Вспомогательные белки репликации ДНК

38

Вспомогательные белки репликации ДНК

1. ДНК-геликазы

1.1 Общая характеристика геликаз

Геликазами называются ферменты, способные расплетать две комплементарные нити дуплексов нуклеиновых кислот с использованием энергии, полученной при гидролизе 5'-НТФ. Геликазы могут расплетать днДНК (ДНК-геликазы), днРНК (РНК-геликазы) или гибриды ДНК-РНК (например, бактериальный фактор терминации транскрипции Rho). Расплетание шпилечных двунитевых участков РНК играет важную роль в трансляции, сплайсинге и регуляции трапнскрипции. Мы будем рассматривать только ДНК-геликазыы, которые обеспечивают образование однонитевых матриц или интемедиатов ДНК, требующихся для репликации, рекомбинации и репарации ДНК.

ДНК-геликазы являются моторными белками, сопрягающими гидролиз НТФ с дестабилизацией водородных связей в дуплексах ДНК. ДНК-геликазы могут однонаправлено транслоцироваться вдоль нити ДНК независимо от её нуклеотидной последовательности и процессивно расплетать днДНК со скоростью до 500-1000 п.н./сек. Большинство ДНК-геликаз не проявляет строгой специфичности в отношении НТФ и дНТФ.Одни из них чаще использует для геликазной активности дТТФ, другие - ГТФ и АТФ, а третьи предпочитают АТФ. (д)НТФазная активность является обязательным каталитическим свойством геликаз. Энергия гидролиза (д)НТФ используется ими для изменения конфирмационных состояний молекулы самого фермента во время транлокации и расплетания ДНК.

Почти все ДНК-геликазы предпочитают инициировать расплетание in vitro дуплексов ДНК, имеющих флановую область онДНК, которая облегчает образование комплекса с ДНК («посадку» геликазы на ДНК) и служит сайтом инициации в реакции расплетания. ДНК-геликазы проявляют определенную полярность в расплетании: одни предпочитают дуплекс ДНК с 3'-флаговой, а другие - с 5'-фланговой однонитевой областью. Исключение составляет гетеротримерный фермент репликации RecBCD E. coli, предпочитающий расплетать днДНК с тупыми концами. Остальные ДНК-геликазы являются «полярными». Для определения их полярности используют субстрат ДНК, в контором центальный участоек онДНК фланкирован на обоих концах дуплексными областями (рис. 2.01). Если расплетание происходит в дуплексе А, геликаза имеет полярность 5'3'. Если же преимущественно расплетается дуплекс В, геликазе приписывают полярность3'5'. Расплетающая активность некоторых ДНК-геликаз (например, белка DnaB E. coli) стимулируется, если субстрат имеет «вилочную» структуру, т.е. содержит на стыке с дуплексом одновременно 3'- и 5'-однонитевые области. Это показывает, что в структурах репликативных вилок ДНК-геликаза может взаимодействовать с обеими расплетенными нитями ДНК.

A B

5'3' 3'5'

3' 5'

Рис. 1. Схема субстрата ДНК для определения полярности ДНК-геликаз

Все ДНК-геликазы образуют олигомерные активные структуры, преимущественно димеры или гексамеры из одинаковых или (гораздо реже) разных субъединиц. Даже такая ДНК-геликаза, как белок Rep E. coli, в свободном состоянии находящийся в мономерной форме, при связывании с ДНК образует димеры и активна в димерной форме. Главные ДНК-геликазы, участвующие в репликации ДНК, являются гексамерными ферментами.

Компьютерный анализ ДНК-геликаз из различных организмов обнаружил короткие консервативные аминокислотные последовательности, названные “геликазными мотивами”, и позволил разбить эти ферменты на три суперсмейства (SF-1, SF-2 и SF-3) и одно небольшое семейство (F-4). Число таких консервативных мотивов составляет от 3 у суперсемейства 3, в которое в основном входят вируксные геликазы, до 7 у суперсемейств 1 и 2. Два из этих мотивов необходимы для связывания и гидролиза НТФ. Они встретились и ранее у связывающих АТФ белков (в частности, у АТФаз) и были названы мотивами Уокера (J. Walker) типов А и В.

Мотив А с консенсусной последовательностью GK(T/S) образует так называемую Р-петлю в сайте связывания АТФ. Особенно важен остаток лизина (K), боковая аминогруппа которого контактирует с -фосфатом связанного комплекса Mg²⁺-АТФ и стабилизирует переходное состояние во время катализа. Мотив В содержит инвариантный остаток аспарагиновой кислоты (D), рядом с которым у некоторых суперсемейств расположен второй кислый остаток глютаминовой кислоты (E) в мотиве DExH. Остаток асп координирует ассоциированный с АТФ катион Mg²⁺ и активирует атакующую фосфодиэфирную связь молекулу воды. Эти два мотива АТФазного центра абсолютно необходимы, но не достаточны для геликазной активности. Роль остальных геликазных мотивов не определена однозначно. Некоторые из них могут связывать адениновое кольцо АТФ или -фосфатную группу НТФ. Другие консервативные мотивы геликаз могут участвовать в ассоциации ДНК-геликаз с сахарофосфатным остовом или основаниями ДНК или в передаче индукциованных НТФ или НДФ конфирмационных изменений к сайту связывания с ДНК в геликазе.

Поиски белков, имеющих консервативные геликазные мотивы, в базах данных полностью секвенированных геномов показал, что около 1% генов у всех организмов кодирует потенциальные геликазы. В частности, в геноме E. coli cодержится около 50 таких генов. Свойства и функции главных ДНК-геликаз E. coli приведены в табл. 2.1.

Таблица 1 Главные ДНК-геликазы E. coli

* - РНК-геликаза

Эти геликазы участвуют во всех основных процессах метаболизма ДНК и проявляют определенную специализацию. Так, геликаза, состоящая из субъединиц A и B эксцинуклеазы UvrABC специализируется на нуклеотидной эксцизионной репарации, а образующая двойные гексамеры геликаза RuvB катализирует одну из важнейших стадий рекомбинации - миграцию ветвей ДНК в так называемых холидеевских структурах. Среди этих ферментов наиболее важной для процессов инициации и элонгации в репликации ДНК является ДНК-геликаза DnaB.

1.2 Свойства репликативной ДНК-геликазы DnaB

ДНК-геликаза DnaB имеет длину 471 аминокислотный остаток (мол. масса 52,4 кД) и кодируется геном dnaB (92-ая мин генетической карты). Количество молекул белка DnaB на клетку составляет ~20. Белок DnaB является гексамерной геликазой с полярностью 5'3'. В репликативных вилках ДНК-геликаза DnaB придает холоферменту ДНК-полимеразы способность вести синтез ДНК с высокой физиологической скоростью (~ 700 п.н./мин). Геликаза DnaB предпочитает вилочные субстраты ДНК, у которых длина 5'-хвоста превышает 20 н., а длина 3'-хвоста - 5 н. Она связывается с 5'-однонитевой областью ДНК со стехиометрией 203 н. на гексамер DnaB.

Белок DnaB входит в геликазное семейство F-4, к которому относятся также геликазы gp4 фага Т7 и gp41 фага Т4. Это семейство имеет 4 консервативных геликазных мотива, включая мотивы Уокера типов А и В. Отметим, что аналогичные 4 мотива имеются у главного белка рекомбинации RecA. Молекула DnaB состоит из двух частей: N-концевого домена I с мол.м. 12 кД и С-концевой области доменов III+IV c мол.м. 33 кД. Эти части DnaB соединены друг с другом гибким линкером (домен II).

N-концевой домен I имеет преимущественно -спиральную структуру и участвует в белок-белковых взаимодействиях. С этой областью DnaB связываются белок-инициатор репликации DnaА (см. гл. 3) и праймаза DnaG (см. 2.3). Для взаимодействия с DnaG существенны также линкерная область II и часть домена III. С-концевую часть DnaВ можно разбить на два функциональных домена (III и IV). Центральный домен III может связывать и гидролизовать АТФ в отсутствие других областей DnaВ. В домене III расположены последовательности Уокера типов А (мотив Н1) и В (мотив Н2), входящие в состав НТФазного активного центра DnaВ. В этих мотивах находятся важные для связывания и гидролиза АТФ остатки K237 и T238 в мотиве Н1 и D343 в мотиве Н2. Домен IV содержит дополнительные контактные участки для НТФ и участвует в связывании с ДНК. Для геликазной активности требуются все домены DnaВ.

Только N-концевой домен DnaB изучен с высоким разрешением методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР. 3-мерная структура всего белка пока установлена лишь методом криоэлектронной микроскопии с разрешением ~20 A. Эти данные показали, что в гексамере белка DnaB субъединицы образуют кольцо диаметром 12,5-14 нм и высотой 5,7 нм. Кольцо имеет центральное отверстие диаметром 3-4 нм, через которое может пройти нить онДНК. Аналогичные размеры имеют и кольца многих других гексамерных ДНК-геликаз. Существуют две взаимопревращающиеся формы кольца DnaB: “треугольник” с 3-кратной симметрией С₃ и “пропеллер” с 6-кратной симметрией С₆. Взаимопревращение этих форм зависят от белок-белковых взаимодействий и, в частности, от способности N-концевых доменов I смежных субъединиц образовывать димеры. Домены I всех субъединиц расположены на одной и же поверхности основания кольца, а в самом кольце каждая из субъединиц взаимодействует только с 2 ближайшими соседями.

Структура комплексов белка DnaB с онДНК и вилочными субстратами ДНК изучена методом резонансного флуоресцентного переноса энергии. Эти данные показали, что онДНК действительно проходит через центральный канал гексамера DnaB, а не наматывается на её поверхности. Они позволили предложить модель связывания DnaB с ДНК в репликативной вилке. “Передняя” часть белка DnaB, обращенная в сторону расплетаемого дуплекса ДНК, образована большими С-концевыми областями всех 6 субъединиц, с которыми взаимодействует участок днДНК длиной не более 2-3 п.н. Две расплетенные нити ДНК на “переднем” краю разделяются друг от друга: 5'-нить попадает в центральный канал кольца DnaB, а 3'-нить “исключается” за пределы гексамера. Во внутреннем канале кольца DnaB

1.3 ДНК-геликаза репликативной вилки у эукариотов

Общее число различных ДНК-геликаз даже у низших эукариотов гораздо больше чем у бактерий. Так, в геноме дрожжей S. cerevisiae около 200 открытых рамок считывания кодируют предполагаемые геликазы, которые могут выполнять самые разнообразные функции. Поэтому идентификация в таком большом наборе истинной «репликативной» ДНК-геликазы является очень трудной задачей. Можно ожидать a priori, что такая ДНК-геликаза должна быть функциональным аналогом белка DnaB E. coli, который не только принимает участие в инициации репликации хромосомы в области oriC (см. гл. 3), но и перманентно связан с реплисомой в хромосомных репликативных вилках (гл. 4).

В настоящее время считается, что такой эукариотической репликативной ДНК-геликазой является комплекс белков, названный МСМ (от minichromosome maintanance - сохранение минихромосом). Гены, кодирующие белки МСМ, были впервые идентифицированыв в дрожжей с использованием мутаций, нарушающих репликацию искусственных минихромосом и блокирующих движение по клеточному циклу. У S. cerevisiae обнаружены 6 таких генов (МСМ2-МСМ7), продукты которых абсолютно необходимы для инициации репликации. Сборка комплекса всех 6 белков на областях начала репликации является обязательным этапом инициации репликации (гл. 3). С другой стороны, анализ температурно-чувствительных мутантов по генам МСМ показал, что все 6 белков МСМ2-7 необходимы и в течение всей фазы S для элонгации репликации хромосом.

Дрожжевые белки MCM2-MCM7 высокогомологичны друг другу в центральной области длиной ~200 аминокислотных остатков (рис. 2.5). Она содержит элемент, похожий на мотив Уокера типа А (GXXGXGKS/T), в котором второй и третий остатки глицина заменены на сер или ала. Эта область отвечает за связывание НТФ. Белки МСМ2-7 можно отнести к суперсмейству АТФаз ААА+ (см. 1.4). У белков МСМ2, МСМ4, МСМ6 и МСМ7 имеется область, похожая на цинковый палец, с нетипичной структурой СХ₂СХ_18-19СХ_2-4С, которая, вероятно, участвует в белок-белковых взаимодействиях. Гомологи белков МСМ2-МСМ7 имеются у всех эукариотов. Для одноименных белков МСМ из разных организмов гомология не ограничивается центральным сегментом и заметна за его пределами.

Рис. 2. Сохранение структуры белков MСМ S. cerevisiae.

Черные сегменты - участки гомологии белков MСМ дрожжей с единственным белком MСМ архея Methanococcus thermoautotrophicum, цветные сегменты - участки гомологии субъединиц MСМ дрожжей с соответствующими белками млекопитающих.

Отмечено положение высоконсервативного домена связывания НТФ

У археев также имеются гомологи белков МСМ, необходимые для репликации. Некоторые археи (например, Methanococcus thermoautotrophicum), имеют единственный ген МСМ, что значительно облегчило изучение функции его продукта. Кодируемый этим геном белок образует двойные кольцевые гексамерные комплексы, обладающие ДНК-зависимой АТФазной и ДНК-геликазной активностью с полярностью 3'5'. ДНК-геликаза МСМ этого архея высокопроцессивна и может расплетать in vitro дуплексы ДНК длиной до 500 п.н. Гомология архейной геликазы с белками МСМ2-7 эукариотов позволила предположить, что и комплекс МСМ обладает геликазной активностью.

Комплексы МСМ эукариотов действительно являются гексамерными и абсолютно необходимы для репликации ДНК на стадиях инициации и элонгации. Однако после выделения из эукариотических клеток такие комплексы имеют преимущественно не кольцевую, а глобулярную структуру, полностью лишены каталитических активностей и даже не связывают НТФ. С другой стороны, в процессе очистки образуются и тримерные субкомплексы Mcm4-Mcm6-Mcm7, которые спонтанно образуют кольцевые гексамерные структуры - предположительно, димеры тримеров 4-6-7. Такие структуры проявляют in vitro зависящее от АТФ связывание с онДНК, стимулируемую онДНК АТФазную активность и достоверную, но слабую ДНК-геликазную активность с полярностью 3'5', способную расплетать до 30 п.н. в дуплексах ДНК. Добавление к ним белка Mcm2 или димера Mcm3-Mcm5 вызывает разборку двойных тримеров и устраняет их геликазую активность. Это позволило предположить, что субъединицы Mcm4, Mcm6 и Mcm7 образуют каталитически активную сердцевину геликазы МСМ, а субъединицы Mcm2, Mcm3 и Mcm5 являются регуляторными субъединицами, негативно влияющими на геликазную активность. Таким образом, в отличие от других известных гексамерных ДНК-геликаз геликаза МСМ является гетероолигомерным белком, состоящим по меньшей мере из 3 разных субъединиц. Потребность в 6 белках МСМ даже на стадии элонгации позволяет предположить, что даже регуляторные субъединицы входят в гексамер не только во время инициации, но и во время движения репликативных вилок, но их ингибиторный эффнект сменяется активаторным. Активация всего комплекса, вероятно, зависит от посттрансляционной модификации регуляторных субъединиц на стадии инициации репликации, которую мы расссмотрим в гл. 3.

Рис.3. Гипотетическая модель образования активных кольцевых гексамерных комплексов геликазы МСМ из разных субъединиц in vivo и in vitro

В качестве рабочей гипотезы для объяснения особенностей поведения комплекса МСМ предложена модель, преставленная на рис. 3. Согласно этой модели, природная геликаза МСМ собирается из двух неидентичных тримеров, один из которых состоит из каталитических субъединиц Mcm4, Mcm6 и Mcm7, а второй - из регуляторных субъединиц Mcm2, Mcm3 и Мcm6. После первичной сборки гетерогексамер МСМ организован в каталитически не активную глобулярную структуру. Посттрансляционная модификация регуляторных субъединиц на стадии инициации in vivo реогранизует этот комплекс в активное гексамерное кольцо, в котором регуляторные субъединицы чередуются с каталитическими. Это правильное взаимное расположение неактивных и активных субъединиц помогает каталитическим субъединицам образовать необходимую для геликазной активности кольцевую структуру с 3-кратной симметрией, изображенную на рис. 2.7 в виде треугольника. При выделении из клеток эта структура разрушается с освобождением регуляторных субъединиц и сборкой in vitro частично активных гексамеров из двух тримеров 4-6-7. В такой структуре одна триада Mcm4- Mcm6-Mcm7 участвует в каталитическом цикле ДНК-геликазы, а вторая заменяет, но недостаточно эффективно, структурную функцию отсутствующих модифицированных регуляторных субъединиц.

1.4 Механизм действия гексамерных ДНК-геликаз

Рассмотрим рабочие модели нескольких последовательных этапов в каталитическом цикле репликативных гексамерных ДНК-геликаз. Эти модели основаны на экспериментальных данных, но во многих деталях остаются гипотетическими.

Погрузка гексамерных ДНК-геликаз на ДНК

Для многих кольцевых ДНК-геликаз доказано, что нить онДНК, по которой транслоцируется связанная геликаза, проходит через канал в центре кольца, а не находится на поверхности белка. Поэтому, как и в случае погрузчиков зажима ДНК-полимераз (cм. 1.00), необходимо объяснить, как эта нить попадает внутрь кольца. Доказано, что эта проблема в обоих случаях решается одинаковым образом - по механизму размыкания кольца. Предполагается, что ДНК вначале связывается со первичным слабым сайтом на внешней поверхности кольца ДНК-геликазы (рис. 2.7). Затем кольцо временно размыкается на контактной поверхности между 2 смежными протомерами и нить онДНК попадает внутрь центрального канала, где связывается с более прочным контактным сайтом. После замыкания гексамерного кольца ДНК-геликаза становится способной транлоцировать по онДНК, не отрываясь от неё. Размыкание кольца может происходить спонтанно, но чаще всего облегчается вспомогательными белками - погрузчиками ДНК-геликаз. Так, у фага Т4 погрузке ДНК-геликазы на онДНК, покрытую связывающимся с ней белком gp32, помогает вспомогательный белок gp59. У ДНК-геликазы DnaB E. coli аналогичную роль погрузчика играет белок DnaC.

В опытах in vitro геликаза DnaB связывается с вилочными субстратами ДНК, имеющими однонитевой 5'-хвост. Вероятно, в этом случае погрузка DnaB на ДНК осуществляется по другому механизму: 5'-онДНК проходит через отверстие кольца DnaB, как нитка продевается в игольное ушко. Однако при инициации репликации in vivo кольцо DnaB должно связаться с внутренним однонитевым участком ДНК, не имеющим свободных концов. Для этого геликаза DnaB нуждается в помощи своего природного партнера -белка DnaС. Этот белок имеет длину 245 остатков (мол. м. 28 кД) и содержит область связывания с DnaB на N-конце и область, содержащую типичные АТФазые мотивы Уокера в С-концевой половине (рис. 2.8). Белок DnaС относится к семейству АТФаз ААА+, подобно погрузчикам скользящего зажима ДНК-полимераз, и может связывать и гидролизовать АТФ.

Количество белка DnaС на клетку E. coli равно ~20, т.е. совпадает с числом молекул DnaB. Гексамер геликазы DnaB стехиометрически связывает 6 мономеров DnaС в форме со связанным АТФ. Молекулы DnaС располагаются на поверхности одного из оснований кольца DnaB и, вероятно, ассоциируются с С-концевой половиной DnaB. Такое взаимодействие, стабилизируемое АТФ, “замораживает” гексамер DnaB в треугольной конформации с симметрией С₃ и закрывает центральный канал DnaB на стороне, противоположной сайтам связывания DnaС. В результате через этот канал не может пройти даже онДНК.

Образование комплекса DnaB-DnaС изменяет свойства обоих партнеров. Белок DnaB утрачивает все свои каталитические активности, включая НТФазную и геликазную, а у белка DnaС активируется его “скрытая” (cryptic) способность связываться с онДНК. В результате комплекс DnaB-DnaС может ассоциироваться с голой онДНК, но не с ДНК, покрытой белком SSB. Этот механизм предотвращает неразборчивую погрузку геликазы DnaB на участки хромосомы, временно ставшие однонитевыми (например, в результате эксцизионной репарации ДНК) и покрытые SSB. Во время инициации репликации хромосомы E. coli в области oriC участки голой онДНК создаются белком-инициатором DnaА (гл.3), за счет взаимодействия с которым белка DnaB на них вербуется комплекс DnaB₆-(DnaС-АТФ). После связывания с этими участками белок DnaС каким-то образом размыкает кольцо DnaB и пропускает внутрь него нить онДНК. Вероятно, это происходит так же, как при погрузке зажима ДНК-полимераз -комплексом погрузчика (см. 1.00). Контакт белка DnaС с онДНК и DnaB запускает гидролиз АТФ, связанного с DnaС, после чего субъединицы DnaС-АДФ покидают комплекс с гексамером DnaB, и он приобретает ДНК-геликазную активность.

Cопряжение гидролиза НТФ с транслокацией по онДНК

Гидролиз НТФ ДНК-геликазами используется ими как источник энергии для перемещения по онДНК и для расплетания днДНК. Анализ равновесного связывания нуклеотидов показал, что у многих гексамерных геликаз из 6 субъединиц только три обладают высоким сродством к нуклеотидам, а остальные три имеют низкое сродство и не участвуют в связывании НТФ и в катализе гидролиза. С другой стороны, изучение предстационарной кинетики гидролиза НТФ позволило предположить, что в любой момент времени только одна связанная с гексамером молекула НТФ гидролизуется с высокой скоростью, т.е. три потенциальных каталитических центра в гексамерной геликазе участвуют в гидролизе НТФ не одновременно, а последовательно друг за другом. В этом отношении гексамерные геликазы напоминают другой, хорошо изученный ранее гексамерный фермент - F₁-АТФазу мембранных протонных насосов. Последняя состоит из 3 неактивных структурных -субъединиц и 3 каталитически активных -субъединиц, которые работают не одновременно. В последовательном механизме действия этой АТФазы реакцию гидролиза АТФ можно разбить на 3 парциальные стадии: связывания АТФ, гидролиза АТФ и освобождения продуктов (АДФ и неорганического фосфата). В любой данный момент времени каждая из этих стадий осуществляется только какой-то одной из -субъединиц: одна связывает АТФ, вторая гидролизует его, а третья освобождает продукты. В дальнейшем эти субъединицы, согласованно претерпевая последовательные изменения конформации, меняются друг с другом ролями.

Рассмотрим последовательную 3-сайтовую модель действия гексамерных ДНК-геликаз, основанную на аналогии с F₁-АТФазой и модифицированную с учетом взаимодействия геликаз с ДНК. Предполагается, что в любой момент времени 3 активные субъединицы геликазы находятся в 3 разных конформационных состояниях. В состоянии Т субъединица связывает НТФ и одновременно имеет высокое сродство к онДНК. В состоянии D она связывает НДФ (продукт гидролиза НТФ) и проявляет более низкое сродство к ДНК, а в «пустом» состоянии Е субъединица свободна от нуклеотидов и онДНК. В первый момент в Т-состоянии находится субъединица 1, в D-состоянии субъединица 2 и в Е-состоянии субъединица 3 (рис. 2.9). Гидролиз НТФ субъединицей 1 вызывает её переход в D-состояние и вызывает одновременное изменение конформации двух остальных субединиц: субъединица 2 освобождает продукты гидролиза и становится «пустой» (переход в Е-состояние), а субъединица 3 связывает НТФ и оказывается в Т-состоянии. Реакция на каждой из субъединиц зависит от реакций, проходящих на 2 остальных субъединицах. Это обеспечивает последовательное протекание 3 стадий катализа (связывания НТФ, гидролиза НТФ и освобождения продуктов) на 3 активных сайтах геликазы. Такие циклы повторяются периодически, и после 3 циклов каждая субъединица геликазы возвращается в исходное состояние.

Т.к. изменения конформационного состояния субъединиц приводят к изменению их сродства к онДНК, каждая из субъединиц должна последовательно прочно связываться с ДНК в состоянии Т, ослаблять свою ассоциацию с ДНК после гидролиза НТФ и перехода в состояние D , освобожаться от контакта ДНК при передоде в состояние Е и вновь связываться с ДНК, но уже в новом месте, после повторного связывания НТФ и возврата с состояние Т.

Такая последовательность событий в каждом из 3 сайтов геликазы может обеспечить перемещение ДНК-гелиеказы вдоль ДНК (рис. 2.10, В). В начальный момент времени субъединица 1, находящаяся в состоянии Т и прочно связанная с онДНК, претерпевает изменение конформации, инициирующее движение геликазы. Соседняя субъединица 2, слабо связанная с ДНК в состоянии D, освобождается из контатка с ДНК, а «пустая» субъединица 3 связывает НТФ и прочно связывается с ДНК, но уже в другом сайте. Хотя ДНК освобождается от геликазы в одном месте, в любой момент она остается связанной с двумя субъединицами геликазы. Повторение таких циклов изменения контактов субъединиц ДНК-геликазы с участками ДНК должно привести к однонаправленному процессивному перемещению ДНК-геликазы вдоль онДНК (механизм «активного вращения» - active rolling)

Расплетание днДНК

Этот аспект работы ДНК-геликаз наиболее труден для изучения, и все предложенные механизмы расплетания днДНК остаются гипотетическими. Их можно классифицировать как активные и пассивные, в зависимости от того, участвует ли геликаза в самом акте расплетания или просто стабилизирует участки онДНК. В пассивном механизме ДНК-геликаза косвенно облегчает расплетание, связываясь с онДНК, которая становится доступной в результате временного плавления двойной спирали, вызванного тепловыми флуктуациями на стыке между онДНК и ДНК. В этой модели ДНК-геликаза высупает как разновидность связывающих онДНК и дестабилизирующих дуплекс белков. В пассивном механизме ДНК-геликаза должна связываться с онДНК и однонаправленно перемещаться вдоль неё в направлении днДНК. Транслоцирующаяся ДНК-геликаза улавливает сегменты онДНК длиной в один или несколько нуклеотидов, спонтанно появляющиеся на стыке онДНК-днДНК. Пассивная модель не нашла экспериментального подтверждения. Ей противоречит и способность некоторых ДНК-геликаз связываться не только с онДНК, но и с днДНК.

Активные механизмы расплетания днДНК можно подразделить на три класса. Первые две модели не требуют прочного связывания ДНК-геликазы с днДНК. Модель клина (рис. 2.10, А) предполагает, что одна из расплетенных нитей дуплекса ДНК прочно связана в центральной отверстии кольца гексамерной ДНК-геликазы, а вторая расположена вне кольца и не взаимодействует с белком. При однонаправленном движении геликазы по нити ДНК, проходящей через центральный канал, энергия гидролиза НТФ порождают движущую силу, достаточную не только для перемещения по онДНК, но и для дестабилизации нескольких пар нуклеотидов в днДНК, примыкающей к онДНК. Движущаяся ДНК-геликаза, подобно клину, механически раздвигает эти спаренные основания. Во второй, торсионной модели (рис. 2.10, В) обе разделенные нити ДНК прочно связываются с ДНК-геликазой: одна в центральном канале, а вторая на внешней поверхности кольца. Эти сильные взаимодействия вызывают при транслокации ДНК-геликазы вращение двух нитей ДНК друг относительно друга и генерируют крутящий момент, который раскручивает две нити дуплекса на участке, примыкающем к уже расплетенным нитям. Третья модель активного действия ДНК-геликаз (модель дестабилизации дуплекса) предполагает, что геликаза взаимодействует в центральном канале или на поверхности гексамера не только с онДНК, но и со смежным сегментом дуплекса. Изменения конформации белка, обусловленные гидролизом НТФ, по неустановленному механизму дестабилизируют спираль днДНК в активном центре ДНК-геликазы и вызывают в этой области контакта с днДНК плавление нескольких п.н. После частичного расплетания дуплекса транслоцирующаяся ДНК-геликаза улавливает разошедшиеся нити ДНК. Эта модель похожа на пассивный механизм, но предполагает, что первичное разделение нитей днДНК вызвано не тепловыми флуктуациями, а изменениями конформации ДНК-геликазы.

2. Белки, связывающие однонитевую ДНК

Однонитевые участки ДНК, появляющиеся в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК, могут быстро превращаться в нуклеопротеиновые комплексы, полностью покрываясь специальными белками, получившими название белков, связывающихся с онДНК (SSB - от single-stranded DNA binding proteins). Наиболее хорошо изученными представителями этого класса белков являются белок gp32 фага Т4, белок SSB E. coli и эукариотический белок репликации А (RPA, или фактор репликации RFA). Эти белки преимущественно и неспецифичным в отношении последовательности образом связываются с онДНК, откуда и произошло их название. Связывание белков SSB c онДНК, как правило, является кооперативным.

Название SSB является недостаточно корректным и четким, т.к. существуют многие другие белки, предпочитающие связываться с онДНК, но не относящиеся к SSB. Наиболее характерным примером является центральный белок гомологической рекомбинации RecA, связывающйся с онДНК с высоким сроством и образующий нуклеопротеиновые филаменты RecA. Альтернативным, но тоже неудачным , является название «белки, дестабилизирующие двойную спираль ДНК». Действительно, в присутствии белков SSB могут устраняться двунитевые шпильки в онДНК. Однако, в отличие от ДНК-геликаз, белки SSB сами не способны вызывать активное расплетание нитей днДНК. Вероятно, наиболее правильным названием SSB было бы «белки, стабилизирующие онДНК», но оно не смогло вытеснить привычный термин SSB.

Стабилизация онДНК является первым общим свойством всех белков SSB, которые защищают онДНК от деградации под действием вездесущих “однонитевых” нуклеаз. Вторым общим признаком белков SSB является стимуляция синтеза ДНК. В присутствии белков SSB скорость и точность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами, могут возрастать в десятки раз. Эту функцию белков SSB мы рассмотрим более детально в главе 3. И, наконец, по крайней мере некоторые белки класса SSB стимулируют гомологическую рекомбинацию. Так, у E. coli белок SSB стимулирует опосредованные белком RecA стадии образования составных молекул и переноса нитей ДНК. В репликации, репарации и рекомбинации белки SSB функционируют в стехиометрических, а не каталитических количествах по отношению к доступной онДНК и не обладают ферментативной активностью.

Белок gp32 фага Т4, кодируемый геном 32, играет важную роль в метаболизме фаговой ДНК. Заражение при непермиссивной температуре клеток E. coli мутантом фага Т4, температурочувствительным по гену 32, сопровождается очень быстрой остановкой репликации фаговой ДНК и образованием её фрагментов. Кроме того, в отсутствие белка gp32 не образуются составные молекулы фаговой ДНК в процессе рекоомбинации, от которой зависит поздняя стадия репликации ДНК Т4. В зараженных фагом Т4 культурах E. coli белок gp32 присутствует в количестве до 10000 молекул на клетку. Белок gp32 имеет длину 301 остаток (мол. м. 33,5 кД) и в разбавленных растворах in vitro находится в форме мономера. Эта форма gp32 может связываться с онДНК. Молекула gp32 состоит из 3 доменов (рис. 2.12, А), обнаруженных методом ограниченного протеолиза. Удаление первых 17 остатков на N-конце gp32 и некоторые замены основных аминокислотных остатков лиз₃ или арг₄ полностью устраняют кооперативные взаимодействия между молекулами gp32, связаннымис онДНК. Эти мутации нарушают также функции gp32 в процессах репликации и репарации ДНК фага Т4. Последние 46 остатков на С-конце gp32 участвуют во взаимодействиях с другими белками аппарата репликации и рекомбинации фага Т4, например, с фаговыми ДНК-полимеразой gp43 и праймазой gp61 и белками рекомбинации UvsX и UvsY. Центральный домен gp32 (остатки 21-254) предсталяет собой домен связыввания с онДНК, который включает субдомен связывания катиона Zn²⁺, существенного для конформационной стабильности gp32. Изолированный центральный домен связывается с онДНК с таким же сродством, как и целый белок gp32.

I Белок SSB E. coli кодируется существенным геном, расположенным на 92-ой мин генетической карты и имеющим SOS-индуцибельный промотор. Температурочувствительные мутации ssb летальны при непермиссивной температуре, при которой они останавливают репликацию ДНК. Кроме того, мутации повышают чувствительность клеток к повреждающим ДНК агентам и вызывают аномалии рекомбинации и дефект по индукции SOS-системы. Физиологически активной формой белка SSB является тетрамер, число копий которого на клетку равно 300-350. Этого количества достаточно, чтобы покрыть белком SSB участок длиной 1400 н. на репликативную вилку. Белок SSB имеет длину 177 остатков и мол. массу 18,9 кД и состоит из 3 доменов. Наиболее важной является N-концевая область (остатки 1-105), являющаяся доменом связывания с ДНК. Она содержит также аминокислотные остатки, существенные для взаимодействия мономер-мономер в тетрамере SSB и для кооперативности связывания SSB с онДНК. Домен II, состоящий из остатков 106-165, находится в конформации статистического клубка и не содержит заряженных остатков. После связывания SSB с онДНК этот домен становится более чувствительным к протеолизу. Это показало, что домен II доступен для взаимодействия с другими белками, и осуществляет функции белок-белковых взаимодействий. Последние 12 остатков на С-конце белка SSB очень похожи на кислую С-концевую область белка gp32. У обоих белков протеолитическое удаление С-концевых остатков изменяет кинетику связывания с ДНК и повышает способность дестабилизировать днДНК. Эта область SSB также важна для взаимодействия с другими белками, участвующими в метаболизме ДНК.

Эукариотический белок RPA является гетеротримерным и состоит из 3 разных субъединиц: RPA1, RPA2 и RPA3. Гены этих белков у человека расположены соответственно в хромосомах 17, 1 и 7, а сами субъединицы имеют длину 616, 270 и 121 аминокислотных остатков (мол. массы 70, 29 и 14 кД). Эти белки гомологичны белкам Rfa1, Rfa2 и Rfa3 субъединиц гетеротримерного фактора RFA S. cerevisiae. У дрожжей гены всех 3 субъединиц связывающего онДНК белка абсолютно необходимы для жизнеспособности. Все субъединицы человеческого белка RPA требуются для репликации ДНК вируса SV40 in vitro.

Cубъединица RPA1 может связываться с онРНК самостоятельно, но этого недостаточно для поддержания репликации ДНК. Эта субъединица является главной в гетеротримерном комплексе RPA. Её N-концевой домен (NTD) является наиболее важным участком во взаимодействиях с другими белками, хотя некоторые из этих белков имеют дополнительный сайт взаимодействия и на С-конце RPA1. RPA1 связывается с такими белками систем репликации ДНК, как большой Т-антиген вируса SV40, узнающий вирусную область инициации репликации, и с ДНК-полимеразой - праймазой. Во взаимодействиях с этими белками участвуют N- и С-концевые области RPA1. Кроме того, RPA1 ассоциируется с активаторами транскрипции, имеющими кислые домены активации (например, с белком VP16 вируса простого герпеса и клеточным белком р53), а также с белком XP-G репарации ДНК. Домен взаимодействия с р53 расположен только в N-концевой области RPA1. Эти взаимодействия могут играть роль в привлечении RPA к сайтам репликации и репарации.

Субъединица RPA1 содержит также 3 из 4 доменов связывания RPA с онДНК: DBD-A (остатки 181-290), DBD-B (остатки 300-422) и DBD-C (остатки от 432 до ~560). Между этими доменами расположены гибкие линкерные области. При связывании с онДНК тандема доменов DBD-А и DBD-В каждый из них контактирует с 3 н., а промежуточные 2 н. онДНК приходятся на междоменную область. Четвертый слабый участок связывания с онДНК (домен DBD-D) расположен в центре субъединицы RPA2 и занимает более пРоловины этой молекулы (остатки 43-171). Самая маленькая субъединица RPA3 прямо не связывается с онДНК и её функции неизвестны. Предполагается, что С-концевая область RPA2 служит мостиком между RPA1 и RPA3. В тримеризации RPA участвуют три С-концевые -спирали субъединиц RPA. Тримеризация RPA наиболее существенна для взаимодействия RPA с длинными субстратами онДНК (> 24 н.), а не с короткими олигонуклеотидами (10 н.).

Рассмотрим молекулярные аспекты взаимодействия связывающих онДНК белков с их “субстратами” онДНК. Все белки кооперативно ассоциируются с онДНК, но возможны два типа кооперативного связывания. При “неограниченной” кооперативности белок образует на онДНК длинные кластеры, в которых каждая молекула белка взаимодействует с ближайшими соседями по обе стороны от неё. В предельном случае при параметре кооперативности белок полностью покрывает онДНК. Для “ограниченной” кооперативности характерно образование на ДНК “бусинок” - отдельных ограниченных групп кооперативно ассоциированных белковых молекул. Различные моды кооперативного связывания могут избирательно использоваться в процессах репликации, рекомбинации и репарации. Детальные механизмы образования контактов с онДНК неодинаковы для разных типов связывающих онДНК белков. Их можно рабить на два класса.

Белок SSB E. coli, являющийся в растворе стабильным тетрамером, связывается с онДНК в форме тетрамера с константой ассоциации 10⁸-10¹⁰ М^-1. Для белка SSB возможны три моды связывания с ДНК, в которых он покрывает участки онДНК длиной 352, 563 и 653 н. Эти моды названы соответственно (SSB)₃₅, (SSB)₅₆ и (SSB)₆₅. Для моды (SSB)₃₅ характерна неограниченная кооперативность. В моде (SSB)₆₃ проявляется ограниченная кооперативность, при которой “бусинки” на онДНК соответствуют “октамерам” - кооперативно взаимодействующим смежным тетрамерам SSB. Мода (SSB)₆₅ преобладает при низкой (< 0,01 M NaCl), а мода (SSB)₃₅ - при высокой (> 0,2 M NaCl) ионной силе. При физиологических значениях ионной силы существует равновесная смесь этих двух мод связывания. Уже в 80-е годы в качестве рабочей модели взаимодействия белка SSB с онДНК была предложена следующая схема (рис. 2.13). В моде (SSB)₃₅ только две из 4 субъединиц каждого тетраметра SSB взаимодействуют с онДНК, а в модах (SSB)₅₆ и (SSB)₆₅ в ассоциации с онДНК участвуют все 4 субъединицы. Во всех случаях онДНК связывается с поверхностью асимметричных субъединиц SSB и наматывается на поверхность белковой сердцевины тетраметра с образованием структуры, очень похожую на нуклеосому. В моде (SSB)₆₅ два смежных тетраметра ассоциированы друг с другом в октамер, на который намотан участок он ДНК длиной ~145 н. На участках длиной ~30 н. между двумя соседними октамерами SSB онДНК свободна от белка. Образование нуклеосомоподобной структуры в моде (SSB)₆₅ сопровождается уменьшением контурной длины онДНК на 75%.

Эта модель ещё не полностью доказана экспериментально. Только в 1997 г. методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 2,9 А удалось установить структуру минимального домена связывания с онДНК, состоящего из остатков 1-135 белка SSB E. coli. Оказалось, что мономерная форма этого домена имеет очень асимметричную форму, похожую на уголок (рис. 14, А). По своей структуре мономер SSB относится к большой группе белков с укладкой типа ОВ (оligomer binding - связывание олигомеров), связывающихся с олигонуклеотидами и олигосахаридами. Укладка ОВ является вариантом широко распространенной укладки “греческого ключа”. В “основании” уголка SSB расположены -спираль из остатков 61-70 и несколько -нитей (нити 1-5). Из этого основания выступает сильно вытянутая петля L₄₅ остатков 82-101, образующая -шпильку 45₁-45₂.

В тетраметрах белка SSB объединяются -нити оснований из всех 4 субъединиц SSB с образованием 6-нитевых -плоскостей. Шпильки петель L₄₅ смежных диметров, расположенных над или под плоскостью, попарно взаимодействуют друг с другом. В результате тетраметр SSB приобретает симметричную форму, похожую на эллипсоид вращения (рис. 14, В). На поверхности тетраметра расположены ароматические остатки трп₅₄, трп₈₈ и фен₆₀, участвующие в стэкинг-взаимодействиях с основаниями онДНК, а также положительно заряженные остатки лиз₆₂ и лиз₇₃, важные для связывания с остовом онДНК (рис. 14, С).Взаимодействие с остатками, поставляемыми каждым из мономеров тетраметра SSB и переход от одного мономера к другому, вероятно, определяют геометрию наматывания онДНК на поверхность тетраметра. Однако в комплексах типа (SSB)₅₆ и (SSB)₆₅ она пока не установлена. Если в комплексах с SSB онДНК упаковывается на поверхности, то в комплексах с фаговым белком gp32 и эукариотическим белком RPA она, скорее, размещается во впадинах или каналах.

Активной формой белка gp32 фага Т4 является мономер, который связывает участок онДНК длиной 6-7 н. Ассоциация gp32 с онДНК происходит с очень высокой, но не бесконечно большой кооперативностью, так что этот белок образует очень длинные кластеры на онДНК, но не покрывает её полностью. Связывание gp32 увеличивает контурную длину онДНК. Рентгеноструктурный анализ (разрешение 2,2 А) комплекса тетрануклеотида онДНК с минимальным связывающим онДНК доменом gp32 (остатки 22-239) показал, что этот домен содержит пять -спиралей и восемь -нитей. Домен состоит из трех субструктур: нижнего субдомена I, координационно связывающего Zn²⁺ с одним остатком гистидина и 3 остатками цистеина, верхнего субдомена II, имеющего структуру 5-нитевого -слоя, и соединяющей их области из одной -спирали и двух -нитей. В домене связывания онДНК имеется положительно заряженная центральная «щель» с гидрофобными карманами для связывания оснований ДНК. Карманы содержат существенные ароматические аминокислотные остатки тир и фен, поставляемые -нитями субдоменов I и II. Эта полость наиболее прочно связывает участок онДНК длиной 2-3 н. Связанная онДНК находится в растянутой конфирмации, в которой расстояние между соседними основаниями равно 5 Е, а не 3,4 Е, как в стандартной В-форме ДНК.

Очень похожий механизм ассоциации с онДНК обнаружен и для эукариотического белка RPA. Хотя самая большая субъединица RPA1 может самостоятельно связывать онДНК, физиологически активной является гетеротримерная форма. RPA связывается с онРНК в определенной полярности и имеет три основные моды ассоциации. В главной моде, имеющей высокое сродство к онДНК, но низкую кооперативность, триметр RPA маскирует участок онДНК длиной 30 н. Вторая мода менее стабильна и, вероятно, является предшественником первой. В ней белок RPA проявляет более низкое сродство и более высокую кооперативность. Переход между этими двумя модами является физиологически важным событием для расплетания ДНК и происходит через промежуточное состояние, в котором RPA связывается с 13-14 н. в онДНК.

Структура минимального домена связывания с онДНК, состоящего из двух доменов (DBP-A и DBP-B) субъединицы RPA1 (остатки 181-422), и его комплекса с онДНК определена с разрешением 2,5 Е. В свободном состоянии домены А и В, соединенные гибким линкером (остатки 291-299), имеют укладку типа ОВ, важным признаком которой является 5-нитевой -слой, сворачивающийся в -бочку. В отсутствие ДНК тандем домеров А и В может находиться в двух разных конфирмациях: менее компактной и более компактной (рис. 2.16, А и В). Тандемная ориентация укладок ОВ становится ещё более компактной и значительно стабилизируется в присутствии онДНК (рис. 2.16, С). В комплексе с DBD1-DBD2 онДНК располагается во внутреннем канале белка диаметром ~17 Е. Каналы связывания онДНК в доменах А и В ориентированы в одном направлении, так что ДНК переходит из одного домена в другой по прямой линии. В образовании этих каналов важную роль играют вытянутые петли L12, которые образуют -шпильки, как в белке SSB, и охватывают ДНК, подобно пальцам. В связывании онДНК участвуют стэкинг с двумя ароматическими остатками (двумя остатками фен в домене А и остатками фен и трп в домене В) и водородные связи между аминокислотными остатками белка и основаниями и фосфатными группами онДНК. Домен А образует больше контактов с онДНК, чем домен В. Каждый из этих доменов взаимодействует с 3 н. онДНК и ещё 2 н. приходятся на долю линкера между доменами. Таким образом, структура комплекса с доменами DBP-A и DBP-B полностью объясняет моду связывания RPA c участком онДНК длиной 8 н.

Для объяснения двух других мод связывания RPA необходимо привлечь ещё два домена (DBP-С на С-конце RPA1 и DBP-D в середине RPA2), которые, предположительно, также имеют укладку типа ОВ. Сборка моды связывания с 30 н. онРНК может происходить в несколько этапов (рис. 2.17). Первый из них состоит в связывании доменов DBP-A и DBP-B с участком длиной 8 н. Этот процесс инициируется доменом А, которые имеет более высокую активность и гибкость т первым ассоциируется с 5'-концом онДНК. Затем к нему присоединяется домен DBP-B. Последовательное связывание доменов А и В объясняет известную полярность (5'3') ассоциации RPA c онДНК. В результате первичного связывания тандема А+В белок RPA переходит из глобулярной формы (рис. 17, А) в более вытянутую (рис. 17, В). Изменение конфирмации субъединицы RPA1 дает возможность связаться с онДНК следующему домену DBP-С, которые вместе с линкером между доменами В и С также должен занимать на онДНК участок длиной 5 н. В результате белок RPA переходит в промежуточную моду связывания с 13-15 н. На заключительном этапе присоединяется домен DВР-D из второй субъединицы RPA, связывающийся с 3'-стороны от DBP-С (рис. 17, D). Квартет доменов А, В, С и D, каждый из которых (вместе с линкером) занимает не более 5 н. на онДНК, образует сердцевину (18-20 н.) моды связывания RPA с 30 н. онДНК. Недостающие 10-12 н. в этой моде, вероятно, приходятся на долю N-концевого домена (NTD) RPA1 и области RPA2 за пределами домена DBP-D.

3. Праймазы

Синтез затравок РНК в процессе образования фрагментов Оказаки при репликации ДНК (преимущественно в отстающей нити) катализируется праймазами - особой разновидностью ДНК-зависимых РНК-полимераз, отличающейся от РНК-полимераз, которые участвуют в транскрипции. Рассмотрим их структурные особенности по сравнению с транскрипционными РНК-полимеразами на примере наиболее хорошо изученных ферментов - белка DnaG E. coli и эукариотической праймазы, всегда работающей в комплексе с ДНК-полимеразой .

Праймаза DnaG E. coli кодируется существенным геном dnaG (67-ая мин генетической карты) и имеет длину 582 остатка. Она почти не гомологична известным РНК-полимеразам (единственный участок гомологии RNAP имеет длину всего 15 остатков), но содержит 6 участков гомологии (1-6) с праймазами других бактерий и некоторых фагов. Эти участки гомологии сосредоточены в N-концевых 2/3 молекулы DnaG. За положением 400 гомология бактериальных и фаговых праймаз исчезает: эта С-концевая область у фаговых праймаз либо отсутствует, либо заменена на геликазный домен у праймаз-геликаз фагов Т7 и Р1. В первичной последовательности белка DnaG можно выделить 4 важные области (I-IV, рис 18).

N-концевая область I c консервативным мотивом 1 содержит мотив цинкового пальца или ленты (положения 40-65) типа СХ₂НХ₁₇СХ₂С с длинной центральной петлей и координационно связывает катион Zn²⁺. Эта область участвует в узнавании онДНК и связывании с нею и может частично определять положение стартовой точки синтеза РНК. Главным является центральный домен II (остатки 200-350), содержащий 4 из 6 консервативных праймазных мотивов и участок гомологии с РНК-полимеразами. В этой области сосредоточены 3 необходимых для катализа кислых остатка (асп₂₆₉ в мотиве 4 и диада DXD в положениях 345-347 мотива 6), связывающие ионы Mg²⁺, и входящий в активный центр остаток лиз₂₄₁, замена которого не мешает инициации затравок РНК, но препятствует их элонгации.

Рентгеноструктурный анализ белка DnaG не обнаружил структурного сходства с известными РНК-полимеразами, но подтвердил основанную на первичной последовательности гомологию праймазы с ДНК-топоизомеразами. Центральная часть каталитического домена DnaG имеет укладку типа Toprim, характерную для топоизомераз классов 1 и 2 (см. 2.5). Этот домен имеет форму гребня и содержит центральную -слой, окруженную несколькими -спиралями (рис. 19). На вершине этой структуры находятся остатки асп, связывающие Mg²⁺ и необходимые для катализа. Впадина домена Toprim может слабо связывать дуплекс ДНК-РНК длиной 10 п.н. В этом канале расположен и остаток лиз₂₄₁ из сегмента RNAP гомологии с РНК-полимеразами. Домен II через гибкий линкерный домен III в области остатка 400 соединен с уникальным для бактериальных праймаз С-концевым доменом IV. Последний участвует во взаимодействиях белка DnaG с другими компонентами аппарата репликации. В частности, последние 16 С-концевых остатков DnaG необходимы для взаимодействия с N-концевым доменом ДНК-геликазы DnaВ и участвуют в вербовке DnaG в репликативную вилку. Прямой физический контакт с DnaВ обеспечивает попадание расплетенной геликазой нити ДНК сразу к активному центру DnaG и стимулирует праймазную активность.

Отмечены положения домена Toprim гомологии с топоизомеразами и остатков активного центра праймазы.

Эукариотические праймазы являются интегральными компонентами бифункционального фермента ДНК-полимераза -праймаза (см. 1.00) и состоят из 2 субъединиц р55 и р48 с мол. м. 55 и 48 кД (у человека). Белки р55 и р48 образуют прочно ассоциированный комплекс, в формировании которого участвуют N- и C-концевые домены р55. Субъединица р55 имеет сигнал ядерной локализации и способна направлять субкомплекс р55-р48 в ядро независимо от полимеразного субкомплекса. Субъединица р55 участвует в ассоциации праймазного субкомплекса с главной субъединицей р180 ДНК-полимеразы . Кроме того, белок р55 может связываться с онДНК и с дуплексом ДНК-РНК, образовавшиеся после синтеза праймерной РНК.

Каталитической субъединицей праймазы является белок р48, который связывается с онДНК и катализирует образование фосфодиэфирных связей в РНК. Кристаллическая структура этой субъединицы пока не установлена.Однако есть основания полагать, что белок р48 относится к тому же семейству Х нуклеотидилтрансфераз, что и ДНК-полимераза . Гомология последовательностей праймазы р48 и ДНК-полимеразы позволяет предположить, что праймаза имеет конфирмацию кисти руки и содержит в субдомене ладони каталитическую триаду остатков асп₁₀₉, асп₁₁₁ и асп₃₀₆, связывающих Mg²⁺. Таким образом бактериальные и эукариотические праймазы не похожи друг на друга ни по первичной, ни по третичной структуре. Тем не менее, сохранение триад кислых остатков показывает, что молекулярный механизм каталитической стадии у этих двух типов геликаз одинаков и состоит в опосредованной 2 катионами Mg²⁺ нуклеофильной атаке 3'-гидроксила растущего конца РНК на фосфодиэфирную связь в рНТФ, как и в случае ДНК-полимераз и типичных РНК-полимераз.