

С начальным однонитевым пузырьком ДНК длиной 44 н. связываются два гексамера DnaВ-DnaС и увеличивают его длину до 65 н. Гидролиз АТФ в этом комплексе вызывает освобождение DnaС и активацию геликазной активности DnaВ. В результате с расплавленным АТ-богатым участком oriC оказываются связанными два активных гексамерных DnaВ - по одному на 5'-стороне каждой из разошедшихся нитей ДНК. Это, вероятно, обусловлено существованием двух разнонаправленных триад сайтов связывания DnaA-АТФ в каждой из двух нитей и, в конечном итоге, приводит к сборке на ОНР oriC двух дивергентно ориентированных репликативных вилок. Два геликазных комплекса движутся по комплементарным нитям ДНК в направлении 5'3' друг мимо друга и взаимодействуют с праймазой DnaG, которая синтезирует затравки РНК вначале для ведущих, а затем отстающих нитей двух разнонаправленных репликативных вилок (рис. 3.4). На праймированных сайтах собираются два скользящих зажима -субъединиц ДНК-полимеразы III и два димера ее каталитических -субъединиц. Таким образом, инициация репликации ДНК на oriC завершается образованием двух движущихся в противоположных направлениях репликативных вилок.

Рис. 4. Этапы образования двух разнонаправленных репликативных вилок при инициации репликации в области oriC хромосомы E.coli.

1 - связывание белка DnaA, 2 - связывание двойного гексамера DnaВ-DnaС, 3 - погрузка колец белка DnaВ и геликазы DnaG и синтез праймеров для ведущей и отстающей нитей двух репликативных вилок.

I - гексамер DnaВ, II - мономер DnaС, III - белок DnaА, IV - блоки DnaА, V - 13-меры, VI - праймеры для ведущей нити (для репликативных вилок, движущихся влево или вправо - на верхней и нижней матричных нитях соответственно), VII - праймеры для отстающей нити (для репликативных вилок, движущихся влево или вправо - на нижней и верхней матричных нитях соответственно).

1.4 Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli

Контроль инициации репликации хромосомы в области oriC имеет два аспекта. Прежде всего, репликация инициируется в фиксированный момент клеточного цикла, через интервалы, равные времени удвоения клеточной массы. Время, требующееся для полной репликации генома, распределения дочерних хромосом и подготовки клетки к делению, в первом приближении не зависит от скорости роста клеток и составляет около 60 мин при 37^о. Если период генерации клеток меньше этого времени (например, в богатых средах), клетки инициируют репликацию хромосомы для следующей генерации ещё до завершения предыдущего раунда синтеза ДНК. Вследствие этого в быстро растущих культурах каждая клетка содержит 2ⁿ или 2ⁿ⁺¹ ОНР, где n - целое положительное число. Такое число ОНР обеспечивает распределение равного числа хромосом между двумя дочерними клетками при делении. Независимо от числа ОНР, репликация инициируется на всех ОНР в одной клетке одновременно. Механизмы, ответственные за сопряжение репликации бактериальных хромосом с клеточным циклом, пока изучены недостаточно. Предполагается, что инициация происходит при определенной клеточной массе, при которой cоздается критический “потенциал инициации”, т.е.достигается пороговая концентрация свободного белка DnaA в клетке или, скорее, его активной формы, т.е. комплекса с АТФ.

Второй аспект регуляции состоит в том, что каждая копия ОНР oriC в данной клетке используется для инициации репликации только один раз за клеточный цикл. Этот механизм контроля очень важен для жизнеспособности дочерних клеток и изучен более хорошо. Рассмотрим три пути, участвующих в такой регуляции.

Секвестрирование oriC

Этот механизм определяется состоянием метилирования сайтов GATC в ОНР. В момент инициации репликации эти сайты в днДНК полностью метилированы, что способствует более эффективной инициации. В образовавшихся репликативных вилках вновь синтезированные нити ДНК включают неметилированные основания, так что в днДНК метилирована только родительская нить. В большинстве областей хромосомы метилирование de novo сайтов GATC под действием метилтрансферазы Dam происходит очень быстро (менее чем за 1 мин). Однако в области oriC метилирование сайтов GATC задержано на 13 мин, т.е. на треть клеточного цикла. На гемиметилированных сайтах GATC oriC инициация репликации нормально проходит в системах in vitro, но не идет in vivo. Это позволило предположить существование внутриклеточного фактора, являющегося негативным регулятором инициации и блокирующего (секвестрирующего) гемиметилированные ОНР в состоянии, недоступном как для быстрого метилирования под действием Dam, так и для быстрой реинициации репликации.

Таким фактором оказался белок SeqA длиной 181 остаток, несущественный для жизнеспособности клеток. В мутанте seqA метилирование вновь синтезированной ДНК oriC задержано не на 13 мин, а всего на 5 мин, в результате чего значительно нарушается синхронность репликации на множественных oriC. Белок SeqA преимущественно связывается с гемиметилированными, а не с полностью метилированными и неметилированными 13-мерами в oriC, в начале каждого из которых расположен сайт GATC. Из двух сайтов связывания SeqA в области 13-меров наиболее сильный расположен в 13-мере L. Белок SeqA связывается с этими гемиметилированными сайтами с большим сродством, чем метилаза Dam. К тому же SeqA имеет более высокую концентрацию в клетках, чем Dam, и не смещается с ДНК в присутствии Dam. Поэтому связывание SeqA с областью 13-меров защищает ДНК oriC от метилирования под действием Dam. Такое связывание приводит также к временной ассоциации области Dam c внешней мембраной клетки, поскольку белок SeqA может вести себя как мембранный белок. Связывание с мембраной не зависит от присутствия на ДНК oriC белка DnaА. Однако связывание SeqA с ДНК нестабильно, и через 10 мин связанный белок SeqA диссоциирует от ОНР oriC и делает её доступной для метилирования под действием метилазы Dam. Это приводит к восстановлению полностью метилированного состояния ДНК oriC, благоприятного для инициации.

Второй мишенью для секвестрирования при участии белка SeqA является промоторная область гена dnaA, кодирующего сам белок-иницатор. Она содержит не только блоки oriC, но и один сайт GATC, который после прохождения репликации также надолго задерживается в гемиметилированном состоянии из-за связывания с ним SeqA. Это вызывает временное ингибирование инициации транскрипции гена dnaA и препятствует увеличению концентрации белка DnaA в клетке. На том же уровне работают ещё два механизма предотращения несвоевременной инициации репликации в ОНР oriC.

Pегуляция уровня свободного белка DnaA

Белок DnaA связывается с узнаваемыми им блоками DnaA не только в oriC и в гене dnaA, но и в ещё ~300 cайтах хромосомы E. coli. Эти сайты имеют имеют разное сродство к DnaA и конкурируют с oriC за связывание инициатора, понижая концентрацию свободного белка DnaA в клетке. Среди 5 областей хромосомы E. coli, имеющих наиболее высокое сродство к DnaA, особое положение занимает локус datA, расположенный на 95-ой мин хромосомы и реплицирующийся вскоре после инициации репликации на oriC. Этот локус длиной 950 п.н. содержит 4 блока DnaA, т.е. примерно столько же, как и ОНР oriC и соседний ген mioC, но может оттитровывать в 8 раз больше белка DnaA (300-400 молекул DnaA in vivo). Он неспособен секвестрироваться при участии SeqA, т.к. содержит очень мало сайтов GATC. Сразу после репликации локуса datA, которая происходит примерно в момент окончания секвестрирования oriC, количество связанного с ним белка DnaA удваивается, что приводит к значительному понижению внутриклеточного уровня свободного DnaA на следующем этапе клеточного цикла. Улавливание DnaA локусом datA существенно для регуляции инициации репликации хромосомы. Удаление datA из хромосомы вызывает избыточную инициацию, а повышение числа копий datA в клетке полностью выключает инициацию репликации на oriC. Однако перенос локуса datA в другие положения хромосомы не нарушает функцию datA, так что ранняя репликация datA несущественна для контроля инициации.

Регуляция активности белка DnaA

Сборка скользящих зажимов -субъединиц ДНК-полимеразы III при инициации репликации на oriC запускает так называемый механизм RIDA регуляторной инактивации DnaA - гидролиз АТФ в активной форме DnaA-АТФ и переход белка-инициатора в неактивную форму DnaA-АДФ. Гидролиз АТФ ускоряется -субъединицей PolIII и ещё одним недостаточно охарактеризованным белком IdaB. Этот механизм понижает “потенциал репликации”, как только был запущен раунд репликации хромосомы. Однако он недостаточен для предотвращения реинициации в отсутствие секвестрирования oriC и титрования локусом datA.

Период полураспада комплексов DnaA с АТФ или АДФ in vitro одинаков и составляет ~ 1 час. Однако если связанный с ДНК белок DnaA инкубировать в присутствии анионных фосфолипидов, ассоциированные с DnaA нуклеотиды освобождаются очень быстро, и DnaA, утративший связанный АДФ, приобретает способность связывать АТФ и возвращаться в активную форму DnaA-АТФ. Белок DnaA очень часто связывается с клеточной мембраной и взаимодействует в ней с анионными фосфолипидами. Это способствует накоплению комплекса DnaA-АТФ к моменту инициации следующего раунда репликации. Отсутствие в клетке анионных фосфолипидов вызывает неспособность инициировать репликацию хромосомы из oriC.

Таким образом, три разных механизма предотвращают преждевременную реинициацию и вносят вклад в запуск репликации в определенный момент клеточного цикла. Однако пока не доказано, что сочетания только этих механизмов достаточно для строгой регуляции инициации репликации хромосомы E. coli.

2. Инициация репликации у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

2.1 Области начала репликации (ОНР) ARS и комплекс узнавания ОНР (ORC)

У S. cerevisiae были идентифицированы специфические элементы хромосомной ДНК, названные автономно реплицирующимися последовательностями ARS (autonomously replicating sequences). Встраивание этих элементов в кольцевые плазмидные ДНК обеспечивает автономную репликацию плазмид в клетках дрожжей. С использованием метода двумерного гель-электрофореза, позволяющего обнаружить репликативные пузырьки ДНК, было показано, что элементы ARS совпадают с сайтами начала двунаправленной репликации ДНК как в содержащих ARS плазмидах, так и в самих дрожжевых хромосомах. Таким образом, последовательности ARS являются функциональными ОНР хромосомной ДНК S. cerevisiae. Эти свойства дрожжевых ОНР значительно облегчили их изучение.

В 16 хромосомах S. cerevisiae содержатся от 250 до 400 ОНР. Все изученные элементы ARS у дрожжей, имеющие модульную структуру, состоят из доменов А и В и имеют длину 100-150 п.н. (рис. 3.4). Домен А содержит консенсусную последовательность, названную ACS (ARS consensus sequence). Элемент ACS длиной 11 п.н. имеет первичную последовательность (A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T), являющуюся существенной для инициации репликации. Даже одиночные замены нуклеотидов в ACS могут устранить активность ARS. Тем не менее, некоторые известные ARS, содержащие одну и даже две измененные пары нуклеотидов по сравнению с ACS, являются эффективными ОНР. С другой стороны, не каждая последовательность ACS в геноме проявляет активность ОНР в отсутствие других доменов ARS.

Домен В в ARS состоит из 3 элементов. Ближайший к ACS элемент В1 образует вместе с ACS сайт связывания белкового комплекса узнавания ОНР. Богатый остатками А и Т элемент В2 выполняет функцию элемента расплетания ДНК DUE. Репликация ДНК в прототипной хромосомной ОНР ARS1 инициируется примерно посередине между сегментами В1 и В2. Элемент В3 в некоторых ARS связывает фактор транскрипции Abf1 и играет роль вспомогательного элемента AUX, обеспечивающего оптимальную эффективность инициации репликации. Элементы доменов В в различных элементах ARS у дрожжей гораздо менеее консервативны, чем домен А. Наиболее консервативным из них является элемент В1.

В прототипный элемент ARS1 иногда включают и третий домен С, расположенный по другую сторону от ACS и упакованный в уникально позиционированную нуклеосому. Эта нуклеосома, вероятно, понижает вероятность упаковки смежного сайта ACS в другую нуклеосому, которая могла бы подавить активность ARS1.

C последовательностью ACS и смежным сегментом В1 в дрожжевых ARS на протяжении почти всего клеточного цикла связан белковый комплекс узнавания ori (ORC - origin recognition complex). Общее количество комплексов ORC в одной клетке примерно соответствует числу ARS. Этот комплекс состоит из 6 белков, кодируемых существенными генами ORC1-ORC6. Аналогичные комплексы ORC имеются у всех эукариотов (табл. 4.1). Три субъединицы комплекса (Orc1, Orc4 и Orc5) содержат сайты связывания нуклеотидов, как у ДНК-зависимых АТФаз, и относятся к семейству АТФаз ААА+. Самая большая субъединица Orc1 может гидролизовать АТФ in vitro, но в присутствии ДНК ARS гидролиз АТФ предотвращается. По-видимому, как и в случае белка DnaA, связанный АТФ играет в ORC роль аллостерического эффектора, требующегося для специфической ассоциации с последовательностями ДНК ARS, а гидролиз АТФ идет на более поздних стадиях инициации репликации.

AAATTTCGAAAAATGCT AAGAAATAGGTTAGTACTGAGTAGT

B3

ATTTATTTAAGTATT GTTTGTGCACTTGCCTG CAAGGGCCTTTT

B2

GAAAAGCAAGCAT AAAAGATC TAAACATAAAA TCTGTAAAATAACA

B1 ACS

сайт связывания комплекса ORC

Рис. 5. Организация прототипной области начала репликации ARS1

S. cerevisiae.

Изогнутыми стрелками отмечены сайты инициации двунаправленной репликации хромосомной ДНК. Приведена последовательность комплементарной нити сайта ACS

После образования двунаправленных репликативных вилок геликаза МСМ и белок Cdc45 выходят из контакта с комплексом ORC и перемещаются вместе с репликативной ДНК-полимеразой. На ДНК ARS остается только пострепликативный комплекс, содержащий ORC - как и в начале пути инициации репликации. Такие комплексы существуют в течение митоза и ранней фазы G₁ на копиях ARS в обеих дочерних хромосомах.

3. Инициация репликации у высших эукариотов

3.1 Белковые компоненты и путь инициации репликации

Гомологи большинства белков S. cerevisiae, участвующих в описанном выше пути инициации репликации (Orc1-Orc6, Cdc6, Mcm2-Мcm7, Cdc7-Dbf4 и Cdc45), сохраняются и у высших эукариотов (дрозофилы, лягушек Xenopus laevis и человека). В отличие от дрожжей, у которых в общем контроле клеточного цикла участвует одна киназа Cdc28, высшие эукаритоы на разных стадиях цикла используют разные циклин-зависимые протеинкиназы. Поэтому следует уточнить, что дрожжевые комплексы Cdc28-Clb5,6 у высших эукариотов заменяются комплексами протеинкиназы Сdk2 с циклинами А и Е.

Особенно интересны свойства эукариотических белков Orc, которые, по аналогии с дрожжами, должны узнавать области начала репликации. Среди S. cerevisiae, дрозофилы и человека эти белки идентичны на 18-27% и гомологичны на 33-39% (табл. 4.1). Исключение составляет наименее консервативный белок Orc6, который у дрожжей не требуется для стабильного связывания ORC c ОНР. Максимальную гомологию проявляют белки Orc4. Более того, дрожжевому белку Orc4, участвующему во взаимодействии с последовательностью ACS, структурно гомологичны белок-инициатор репликации RepA плазмиды из бактерий Pseudomonas и белок Сdc6 из архея Pyrobaculum aerophilum. Это указывает на их консерватизм во всех 3 царствах жизни. Для 5 белков комплекса ORC (Orc1-Orc5) из многих эукариотов выполняется общее правило: их гомология на C-конце выше, чем на N-конце. С-концевые домены этих белков, вероятно, участвуют в гетероолигомеризации при образовании гексамерного комплекса ORC. Так, у человека С-конец Orc2 взаимодействует с Orc3, а С-конец Orc3 необходим для вовлечения в ORC субъединиц Orc4 и Orc5. N-концевые домены белков Orc, предположительно, требуются для взаимодействия с другими клеточными белками или с разными последовательностями ДНК.

Консерватизм основных участников последовательных стадий сборки инициирующих комплексов репликации согласуется и с экспериментальными данными, показавшими, что в общих чертах этапы пути инициации репликации у высших эукариотов такие же, как изображено на рис. 00 для S. cerevisiae. Однако имеются два существенных различия.

Если у почкующихся дрожжей комплекс ORC ведет себя как единое целое и остается связанным с ARS на протяжении всего клеточного цикла, то у млекопитающих этот комплекс разбирается по меньшей мере частично во время митоза и вновь собирается в самом начале фазы G₁. Так, белок Orc1 очень слабо ассоциирован с хроматином в митотических клетках млекопитающих и прочно связывается с ДНК в ранней фазе G₁ одновременно со сборкой преинициирующего комплекса. Такое временное освобождение Orc1 и, возможно, других компонентов ORC отсрочивает сборку предрепликативного комплекса до завершения митоза и восстановления ядерной структуры. Детали регуляции этого процесса сборки-разборки ORC были уточнены у Xenopus. В этой системе белки Orc освобождаются из хроматина при инкубации с экстрактом из метафазных клеток или с протеинкиназным комплексом Cdc2 - циклин А. Такое освобождение коррелирует с фосфорилированием субъединиц Orc1 и Orc2. Та же самая циклин-зависимая протеинкиназа ответственна и за продвижение клеток в фазу М. Одновременно она блокирует инициацию репликации до завершения фазы митоза, вызывая временную разборку комплекса ORC в конце каждого клеточного цикла.

Второй особенностью пути инициации репликации у высших эукариотов является участие наряду с Cdc6 дополнительного белка - фактора лицензирования репликации RLF-2 - в погрузке комплекса МСМ на ОRC, связанный с хроматином. В яйцах Xenopus RLF-2 также нужен для ассоциации белков Mcm с хроматином, хотя, скорее всего, его главная функция реализуется на более поздней стадии перехода от предрепликативного комплекса к комплексу активной репликации.

3.2 Проблема существования областей начала репликации у высших эукариотов

В отличие от белков аппарата инициации репликации, короткие ARS, идентифицированные у S. cerevisiae, оказались нетипичными для эукариотических ОНР. Даже у делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe хромосомные сегменты, обеспечивающие автономную репликацию плазмид, являются гораздо более длинными (~ 1000 п.н.). Типичная минимальная последовательность ARS из S. pombe (рис. 3.9) cодержит 3 критические области (I, II и III). Область I длиной 40 п.н. состоит почти исключительно из остатков А в одной из нитей. Напротив, область III (65 п.н.) в этой нити содержит преимущественно остатки Т (11 повторов ТТТТА). В центральной области II (165 п.н.) имеются короткие отрезки из остатков А или Т и богатый ГЦ сегмент, усиливающий активность ARS. Все 3 области можно заменить на синтетические сегменты поли(дА/дТ) длиной 40 п.н. без понижения активности ARS. По-видимому, для этой активности в ОНР S. pombe необходимы повторы из 3 и более последовательных остатков А или Т. У других видов дрожжей автономную репликацию плазмид обеспечивают более сложные хромосомные фрагменты, включающие не только ОНР, но и похожие на центромерную ДНК последовательности CEN, обеспечивающие правильное распределение плазмид в дочерние клетки.

 А.

90 40 60 165 330 65 190 (п.н.)

область I область II область III

В.

ori ori' ori

17 5 23 (т.п.н.)

DHFR зона активности ori 2BE2121

55 т.п.н.

Рис. 9. Организация некоторых ОНР у эукариотов

А. Минимальная область автономно реплицирующейся последовательности ARS2404 S. pombe.

Обозначены размеры существенных областей I, II и III и расстояния между ними. Жирной линией указано положение зоны инициации репликации, идентифицированной методом двумерного электрофореза

В. Локус DHFR областей начала репликации (ori, ori' и ori) в клетках СНО китайского хомячка

Анализ возможных ОНР у высших эукариотов оказался весьма затруднительным из-за отсутствия хромосомных фрагментов ARS, которые в плазмидах реплицируются столь же эффективно, как и в хромосомной ДНК. Выделить такие ОНР методом клонирования на плазмидах невозможно. В лучшем случае они очень неэффективны в роли ARS. Поэтому для идентификации областей хромомомы, в которых происходит инициация репликации, приходится использовать более сложные методы, имеющие недостаточно высокую разрешающую способность.

Первый метод физического картирования ОНР в клетках млекопитающих основан на двумерном электрофорезе в агарозном геле рестрикционных фрагментов хромосом, выделенных из синхронизированной в фазе S клеточного цикла культуры клеток. При разделении в первом направлении используют низкую концентрацию агарозы и небольшую напряженность электрического поля. В этих условиях фрагменты ДНК разделяются в соответствии с их молекулярными массами независимо от формы. При разделении в направлении, перпендикулярном первому, применяют условия, в которых электрофоретическая подвижность фрагментов ДНК становится зависящей от формы (высокую концентрацию агарозы, низкую температуру и высокую напряженность). Линейные нереплицированные молекулы ДНК, имеющие одинаковую подвижность в обоих условиях, располагаются после двумерного электрофореза на диагонали агарозной пластинки. Разветвленные, имеющие форму буквы Y фрагменты, содержащие одну репликативную вилку, мигрируют более медленно, чем линейные, и образуют выше диагонали дугу с восходящей и нисходящей ветвями. Еще медленнее мигрируют фрагменты ДНК, в центре которых расположена область инициации двунаправленной репликации, т.е. пузырек ДНК. Они образуют дугу с восходящей ветвью, расположенную выше дуги Y-фрагментов (рис. 00). Для визуализации в геле нужных фрагментов ДНК применяют гибридизацию с радиоактивно меченными зондами, соответствующими анализируемой области генома. Этот метод позволяет установить примерное положение области инициации двунаправленной репликации.

 А. В. С.

Рис. 10. Электрофоретические картины радиоавтографов рестрикционных фрагментов реплицирующейся ДНК при двумерном электрофорезе в агарозном геле.

А. Репликация инициировалась за пределами изучаемого фрагмента ДНК, так что он содержит одну репликативную вилку. По мере её продвижения от правого конца фрагмента подвижность ДНК при электрофорезе во втором направлении уменьшается и достигает минимума, когда репликативная вилка находится в середине фрагмента. Поэтому дуга b Y-фрагмента состоит из восходящей и нисходящей ветвей. Диагональ нереплицированных нерадиоактивных фрагментов генома в целом представлена линией а.

В. Фрагмент содержит расположенную в его центре область начала двунаправленной репликации. По мере роста репликативного пузырька подвижность молекул ДНК монотонно уменьшается, и они образуют восходящую дугу с, расположенную выше дуги Y-фрагментов (изображена пунктиром).

С. Область начала двунаправленной расположена ближе к левому концу фрагмента. До тех пор, пока одна из репликативных вилок не достигнет этого конца, реплицирующийся фрагмент ведет себя как ДНК с пузырьком (ветвь с, как на рис. В). После этого фрагмент приобретает форму буквы Y (одна репликативная вилка) и попадает на нисходящую часть ветви b рис. А.

Жирная точка в правом нижнем углу соответствует радиоавтографу нереплицированных копий изучаемого фрагмента.

Альтернативные методы картирования предполагаемых ОНР у эукариотов основаны на выделении вновь реплицированных коротких фрагментов ДНК (~1 т.п.н.), которые синтезированы в синхронизированных в фазе S клетках за короткое время в присутствии специфических предшественников ДНК, например, 5-бромдезоксиуридина. Такие фрагменты можно очистить с использованием седиментации в градиенте плотности или антител, связывающих содержащую 5-бром-дУ ДНК. Количество вновь реплицированных фрагментов ДНК, синтезированных на определенном коротком сегменте генома, можно определить, используя конкурентную ПЦР-амплификацию с праймерами, специфичными для этого сегмента.

С применением этих методов удалоcь идентифицировать более 20 предполагаемых областей инициации двунаправленной репликации ДНК у дрожжей, лягушек и млекопитающих. Рассмотрим один из наиболее хорошо изученных локусов инициации - локус DHFR, расположенный между генами дигидрофолатредуктазы DHFR и 2В2121 в геноме клеток СНО яичника китайского хомячка. Метод двумерного электрофореза показал, что в этом локусе события инициации двунаправленной репликации распределены по очень широкой области длиной 56 т.п.н., названной зоной инициации. На первый взгляд, это свидетельствует об отсутствии строго определенных ОНР у млекопитающих. Однако с использованием анализа вновь синтезированной ДНК удалось добиться гораздо более хорошего разрешения первичных сайтов инициации в этой зоне. Оказалось, что локус DHFR содержит по меньшей мере 3 таких сайта (ori, ' и ) не слишком большого размера (~2 т.п.н.) в пределах области длиной 28 т.п.н. (рис. 00, В).

Наиболее сильным сайтом инициации репликации является ori. Фрагмент хромосомной ДНК длиной 5,8 т.п.н., содержащий ori, стабильно трансфицировали в другие (эктопические) положения генома клеток китайского хомячка, не имеющих эндогенного природного локуса DHFR. В нескольких альтернативных положениях сайт ori обеспечил такую же инициацию репликации хромосомной ДНК, как и в природном положении, т.е. этого сайта оказалось достаточно для не зависящей от положения в геноме инициации. Секвенирование показало, что в области ori содержатся богатые АТ области с остатками А в одной нити и остатками Т в другой, как в ARS из S. pombe. Кроме того, в этой области обнаружены два сайта связывания белка RIP, порождающего образование петли ДНК длиной 0,7 т.п.н. и обладающего геликазной активностью, а также участок характеристически ихогнутой ДНК и повторы типа Alu.

Поскольку белки комплекса ORC дрожжей и млекопитающих имеют значительный уровень гомологии, естественно было ожидать, что в ОНР высших эукариотов содержатся сайты связывания ORC, похожие на элементы А и В1 последовательностей ARS дрожжей, ассоциация с которыми ORC является самым первым этапом в сборке комплексов инициации репликации. Выравнивание последовательностей ARS1 S. cerevisiae и 4 предполагаемых сайтов ori из хромосомной ДНК дрозофилы и млекопитающих показало, что и у высших эукариотов имеются богатые АТ участки ДНК, которые более чем на 50% идентичны элементам А и В1 из ARS1 (рис. 00). В локусе ori такой сайт гомологии с дрожжевым ОНР найден в единственном положении, близком к области первичной репликации ДНК. Этот сайт cовпадает с сайтом связывания компонента Orc2 комплекса ORC в локусе DHFR. Аналогичные сайты связывания ORC обнаружены также в локусах инициации репликации АСЕ3 у 4 видов дрозофилы и в ОНР гена -глобина человека. Делеция 4 пар Г:Ц на расстоянии 3 п.н. с 3'-cтороны от участка ori, изображенного на рис. 00, понижает эффективность инициации репликации в 2 раза, так что возможный сайт связывания ORC является существенным. Эти данные позволяют предположить, что механизм селекции сайтов инициации репликации комплексом ORC является высококонсервативным среди всех эукариотов.

 сайт связывания ORC

GAAAAGCAAG-CATA AAAGATC TAAACATAAAATCTG ARS1 S. cerevisiae

CAAAAGCAAGACAAA GACAAGC TCCAAATAAGATTCA Ori хомячка (CHO)

CAAAAGCAAA-AAAA ATTGAGA TAAAATTACAATAAA ACE3 Drosophila

CAAAAGGAAA-TACT TCTGAGA TACATTAAGTAACTT -глобин человека

СAAAATGTTT---ATT GGAGTGT TGTACAAAAAAGTTT ламин В2 человека

B1 A

Рис. 11. Сравнение первичных последовательностей предполагаемых сайтов связывания ORC в пяти эукариотических ОНР.

Выделены нуклеотидные остатки, совпадающие с ARS1 S. cerevisiae

4. Регуляция инициации репликации в эукариотических клетках

В эукариотических клетках существует главный регуляторный механизм, делающий инициацию репликации на каждой ОНР возможной один и только один раз за клеточный цикл. Он назван лицензированием. Каждая ОНР в фазах M/G₁ получает лицензию на однократную репликацию, и клетка обязательно должна пройти митоз, чтобы получить такую лицензию повторно. Механизм лицензирования критически зависит от погрузки в позднем митозе или в фазе G₁ комплекса белков МСМ на ОНР, т.е. от образования предрепликативного комплекса.

Повторная сборка такого комплекса до завершения митоза запрещается несколькими механизмами, в которых важную роль играют протеинкиназы, существенные как раз для прохождения фазы митоза. Ими являются комплекс киназы Cdc28 с циклинами типа В у дрожжей и комплекс киназы Cdk2 с циклинами типов А и Е у высших эукариотов. В клеточном цикле высших эукариотов нестабилен даже комплекс ORC, специфически метящий ОНР. Он дестабилизируется в фазе митоза и повторно образуется только в ранней фазе G₁. Более универсальным является освобождение из комплекса с ORC на ОНР белка Cdc6 (погрузчика белков МСМ), которое происходит в фазы S ещё до начала синтеза ДНК. Свободный белок Cdc6 в фосфорилированной протеинкиназами форме подвергается разушению при участии протеасом у дрожжей, а у высших эукариотов транслоцируется из ядра в цитопазму, где и остается до завершения митоза. Поэтому повторная погрузка комплекса МСМ в фазе S становится невозможной. Однако фосфорилирования Cdc6 недостаточно для строгого контроля инициации репликации: гиперпродукция мутанта белка Cdc6 дрожжей, у которого устранены известные сайты фосфорилирования, не вызывает повторной инициации в том же клеточном цикле. Во время фазы S сами белки МСМ в результате фосфорилирования киназой Cdc7-Dbf4 постепенно освобождаются из хроматина и выходят в цитоплазму у дрожжей. У высших эукариотов освобожденные из репликативного комплекса белки МСМ остаются в ядре во время фазы S. Поэтому для предотвращения реинициации требуется дополнительный механизм, состоящий в исчезновении в фазе S лицензирующего фактора RLF-B. Вновь синтезированный белок RFL-B может войти в ядро только после митоза, во время которого ядерная оболочка становится проницаемой для цитоплазматических белков. Таким образом, по меньшей мере 4 механизма используются эукариотическими клетками для предотвращения повторной сборки предрепликативных комплексов до завершения митоза.

Однократное использование ОНР за клеточный цикл вовсе не означает, что инициация синтеза ДНК на всех ОНР в эукариотической клетке происходит одновременно. Уже давно было установлено, что разные области эукариотических хромосом реплицируются в разные характеристические моменты в фазе S. Одни ОНР активируются для инициации рано, а другие поздно. Рано и поздно запускаемые (early and late firing) ОНР сгруппированы в разных кластерах, которые реплицируются в определенные интервалы времени. Временной порядок запуска ОНР остается в целом инвариантным во время последовательных генераций. Рано реплицирующиеся области хроматина цитологически соответствуют R-полосам, содержащим транскрипционно активные гены домашнего хозяства. Напротив, тканеспецифические гены, не экспрессируемые в данной ткани, присутствуют в поздно реплицирующихся G-полосах. Если же в этой ткани такие гены экспрессируются, то они реплицируются рано. Таким образом, рано реплицирующиеся гены находятся в эухроматине, а поздно реплицирующиеся гены - в гетерохроматине. К поздно реплицирующимся сегментам хроматина относятся также области теломер и центромер, транскрипционно инактивированные Х-хромосомы самок и молчащие копии импринтированных генов.

В определении временного порядка запуска ОНР важную роль играет структура хроматина. Об этом свидетельствуют данные, полученные при искусственном перемещении ОНР ARS в хромосомах дрожжей. Установлено, что при переносе поздно запускаемой ОНР из прителомерной области хромосомы в эухроматиновую область эта ОНР начинает реплицироваться рано. Таким образом, не первичная последовательность ДНК ОНР, а структура хроматина определяет расписание использования ОНР для инициации репликации, хотя известны исключения из этого обшего правила.

Изучение кинетики сборки предрепликативных комплексах на ОНР разного типа у дрожжей in vivo показало, что вербовка комплексов МСМ происходит одновременно на ранних и поздних ОНР. Однако последующие этапы связывания белка Cdc45 и погрузки RPA и ДНК-полимераз наблюдаются во время перехода G₁S на рано запускаемых ОНР и значительно отсрочены на поздно запускаемых ОНР. Это позволяет предположить, что решающую роль в расписании репликации во время фазы S играет связывание с лицензированными ОНР белка Cdc45, зависящее от его фосфорилирования. В выяснении механизма этого эффекта важную роль сыграли мутанты дрожжей, дефектные по циклинам Clb5 и/или Clb6. Отсутствие одного Clb6 не повлияло на активацию ОНР. Однако у мутантов Clb5 поздно запускаемые ОНР не инициируют репликацию, и контролируемые ими области хромосомы пассивно реплицируются из отдаленных ранних ОНР. Высказано предположение, что Clb6 участвует только в активации ранних ОНР, а Clb5 требуется для координированного во времени запуска ранних и поздних ОНР. Возможно, специфическое фосфорилирование комплексом Cdc28-Cdc5 необходимо для ассоциации Cdc45 и образования предрепликативных комплексов на поздних ОНР.